修 士 学 位 論 文

修 士 学 位 論 文

題 名

誘 電 詠 動 を 用 い たT4フ ァ ー ジ 捕 集 に お け る イ ン ピ ー ダ ン ス 定 量 計 測

指 導 教授 内 田 諭 准 教 授

平 成28年2月18日 提 出

首都大学東京大学院

理 工 学 研 究 科

学 修番 号14882315

氏 名 久 保 田 浩 史

電 気 電 子 工 学 専 攻

学位 論 文 要 旨(修 士(工 学))

論文著者名 久保 田 浩史

論 文題 名:誘 電詠 動 を用 い たT4フ ァー ジ捕 集 にお け るイ ン ピー ダ ンス 定 量 計 測

本 文

近 年 、 多 剤 耐性 菌 の 増 加 に よ る食 中毒 や 院 内感 染 が深 刻 化 して い る。 多 剤 耐 性 菌 とは 、多 くの抗 菌 薬(抗 生 物 質)に 耐 性 を持 つ 細 菌 の こ とで あ る。本 菌 は 、 長 期 間 の薬 剤 使 用 な どを原 因 と して 出現 す る。 これ らは 、抗 生物 質 が 効 か な い た め、 治 療 が 困難 とな る だ け で な く、 抗 生 物 質 に よ る治 療 を受 け続 け る こ とで 体 内 の 常 在 性 細 菌 も減 少 させ る。 た だ し、 現 状 の ま ま、 抗 生 物 質 の 使 用 量 を減 らす と重 症 化 す る恐 れ が あ る。 そ の た め、 根 本 的 に抗 生 物 質 を使 用 しな い新 た な治 療 技 術 の 開発 が必 須 とな っ て い る。

フ ァー ジセ ラ ピー は 、細 菌 へ 特 異 的 に寄 生 す るバ クテ リオ フ ァー ジ を用 い て 標 的 病原 菌 の み を殺 滅 す る方 法 で あ る。 本 手 法 で は 、 常 在 性 細 菌 に影 響 を与 え な い こ とや 病 原 菌 が 存 在 す れ ば 生 体 内 で フ ァー ジ が 自動 的 に増 殖 す る とい っ た 長 所 が あ る。 実 際 、MRSA(メ チ シ リン耐 性 黄 色 ブ ドウ球 菌)感 染 症 や 皮 膚 病 の処 置 に用 い られ て い る。 た だ し、 商 用 薬 剤 と して使 用 す る た め に は、 当該 フ

ァー ジ を一 定濃 度 以 上 に精 製 濃 縮 す る必 要 が あ る。

そ こで 、著者 は誘 電 泳 動(dielectrophoresis:DEP)法 に着 目 した。DEPと は 、 不 均 一 電 界 中 で物 体 が 分 極 し、電 界 勾 配 に沿 っ て泳 動 す る現 象 で あ る。 これ ま で の研 究 にお い て 、微 生 物 の構 造 に起 因 す る電 気 定数 の 変 化 が精 製 濃 縮 量 に大 き く依 存 す る こ とが定 量 的 に示 され た。

本 研 究 で は 、非 球形 の モ デ ル ウイ ル ス と して複 雑 な外 部構 造 を有 す るT4フ ァ ー ジ ウイ ル ス(以 下、T4フ ァー ジ)を 捕 集 対 象 と した。 捕 集 数 の周 波 数 依 存 性 か らDEPに よ る効 率 的 な捕 集 条 件 の精 査 を以 下 の よ うに行 っ た。顕 微 鏡 を用 い た 蛍 光観 察 に よ る リアル タイ ムで の捕 集 状 況 の確 認(定 性 評 価)、 プ ラー ク法 と 呼 ば れ る培 養 法 に よる 生物 学 的 計 測(定 量 評 価)及 び誘 電 詠 動 イ ン ピー ダ ン ス 計測(DielectrophoreticImpedanceMeasurement:DEPIM)法 に よる迅 速 な 菌密 度 計測(定 量 評価)で あ る。DEPIM法 とは 、細 菌 郡 橋 絡 に よる電 極 間イ ン ピー ダ ンス の 変化 か ら菌密 度 を測 定 す る方 法 で あ る。た だ し、DEPIM法 にお け る菌 捕 捉 時 の電 気 定 数 変 化 は複 雑 で あ る た め、 等 価 回路 に よ る簡 易 モ デ ル を構 築 し、各 周 波 数 で の フ ァー ジ捕 集 数 に対 す る コ ン ダ ク タ ンス 変 化 を数 値 的 に検

度 は1.5×107PFU/ml、 導 電 率 は7pS/cmと した。手 順 と して は 、流 量2.4ml/h で送 液 し、振 幅20Vppの 交流 電圧 を 印加 した。な お 、印加 周 波 数 は10kHz‑1 MHzの 範 囲 で変 化 させ た。

各 評 価 方 法 にお け る捕 集 フ ァー ジ数 に対 す る周 波 数 依 存 性 につ い て 以 下 に述 べ る。蛍 光観 察 で は、電 圧 印加 時 のみ 電 極 間 にお い て捕 集 が確 認 され た 。100kHz

にお け る蛍 光 強度 は 、10kHz、50kHz、500kHz及 び1MHzと 比 較 して 大 き く、捕 集 領 域 全 面 で の 電 極 間 捕 集 が顕 著 とな る こ とが示 され た 。 捕 集 状 況 と し て、下流 域 で の捕 集 数 が増 加 した。流れ に よ りT4フ ァー ジ が 下流 域 ヘ ス ライ ド してお り、T4フ ァー ジへ の誘 電 詠 動 力 は流 体 圧 力 と同程 度 で あ る と推 察 され る。

プ ラー ク法 で は 、100kHzで 捕 集 フ ァー ジ数 が 最 大 とな り、50kHz以 下 及 び 500kHz以 上 で捕集 数 が 著 し く低 下 した 。本 傾 向 は 、Madiyaretal.(2013)の 実 験 結 果 と同様 で あ る。 電 極 部 にお け る濃縮 率 は23.9倍 とな り、一般 的 手 法 と同 程 度 の 濃 縮 性 能 が得 られ た 。DEPIM法 で も、100kHzに お い て 最 大 の コ ンダ ク タ ンス 増加 が 確認 され 、50kHz及 び500k且zで は増加 量 の 低 下 が 見 られ た。

10kHz及 び1MHzで は、 捕 集 数 が非 常 に少 なか った た め、 コ ンダ ク タ ンス の 変化 を確 認 で き なか った 。蛍 光 画 像 か ら得 られ た捕 集 配 置 と培 養 法及 びDEPIM 法 に よ る捕 集 総数 の 評価 か ら、T4フ ァー ジ は低周 波数 域 に捕 集 ピー クが 存在 す

る と言 え る。 ま た 、 複 雑 な形 状 及 び 構 造 を 有 して い る た め 、 高 周 波 数 域 で誘 電 泳 動 力 が 強 く作 用 す る球 状 ウイ ル ス と異 な る捕 集 特性 を示 した と考 え られ る。

等 価 回 路 モ デ ル に よ る解 析 結 果 は 以 下 の 通 りで あ る。 菌 体 の 導 電 率 を0.32 S/m、 媒 質 の導 電 率 を0.1mS/mと し、 周 波数 を10kHz‑10MHz、 捕 集 数 を 103‑1010個 に変 化 させ た。各 周 波 数 にお い て 、低 捕集 数 で は コ ンダ ク タ ンス が 10μS付 近 で 一 定 で あ るが107個 を境(分 岐点)に10kHzで は減 少 し、そ の他 周 波 数 で は一 度 増 加 した後 に低 下 した。 周 波 数 と とも に コ ンダ ク タ ン ス は増 加 した。 実験 に お い て 、蛍 光観 察及 び プ ラー ク法 で は 、100及 び500kHzの 捕 集 数 の差 が顕 著 で あ っ た が 、DEPIM法 で は微 小 だ っ た。原 因 と して 、電極 の保 護 膜 が キ ャパ シ タ と して 働 く こ とで 、 周 波 数 が 高 い ほ ど電 極 間 コ ン ダ ク タ ン ス が 増 加 しや す い こ とが考 え られ る。 ま た 、媒 質 の導 電 率 を1か ら10mS/mへ と増 加 させ る と、 分 岐 点及 び 最 大 値 は 高捕 集 数 側 ヘ シ フ トした。 更 に、 低 捕 集 数 時 の コ ン ダ ク タ ンス は 、低 周 波 数 域 で は減 少 し、高周 波数 域 で は 増加 した 。一 方 、 菌 体 の導 電 率 を変 化 させ る と低 捕 集 数 側 で は変 化 が な か っ た。 高捕 集 数 側 で は 、 導 電 率 の増 加 に伴 い 、 分 岐 点 及 び最 大 値 が 低 捕 集 数 側 ヘ シ フ トし、 媒 質 の導 電 率 変化 とは逆 の特 性 が 確 認 され た。

以 上 よ り、DEPに よ るT4フ ァ ー ジ の 捕 集 す る効 率 的 条 件 の 精 査 を 行 い 、 低 周 波 数 域 に捕 集 ピー ク が あ る こ とを 明 らか に した。 ま た 、 等 価 回 路 の 簡 易 モ デ ル を用 い て 、DEPIM法 の定 量 評 価 に 向 け た基 礎 検 証 が で き た。

今 後 、 電 極 部 の 改 善 に よ る捕 集 量 の増 大 を図 る こ とで 医 療 へ 実 応 用 が期 待 さ

目 次

第1章 序 論

1.1研 究 背 景..

L2現 行 の ウ イ ル ス 濃 縮 法.

1.3現 行 の 微 生 物 検 出 法 1.3.1培 養 法.

1.3,2ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 法..

1.4誘 電 泳 動 法

1.4.1誘 電 泳 動 を 用 い た 微 生 物 研 究 1.42誘 電 詠 動 イ ン ピ ー ダ ン ス 計 測 法....

1.5ウ イ ル ス を 対 象 と し た 誘 電 泳 動 に お け る 関 連 研 究 1.6研 究 目 的,

1.7本 論 文 の 構 成.

11677899013411⊥‑⊥‑⊥

第2章 2.1 2.2 2.3

実 験 原 理 誘 電 泳 動..

誘 電 泳 動 イ ン ピ ー ダ ン ス 計 測 法 蛍 光 染 色 法

2.3.1蛍 光 分 光...

2.3.2DAPI染 色,

﹁brOO3りOrO112222

第3章 実 験 装 置 及 び 手 法 3.1実 験 装 置,

3.2誘 電 泳 動 デ バ イ ス...

3.2.1誘 電 泳 動 デ バ イ ス 概 要.

3.22実 験 に 用 い た 誘 電 詠 動 デ バ イ ス 3.3捕 集 対 象:T4フ ァ ー ジ...

3,4T4フ ァ ー ジ 実 験 液 の 作 成 3.4.1菌 懸 濁 液 の 調 整...

3.5T4フ ァ ー ジ 実 験 液 の 導 電 率 の 調 整 3.5.1限 外 ろ 過 法

3.5.2限 外 ろ 過 のi操 作 手 順

66881344556722223333333

3.7実 験 手 法.

3.7,1T4フ ァ ー ジ に お け る 誘 電 泳 動 捕 集 及 び 計 測 3.7.2T4フ ァ ー ジ 以 外 の 誘 電 泳 動 捕 集 及 び 計 測...

3.8評 価 方 法...。...。...

3.8,1蛍 光 画 像 解 析 に よ る 捕 集 数 の 定 性 評 価 3.8.2プ ラ ー ク 法 に よ る 定 量 評 価....,.,..

3.8.3誘 電 泳 動 イ ン ピ ー ダ ン ス 計 測 法 に よ る 定 量 評 価

OUOゾ01⊥‑⊥n∠4り034凶44/τ凶4

第4章T4フ ァ ー ジ の 捕 集 に 関 す る 検 討 4,1T4フ ァ ー ジ 捕 集 量 の 周 波 数 依 存 性

4.1.1蛍 光 画 像 に よ る 捕 集 状 況 の 確 認...

4.1.2プ ラ ー ク 法 に お け る 捕 集T4フ ァ ー ジ の 生 物 学 的 計 測 4.2最 大 捕 集 時 の 濃 縮 率

4.3T4フ ァ ー ジ の 効 率 的 な 捕 集 条 件 の 検 討...,..

4.3.1電 極 間 隔 依 存 性.

4.3.2送 液 流 量 依 存 性...

4.4本 章 の ま と め

555145581444555556

第5章 誘 電 泳 動 イ ン ピ ー ダ ン ス 計 測 法 に よ る 定 量 評 価 5.1分 圧 回 路...

5.1,1回 路 作 成,...。.,....

5.12大 腸 菌 及 び 酵 母 を 用 い た 性 能 評 価.

5.2DEPIMに よ るT4フ ァ ー ジ 検 出 及 び 定 量 評 価 5.2.1セ ン ト リ プ レ ッ プ を 用 い た 導 電 率 調 整 法 5.2,2T4フ ァ ー ジ 検 出 及 び 定 量 評 価...

5.3等 価 回 路 に よ る コ ン ダ ク タ ン ス 数 値 解 析 5.3.1

5.3.2 5.3.3 5.3.4

解 析 モ デ ル

T4フ ァ ー ジ の 周 波 数 依 存 性,..

測 定 値 と の 比 較...

媒 質 及 び フ ァ ー ジ の 導 電 率 依 存 性 5.4本 章 の ま と め

22258892247816666666777778

第6章 6,1 6.2

総論 結論.

今後 の展望

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第1章 序 論

1.1研 究 背 景

抗 生 物 質 と は 、 病 原 菌 の 細 胞 膜 等 へ 直 接 作 用 し細 菌 の 代 謝 や 発 育 阻 害 す る微 生 物 由 来 の 薬 剤 で あ る 。 医 師 フ レ ミ ン グ(ArexanderFleming、1881‑1955)が 偶 然 に ア オ カ ビ か らペ ニ シ リ ン を 発 見 し 、 そ の 治 療 効 果 を 確 認 した(1941年)。 以 後 、 約4000種 の 抗 生 物 質 が 発 見 さ れ 、 そ の う ち 約300種 は 医 薬 品 と し て 使 用 さ れ て い

る 。 抗 生 物 質 の 開 発 は 、 感 染 症 被 害 を 激 減 させ た が 、 様 々 な 病 原 体 の 薬 剤 耐 性 化 を 引 き起 こす 原 因 と も な っ て い る 。

メ チ シ リ ン耐 性 黄 色 ブ ドウ球 菌(MethicillinResistantStaphylococczLsAzLreiLs=

MRSA)や バ ン コ マ イ シ ン耐 性 腸 球 菌(VancomycinResistantEnterococci:VRE)

な ど に 代 表 さ れ る 薬 剤 耐 性 菌 は 、 抗 菌 薬(抗 生 物 質)に 耐 性 を 獲 得 した 細 菌 の こ と で あ る 。 特 定 薬 剤 の 長 期 間 投 与 を 原 因 と して 出 現 す る(図1.1参 照[1])。 これ ら は 、 抗 生 物 質 に よ る 治 療 を 困 難 と す る だ け で は な く、 抗 生 物 質 に よ る 治 療 を 受 け 続 け る こ とで 体 内 の 常 在 性 細 菌 を 減 少 さ せ る 。 世 界 各 国 で 食 中 毒 や 院 内 感 染 症 を 引 き起 こ す な ど、 深 刻 な 問 題 と な っ て い る 。 米 国 で の 耐 性 菌 の 年 間 推 定 患 者 数 と 死 亡 者 数 を 表1.1に 示 す[1]。 毎 年200万 人 以 上 の 人 々 が 感 染 症 に か か り、 そ の う ち2万3千 人 が 死 亡 す る と い う 推 定 結 果 と な っ て い る 。 た だ し、 抗 菌 薬 の 急 な 使 用 停 止 は 難 し く、 現 状 の ま ま 、 抗 生 物 質 の 使 用 量 を 減 らす と 重 症 化 す る 恐 れ が あ る。 そ こ で 米 国 感 染 症 学 会(lnfectiousDiseasesSocietyofAmerica:IDSA)は 「耐 性 菌 に 立 ち 向 か う た め に 重 要 な4つ の 手 段 」 と して 、1.感 染 症 の 予 防 と耐 性 菌 の 拡 散 防 止 、2.耐 性 菌 の 調 査 、3.抗 菌 薬 の 適 正 使 用 、4.新 薬 の 開 発 、 の 検 討 項 目 を 示 し た[2]。 ま た 、 日 本 で 最 も 多 い 食 中 毒 菌 は カ ン ピ ロ バ ク タ ー(Campylobacter) で あ り、 主 に 学 校 給 食 や 飲 料 水 が 原 因 で 集 団 食 中 毒 を 引 き起 こ す[3]。 カ ン ピ ロ バ

ク タ ー の ニ ュ ー キ ノ ロ ン 系 薬 剤 に 対 す る耐 性 菌 の 増 加 が 世 界 的 な 問 題 とな っ て い る[4]一[7]。菌 の 耐 性 化 は 、 発 達 の 過 程 で 自然 に起 こ り止 め る こ と は 困 難 で あ る。 そ の た め 、 対 抗 手 段 と し て 、 根 本 的 に 抗 生 物 質 を使 用 しな い 新 た な 治 療 技 術 の 開 発 及 び 迅 速 な 細 菌 の 検 査 ・検 出 が 急 務 と な っ て い る 。

近 年 の 多 剤 耐 性 菌 の 増 加 に よ る 院 内 感 染 症 及 び 食 中 毒 の 深 刻 化 よ り抗 菌 化 学 療 法 の 限 界 が 露 呈 さ れ 、 抗 菌 薬 を 必 要 と しな い フ ァ ー ジ の 医 療 応 用 へ の 関 心 が 再 度 高 ま っ て い る。 フ ァー ジ セ ラ ピ ー は 、 細 菌 へ 特 異 的 に 寄 生 す る バ ク テ リオ フ ァー ジ を

が あ る。 治 療 対 象 は 、 赤 痢 菌 、 黄 色 ブ ド ウ球 菌 、 大 腸 菌 な ど の 特 定 細 菌 や 、 下 痢 、 肺 炎 、 火 傷 後 の 細 菌 感 染 症 な ど が 挙 げ られ る 。 投 与 方 法 と して は、 経 口 、 経 皮 、 ミ ス トス プ レー や 点 眼 薬 が 報 告 され て お り、 イ ギ リス の ノ ボ リ テ ィ ク ス 社 で は ク リー ム 状 の 薬 品 を 研 究 し て い る 。 実 際 、MRSA感 染 症 に 用 い られ て お り[8]東 欧 で の 皮 膚 病 治 療 へ の 応 用 は 一 般 化 して い る 。 米 国 に お い て は 、 米 国 食 品 医 薬 品 局(Food andDrugAdministration:FDA)が 食 肉 の リス テ リア 菌 の 防 除 法 と して フ ァー ジ の 使 用 を 認 可 し、 一 部 食 品 へ の保 存 薬 と して 用 い られ て い る 。 ま た 、 フ ァ ー ジ セ ラ ピ ー は 、 ヒ ト以 外 に 牛 乳 房 炎 な ど の 家 畜 感 染 症 へ の 研 究 も され て い る[9]。

更 に 、バ ク テ リオ フ ァー ジ は、治 療 技 術 だ け で は な く細 菌 検 出 に も 利 用 され る 。バ ク テ リ オ フ ァー ジ を 用 い た 細 菌 検 出 法 へ の 応 用 に つ い て 述 べ る。 バ ク テ リ オ フ ァー ジ は 核 酸 と 外 殻 タ ン パ ク 質 か ら構 成 さ れ 、 構 造 タ ン パ ク 質 が 細 菌 種 特 異 的 吸 着 能 を 持 つ 。 こ の 感 染 特 異 性 を 利 用 す る と 、 細 菌 を 簡 便 に検 出 す る こ と が 出 来 る 。 染 色 した フ ァ ー ジ を検 出 対 象 の 細 菌 に感 染 さ せ 、 可 視 化 し た 菌 体 を 蛍 光 顕 微 鏡 で 識 別 す る こ とで 迅 速 な 検 出 が で き る[11]。 サ ル モ ネ ラ や リ ス テ リア な どの 食 中 毒 菌 の 検 出 も 可 能 で あ る。 検 出 対 象 の 細 菌 に 特 異 的 に 感 染 す る フ ァ ー ジ が 入 手 で きれ ば 、 極 め て 汎 用 性 が 高 い 手 法 と言 え る 。 蛍 光 タ ン パ ク 質 の 遺 伝 子 を フ ァ ー ジ ゲ ノ ム に

組 み 入 れ る こ とで 、 宿 主 内 で 発 現 し た 蛍 光 タ ン パ ク質 を 蛍 光 顕 微 鏡 で 検 出 す る 方 法 も提 案 さ れ て い る[12]。 最 近 で は 、 迅 速 ・高 感 度 検 出 法 と して 、 ポ リメ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応(PolymeraseChainReaction:PCR)法 が あ る が 、 操 作 に 高 度 な 専 門 知 識 を 有 す る こ と や 高 額 な 機 械 が 必 要 な ど の コ ス トの 問 題 か ら一 般 検 査 で は 不 向 き で あ る 。 病 原 細 菌 の 耐 性 化 が 進 行 し て い る 中 、 感 染 管 理 に お け る 迅 速 な 細 菌 種 同 定 は 患 者 の 早 期 治 療 や 救 命 に 繋 が り、 特 に 感 染 拡 大 の 防 止 に 大 き く貢 献 す る 。

バ ク テ リオ フ ァー ジ に お け る 他 の代 表 的 な 応 用 に 、 抗 体 を 作 成 す る フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ(フ ァ ー ジ 掲 示 法)が あ る。 バ ク テ リオ フ ァ ー ジ の 遺 伝 子 に は殻 タ ン パ ク 質 を コ ー ドす る 遺 伝 子 が 含 ま れ て い る 。 こ の 遺 伝 子 を 利 用 し、 発 現 させ た い 外 来 遺 伝 子 を 融 合 させ 、 フ ァー ジ が 複 製 さ れ る と き に 一 緒 に 発 現 させ る(掲 示 す る) 方 法 が フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ で あ る。 融 合 タ ン パ ク質 は 、 フ ァ ー ジ表 面 に存 在 す る た め 、 様 々 な 分 子 と 相 互 作 用 が 可 能 で あ る 。 掲 示 した フ ァ ー ジ を調 整 し、 そ の 集 合 を ラ イ ブ ラ リー 化 した も の を フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リー と 呼 び 、 フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リー の 作 成 と 目 的 抗 体 の 選 択 を 繰 り返 す こ とで 、 抗 体 の 作 成 だ け で は な く、 機 能 の 向 上 が 可 能 とな る 。腸 症 組 織 の 血 管 抗 体 の 作 成 な ど に 利 用 さ れ て い る[10]。 上 記 以 外 に 、 研 究 段 階 で は 、 実 際 、 廃 水 に 対 す る 水 処 理 性 能 の 評 価 や チ ー ズ の 熟 成 促 進 な ど が 報 告 さ れ て い る 。

上 記 に 示 し た よ う に 、 薬 剤 耐 性 菌 の 増 加 に伴 う 医療 現 場 の 大 き な 障 害 に対 し、 治 療 薬 及 び 検 出 法 と し て バ ク テ リオ フ ァ ー ジ の 利 用 は 有 益 で あ る 。 ま た 、 フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ を 代 表 と す る他 の 応 用 も 期 待 さ れ る な ど、 多 くの 研 究 が さ れ て い る こ と か らも バ ク テ リオ フ ァ ー ジ へ の 関 心 が 高 ま っ て い る こ と が わ か る 。 た だ し、 商 用 薬 剤 及 び フ ァ ー ジ 応 用 と し て 使 用 す る た め に は 当 該 フ ァ ー ジ を 一 定 濃 度 以 上 に 精 製 濃 縮 す る 必 要 が あ る。 現 行 の ウ イ ル ス の 濃 縮 方 法 と し て 、 ゲ ル ろ 過 に よ り低

分 子 の 有 機 物 を 除 去 す る 方 法[13]、 ポ リエ チ レ ン グ リ コ ー ル お よ び タ ン パ ク 質 凝 集 を 組 み 合 わ せ る 方 法[14]、 セ ル ロ ー ス 吸 着 法 、 磁 気 ビ ー ズ や 特 別 な 試 薬 を 用 い る 方 法 な ど が あ る。 上 記 の 手 法 で は 、 操 作 が 煩 雑 で あ る こ とや 高 価 で あ る こ とか ら、

迅 速 、 簡 便 か つ 安 価 な 精 製 濃 縮 方 法 が 必 要 と さ れ て い る 。

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図1.1抗 菌 薬 の 開 発 と 耐 性 菌 の 出 現(文 献 国 を 元 に 作 成)

表1.1:米 国 に お け る各 種 耐 性 菌 の 年 間 推 定 患 者 数 と死 亡 者 数(文 献[1]を 元 に作 成)

耐性菌 推定患者数 推定死亡者数

MRSA 80,000 11,000

耐性肺炎球菌 ^{1,200,000 7,000}

ESBL産 生 菌 26,000 1,700

VRE 20,000 1,300

カルバペネム耐性腸 内細菌 9,300 610 多 剤 耐 性 ア シ ネ トバ ク タ ー 7,300 500

多剤耐性緑膿 菌MDRP 6,700 440

1.2現 行 の ウ イ ル ス 濃 縮 法

現 在 使 用 され て い る ウ イ ル ス 濃 縮 法 は 、 前 述 し た よ う に い く つ か あ る が 、 こ こ で は 膜 を 用 い た 方 法 、 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 沈 殿 法 及 び 試 薬 を 用 い た 濃 縮 法 に つ い て 述 べ る 。

1969年 にWallisetα1.に よ っ て 陽 イ オ ン添 加 と組 み 合 わ せ た 陰 電 荷 膜 法 が 開 発 さ れ た 。 静 電 的 に 膜 に ウ イ ル ス を 吸 着 さ せ 、 誘 出 液 を 用 い て 、 膜 か ら は く離 さ せ て 回 収 す る 方 法 で あ る 。 ウ イ ル ス 粒 子 は 中 性 域 で は マ イ ナ ス に 帯 電 して い る こ と が 多 い た め 、 陽 イ オ ン存 在 下 ま た はpH5以 下 で 陰 電 荷 膜 に よ く吸 着 す る 。 一 方 、 タ ン パ ク 質 系 の 有 機 物 が 多 い 場 合 に は あ ま り吸 着 し な い とい う性 質 が あ る 。 こ の 現 象 を利 用 し、 膜 に ウ イ ル ス を 吸 着 さ せ る 。 そ の 後 、 弱 ア ル カ リ性(pH9.5以 下) の タ ン パ ク質 系 の 有 機 物 を 含 む 溶 液 も し く は 強 い ア ル カ リ(pH11.5)に よ り吸 着 を 阻 害 して ウ イ ル ス を 膜 か ら は く離 して 回 収 す る 。 誘 出 液 と して ビ ー フ エ キ ス 溶 液 を 用 い る 。 陰 電 荷 膜 法 と 同 様 に膜 を 利 用 した 方 法 と して 、 陽 電 荷 膜 法 な ど も 存 在 す る.

ポ リエ チ レ ン グ リ コ ー ル 沈 殿 法 は 、 親 水 性 の ポ リエ ー テ ル で あ る ポ リエ チ レ ン グ リ コ ー ル(PEG)を 利 用 し、 ウ イ ル ス を 沈 殿 させ る手 法 で あ る 。 試 料 に ポ リエ チ レ ン グ リ コ ー ル とNaClを 添 加 し、 遠 心 分 離 を 行 複 数 回 行 い 上 澄 み を 取 る 。 こ の 作 業 繰 り返 し濃 縮 を 行 う。 本 法 は 、 操 作 が 煩 雑 で あ る こ と や ウ イ ル ス に他 の 物 質

を 添 加 す る た め 、 少 な か らず ウ イ ル ス が 影 響 を受 け て し ま う。

ま た 、 レ ン チ ウ イ ル ス な ど の 一 部 ウ イ ル ス を対 象 と し た ウ イ ル ス 濃 縮 法 に試 薬 を 用 い る 方 法 が あ る 。 簡 単 に濃 縮 が 可 能 で あ る が 、 大 量 濃 縮 を 行 う と き に コ ス ト が 高 く な る こ とや ウ イ ル ス の 精 製 に は 不 向 き で あ る 。

1.3現 行 の 微 生 物 検 出 法

現 在 使 用 さ れ て い る 代 表 的 な 微 生 物 の 検 出 法 と して 、 公 定 法 で あ る 培 養 法 や 迅 速 法 で あ る ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 法 が あ る 。 本 節 で は 、 各 検 出 法 の 概 要 に つ い て 述 べ る 。

1.3.1培 養 法

培 養 法 と は 、 微 生 物 の 生 育 に 必 要 な 栄 養 素 を 含 有 し た 培 地 上 で 、 微 生 物 の サ ン プ ル を 培 養 増 殖 させ る こ と で 細 菌 を 検 出 す る 手 法 で あ る 。 培 地 に 添 加 さ れ た 細 菌 は 一 般 的 に 、 室 温 一体 温 の 生 育 環 境 化 下 に お い て1日 一 数 日 培 養 さ れ る 。 培 養 後 、 液 体 培 地 で は 混 濁 が 、 平 板 培 地(寒 天 培 地)で は集 落(コ ロ ニ ー)が 形 成 さ れ 肉 眼 に よ る 確 認 が 可 能 と な る 。 コ ロ ニ ー(colony)は 、1つ 以 上 の 細 菌 か ら 形 成 さ れ 、 単 位 は(ColonyFormingUnits:CFU)で 示 さ れ る 。

細 菌 検 査 に 用 い られ る培 養 法 に は 、 混 釈 培 養 法 と平 板 塗 布 培 養 法 が あ る 。 混 釈 培 養 法 は 保 温 し た 液 体 培 地 と細 菌 試 料 を 混 合 し培 地 中 で 増 菌 す る 方 法 で あ り、 平 板 塗 布 培 養 法 は 固 形 の 平 板 培 地 上 に 細 菌 試 料 を 少 量 塗 布 し増 菌 す る 方 法 で あ る 。 前 者 は 、 試 料 中 の 細 菌 が 熱 の 影 響 を 受 け る 可 能 性 が あ る が 、 低 濃 度 か ら菌 の 検 出 が 可 能 と な る 。 一 方 、 後 者 は 、 接 種 試 料 量 が 少 な い た め 、 検 出 限 界 は100cfu/9と な る が 、 形 成 さ れ た コ ロ ニ ー の 詳 細 な 観 察 が 可 能 と な る 。 ま た 、 培 地 の 成 分 調 整 や 他 の 微 生 物 が 生 育 で き な い よ う な 環 境 の 作 成 を す る こ とで 、 目 的 の 細 菌 を 選 択 的 に 培 養 す る 方 法 も あ る 。 増 菌 培 養 と 選 択 培 養 を 繰 り返 す こ と で 細 菌 の 同 定 や 定 量 化 が 可 能 と な る 。

本 手 法 で は 、 標 的 細 菌 の 有 無 の 確 認 及 び 形 成 さ れ た コ ロ ニ ー 数 と 希 釈 倍 率 か ら 試 料 の 菌 濃 度 の 算 出 が 可 能 と な る 。 食 品 検 査 の 公 定 法 と して 、 古 くか ら使 用 さ れ

て い る が 、 コ ロ ニ ー 形 成 に 要 す る 時 間 は長 く検 出 の 迅 速 性 に 欠 け る 。

大腸菌、

廟 膨 ゆ

コ ロ.ニ ー

図1.2:平 板 培 養 法[15]

1.3.2ポ リメ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 法

ポ リメ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応(PolymeraseChainReaction:PCR)法 は 、 極 微 少 の デ オ キ シ リ ボ 核 酸(deoxyribonucleicacid:DNA)か ら、 酵 素 反 応 を 利 用 し て 特 定 の 塩 基 配 列 を持 つDNA断 片 を 迅 速 に 増 幅 す る 手 法 で あ る 。 本 手 法 は 、1986年 、Kzry MullisetαLに よ って 開 発 さ れ[16]、1993年 に ノ ー ベ ル 化 学 賞 の 受 賞 対 象 と な っ て

い る。 遺 伝 子 の 単 離 、 構 造 解 析 、 発 現 解 析 な ど の 遺 伝 子 操 作 が 可 能 で あ り、 食 中 毒 菌 の 検 出 や 臨 床 検 査 に お け る細 菌 検 査 で も 重 要 視 さ れ て い る。 ウ イ ル ス 感 染 症 の 検 査 で はPCR法 が 規 定 さ れ て い る[17]。 幅 広 い 分 野 で 応 用 さ れ て お り、 国 内 で も 、2000年 ま で に約1800件 の 特 許 が 出 願 さ れ た 。

DNAの 二 重 らせ ん構 造 に は 、 周 りの 環 境 に よ り構 造 が 変 化 す る と い う性 質 が あ る 。 そ の 中 に 、 高 温 に な る と鎖 が 解 離 し、 独 立 した1本 鎖DNAに な る とい う も の が あ る 。PCR法 の 原 理 は こ の 性 質 を 利 用 し て い る 。

DNA増 幅 の 手 順 は 、DNAの 熱 変 性 、 プ ラ イ マ ー の 結 合 反 応 及 びDNAポ リ メ ラ ー ゼ に よ る伸 長 反 応 の3ス テ ッ プ で 行 わ れ 、 繰 り返 す こ とで 増 幅 を す る(図1.3 参 照)。

初 め に 、 二 本 鎖DNAを 一 本 鎖DNAに 解 離 す る。94℃ で 二 本 鎖DNAの 水 素 結 合 が 切 れ 一 本 鎖DNAに な る。 次 に 、 温 度 を55℃ ま で 冷 却 す る こ と で 相 補 的 な 力 が 働 き、 プ ラ イ マ ー と 呼 ば れ るDNA合 成 に 必 要 な 短 いDNA断 片(20〜30塩 基 程 度)と 再 結 合 し ま す(ア ニ ー リ ン グ)。 最 後 に 、72℃ に 加 熱 す る と、DNAポ リ メ ラ ー ゼ が 活 性 化 し、 プ ラ イ マ ー を 起 点 にDNA合 成 が 行 わ れ 、DNAの 二 本 鎖 が 合 成 さ れ る。DNAポ リ メ ラ ー ゼ に は プ ラ イ マ ー を 集 め て 繋 い で い く役 割 が あ る。

こ れ ら の3ス テ ッ プ を1回 行 う こ とで2倍 に 増 幅 さ れ る 。 よ っ て 、n回 行 う こ と で2n倍 と な り、 指 数 関 数 的 に 増 幅 さ れ る 。 増 幅 さ れ たDNAに 対 し電 気 泳 動 速 度 計 測 を 行 う こ と で 、 そ の 差 か ら、DNAの 同 定 が 出 来 る 。PCR法 は 非 常 に 高 感 度 な 検 出 方 法 で あ る が 、 操 作 に は 高 度 な 専 門 知 識 が 必 要 で あ る 。 ま た 、 他 のDNAの 混 入 を 防 止 す る に は 、PCR分 析 用 実 験 室 の 確 保 及 び 専 用 機 材 の 常 備 が 必 要 で あ る た め 、 計 測 コ ス トが か か る 。

mT㎜ 一『㎜ ∴ 』 賦 幕7皿[T『

2本 鎖DNA熱 変性 伸長反応2本 鎖DNA合 成

図13:PCR法 の 原 理

1.4誘 電 泳 動 法

ウ イ ル ス 濃 縮 法 及 び 培 養 法 やPCR方 な ど の微 生 物 検 出 に 関 す る、手 順 の 煩 雑 さ 及 び 高 コ ス トな ど の 課 題 に 対 し,電 気 計 測 法 の 一 つ で あ る 誘 電 泳 動(Dielectrophore‑

sis:DEP)法 は 、 高 速 性 と簡 便 性 を 兼 ね 備 え た 有 力 な 手 法 で あ る 。 誘 電 特 性 の 違 い に よ る 濃 縮 、 菌 種 分 離 や 生 死 菌 判 定 に 利 用 さ れ て い る。 微 小 電 極 を 用 い る こ と で 、 マ イ ク ロ ス ケ ー ル で の 測 定 が 可 能 に な る。

1.4.1誘 電 泳 動 を 用 い た 微 生 物 研 究

DEP法 の 特 徴 は 、 捕 集 対 象 及 び 溶 液(媒 質)の 電 気 特 性 を 利 用 し、 捕 集 及 び 分 離 な どの 電 気 動 作 を制 御 す る こ とで あ る 。DEPの 原 理 に つ い て は次 章 で 説 明 す る 。

誘 電 泳 動 は 、1951年 にH.A.Pohlに よ っ て 命 名 され た が 、PohlはDEP法 の 基 礎 検 証 と し て 細 胞 周 期 に差 が あ る酵 母(S.cerevisiae)の 周 波 数 特 性 を 調 査 して い る [19]。鷲 津 ら は 誘 電 泳 動 に よ る 生 体 分 子 ハ ン ド リ ン グ技 術 へ の 応 用 と して 、DEPを 用 い てDNAや タ ン パ ク 質 を 直 接 動 作 で き る こ と を示 し た[20]。 ま た 、 鈴 木 ら は 、 微 生 物 に 作 用 す るDEP力 の 差 を 利 用 して 、 大 腸 菌 の 生 死 菌 の 分 離 を 行 っ た[21]。

近 年 で は 、 毒 物 検 出 の に誘 電 泳 動 を 用 い た 例 も あ る 。Chiouら は 、 誘 電 泳 動 で 細 胞 を濃 縮 後 、 亜 ヒ酸 に よ り流 出 した 細 胞 内 の タ ン パ ク 質 を検 出 す る こ とで 、 亜 ヒ 酸 の 濃 度 の 測 定 を 行 っ て い る[22]。 さ ら に 、 中 野 らは ノ ロ キ ャ プ シ ドの 検 出 に 成 功

し、 ウ イ ル ス の 検 出 が 可 能 で あ る こ と を示 唆 した[23]。 当 研 究 室 で は 、 誘 電 泳 動 速 度 か ら代 謝 を 評 価 す る 研 究 も 行 っ て い る[24]。

以 上 に 示 し た 通 り、DEP法 に よ る微 生 物 の 捕 集 及 び 分 離 な ど の 制 御 技 術 、 細 菌 検 出 及 び 計 測 は 各 研 究 者 に よ っ て 研 究 さ れ て い る。

1.4.2誘 電 詠 動 イ ン ピ ー ダ ン ス 計 測 法

誘 電 泳 動 イ ン ピ ー ダ ン ス 計 測 法 は 、 微 小 電 極 を 用 い て 、 細 菌 群 橋 絡 に よ る電 極 間 イ ン ピ ー ダ ン ス(ま た は 、 コ ン ダ ク タ ン ス)の 変 化 を測 定 す る こ と で 、 菌 密 度 の 計 測 す る 手 法 で あ る 。 末 廣 ら に よ っ て 、DielectroplloreticImpedanceMeasure‑

ment(DEPIM)と 命 名 さ れ 手 法 で あ り、 本 手 法 を 用 い て 、 迅 速 か つ 高 感 度 な 微 生 物 の 濃 度 測 定 に 関 す る 諸 検 証 が 行 わ れ て い る[25]一[27]。

本 手 法 で は 、 微 生 物 懸 濁 液 を マ イ ク ロ フ ィ ル タ 電 極 ヘ ポ ン プ を 用 い て 送 液 し電 極 上 にDEP力 に よ り捕 集 す る 。 捕 集 状 態 は 流 体 作 用 に 大 き く影 響 を 受 け る た め 、 菌 固 体 の 誘 電 特 性 を 計 測 す る と い う点 で は 精 度 が 低 下 す る 。 し か し な が ら、 微 生 物 の 捕 集 量 よ り瞬 時 的 に変 動 す る コ ン ダ ク タ ン ス 変 化 量(△G)を リ ア ル タ イ ム で 測 定 す る こ と が で き、 更 に 、 顕 微 鏡 に よ る 観 察 手 法 を 組 み 合 わ せ る こ と で よ り詳 細 な 菌 体 状 態 を 観 察 す る こ とが で き る。 ま た 、DEPIMは ポ ン プ を用 い て 送 液 して い る た め 、 電 圧 印 加 を 停 止 す る こ と で 、 実 験 後 に 、 捕 集 し た 微 生 物 を 回 収 す る こ

と が で き 、 そ の 後 の 定 性 分 析 に よ っ て 菌 種 の 特 定 が で き る。

本 手 法 を 用 い る こ と で 、 迅 速 な 濃 縮 検 出 及 び 濃 縮 量 の 定 量 化 が 可 能 と な る 。 DEPIMの 詳 細 な 原 理 に つ い て は次 章 で 説 明 す る 。

1.5ウ イ ル ス を対 象 と した 誘 電 泳 動 に お け る関 連 研 究

誘 電 泳 動 を 用 い た ウ イ ル ス 操 作 の 研 究 は 、 様 々 な ウ イ ル ス を 対 象 と し て 行 わ れ て い る 。

Irinaetα1.は 、DEPに よ り、 サ サ ゲ モ ザ イ ク ウ イ ル ス と タ バ コ モ ザ イ ク ウ イ ル ス を 捕 集 す る と と も に 、 捕 集 時 の 周 波 数 依 存 性 を 調 査 し て い る[28]。DEP効 果 に よ り電 極 端 に サ サ ゲ モ ザ イ ク ウ イ ル ス が 捕 集 さ れ て い る こ と が わ か る(図1.4、 白 点 が サ サ ゲ モ ザ イ ク ウ イ ル ス)。

イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス な ど の 毒 性 の 高 い ウ イ ル ス も制 御 対 象 とな っ て お り、 医 学 の 発 展 へ の 貢 献 も 期 待 さ れ て い る。 丸 山 ら は 、 特 定 細 胞 に 単 一 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス を 感 染 させ る た め の 濃 縮 処 理 と して 、DEPを 用 い て い る[29]。DEPに よ りイ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス が 濃 縮 さ れ て い る 様 子 を、 図L5(赤 点 が イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス)に 示 す 。

試 薬 を 用 い ず 菌 体 を殺 菌 す る 新 た な 手 法 と し て 、 ワ ク シ ニ ア ウ イ ル ス を誘 電 泳 動 で 捕 集 後 、 高 電 界 に よ り溶 菌 す る と い う研 究 報 告 も あ る[30]。 図1.6が ワ ク シ ニ ア ウ イ ル ス の 捕 集 及 び 溶 菌 の 様 子 で あ る。 左 図 が 捕 集 の み 、 右 図 が 捕 集 及 び 溶 菌 を 同 時 に 行 っ た 例 で あ る。 青 が ウ イ ル ス 外 膜 の タ ン パ ク質 、 緑 が ウ イ ル ス 内 部 の DNAを 示 し、 赤 く発 光 して い る 部 分 は溶 菌 に よ りむ き 出 し に な っ たDNAを 示 す 。

以 上 か ら 、 誘 電 泳 動 の 制 御 対 象 と し て 、 ウ イ ル ス へ の 関 心 は 非 常 に 高 ま っ て い る と 言 え る 。

F董eMon

1『‑1 Il

       ざ

く ・ 縛 糊

溜

図1,4:誘 電 泳 動 に よ る サ サ ゲ モ ザ イ ク ウ イ ル ス の 捕 集[28]

図1.5:

左 図=濃 縮 前,右 図

鴨.

︑ひ胴餐1

̀・﹄︑

̀唾

蝶 』隊

撫

「 で

'舗

ご姑

「辱

̀幟 .

、嵩 卜 .

・㌧㌔

塾㌔:、

篶タド

誘 電 泳 動 に よ る イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス の 濃 縮[29]

:濃 縮 後

A 10mm

AI

Orrn 20μm

A 30mln

A' 27rrn

●

, 4 ℃

㍗

ぴ 4,● ρ

40mm

A

「

辱

A' 55mr

の

一}一 .

図1.6:ワ ク シ ニ ア ウ イ ル ス の 捕 集 と 溶 菌

1.6研 究 目 的

前 節 ま で に示 した 背 景 か ら、 フ ァー ジ の精 製 濃 縮 に お い て 、著 者 は 誘 電 泳 動 法 の 利 用 に 着 目 し た 。DEPは 、 薬 品 を 用 い ず 粒 子 を 選 択 的 に 操 作 可 能 で あ る た め 、 同 じ試 料 か ら複 数 の ウ イ ル ス を段 階 的 に精 製 す る こ と も 可 能 で あ る。 本 研 究 グ ル ー プ で は 、 液 中 微 生 物 の 選 択 的 捕 集 及 び 濃 縮 に つ い て 検 討 し き た 。 結 果 と し て 、 微 生 物 の 構 造 に起 因 す る電 気 定 数 変 化 が 精 製 濃 縮 に 大 き く影 響 す る こ と を 定 量 的 に 示 し た[31]。

本 研 究 で は 、 非 球 形 の モ デ ル ウ イ ル ス と し て 複 雑 な 外 部 構 造 を 有 す るT4フ ァ ー ジ ウ イ ル ス(以 下 、T4フ ァ ー ジ)を 捕 集 対 象 と し た 。T4フ ァ ー ジ を誘 電 泳 動 の 制 御 対 象 と した 研 究 は 少 な い 。 本 研 究 グ ル ー プ で は 、 坂 根 らの 先 行 研 究 に お い て 、 本 研 究 に 用 い た 誘 電 泳 動 デ バ イ ス に よ り液 中 のT4フ ァ ー ジ が 捕 集 可 能 で あ る こ と を 示 し た 。 ま た 、 周 波 数 依 存 性 の 存 在 が 確 認 さ れ 、 最 適 な 捕 集 条 件 が 存 在 す る こ

と が 示 唆 さ れ た[32]。

本 論 文 で は 、 新 た な 評 価 方 法 と して 、DEPIM法 に よ る 迅 速 な 菌 密 度 計 測 を 行 っ た 。 こ れ ま で の 蛍 光 観 察 に よ る リ ア ル タ イ ム で の 捕 集 状 況 の 確 認(定 性 評 価)、 培 養 法 の 一 種 で あ る プ ラ ー ク 法 に よ る生 物 学 的 計 測(定 量 評 価)と 相 関 を 得 る こ と で 計 測 に お け る定 量 性 の 向 上 を 図 っ た 。 ま た 、 捕 集 数 の 周 波 数 依 存 性 か らDEPに

よ る 効 率 的 な 捕 集 条 件 を精 査 し た 。

な お 、DEPIM法 に お け る 菌 捕 捉 時 の 電 気 定 数 変 化 は 複 雑 で あ る た め 、 等 価 回 路 に よ る 簡 易 モ デ ル を 構 築 し、 各 周 波 数 で の フ ァ ー ジ 捕 集 数 に 対 す る コ ン ダ ク タ ン ス 変 化 を 数 値 的 に 検 証 し た 。 さ ら に 、 媒 質 及 び フ ァ ー ジ の 導 電 率 依 存 性 に つ い て も 検 証 し た 。

1.7本 論 文 の 構 成

本 論 文 は 、 全6章 か ら構 成 さ れ て い る。 概 要 は 以 下 の 通 りで あ る 。

第1章 は 序 論 で あ り、 本 論 文 に お け る研 究 背 景 、 関 連 研 究 及 び 研 究 目 的 に つ い て 記 載 した 。

第2章 で は、 誘 電 泳 動 、 誘 電 泳 動 イ ン ピ ー ダ ンス 計 測(DEPIM)法 及 び 蛍 光 染 色 法 に つ い て 原 理 を 述 べ る 。

第3章 で は 、 本 研 究 で 用 い た 実 験 装 置 、 手 法 、 捕 集 対 象 及 び 評 価 方 法 に つ い て 述 べ る 。

第4章 で は 、 誘 電 泳 動 に よ るT4フ ァ ー ジ 捕 集 に お け る 周 波 数 依 存 性 に つ い て 、 光 学 顕 微 鏡 を用 い た 蛍 光 観 察 及 び プ ラ ー ク法 と呼 ば れ る培 養 法 に よ り評 価 を 行 い 、 効 率 的 捕 集 条 件 の 精 査 を 行 っ た 。

第5章 で は 、T4フ ァー ジ 捕 集 に お い て 、DEPIM法 に よ り定 量 評 価 を 行 い 、 蛍 光 観 察 及 び プ ラ ー ク 法 と の 相 関 に つ い て 調 査 し た 。 ま た 、 捕 集 数 に お け る 電 極 部 の コ ン ダ ク タ ン ス 変 化 に つ い て 、 等 価 回 路 の 簡 易 モ デ ル を 構 築 し数 値 的 に 検 証 した 。

そ し て 、 第6章 は 総 論 で あ り、 本 研 究 で 得 られ た 知 見 を ま と め 、 今 後 の 展 望 に つ い て 詳 述 す る 。

第2章 実 験 原理

2.1誘 電 泳 動

誘 電 泳 動(dielectrophoresis:DEP)と は 、 不 均 一 電 界 中 に お い て 粒 子 と周 囲 媒 質 が 分 極 し電 界 の 勾 配 に 沿 っ て 粒 子 が 泳 動 す る現 象 で あ る 。DEPは 、 電 気 泳 動 と は 異 な り、 電 界 の 勾 配 に 依 存 す る た め 、 電 荷 を持 た な い 中 性 粒 子 に も 作 用 す る 。 ま た 、 微 粒 子 及 び 媒 質 の 電 気 的 特 性 を 利 用 して 微 生 物 を 選 択 的 に 制 御 す る こ とが で き る 。 前 節 で 説 明 し た よ う に 、DEPを 利 用 し た 微 生 物 の 制 御 は 、 医 療 、 生 物 学 、 食 品 工 学 な ど で 幅 広 い 利 用 が 期 待 さ れ て い る 。

誘 電 詠 動 の 原 理 に つ い て 説 明 す る 。 電 気 的 に 中 性 な 粒 子 が 交 流 電 界E中 に 置 か れ て い る と考 え る 。 位 置 ヂに お い て 、 電 界 方 向 に 双 極 子 間 隔 がdヂ で あ る 電 気 双 極 子 が 誘 起 さ れ る(図2.1参 照)。

0

図2.1:交 流 電 界 中 に 置 か れ た 中 性 粒 子

誘 電 泳 動 力 」妬EPは こ の 電 気 双 極 子 に 働 く ク ー ロ ン カ の 差 に よ る も の で あ る た め 、 式2.1が 成 り立 つ 。

 づ  ゆ

づ

(2.1)

.FDEP(.)‑q(E。(x+dx,Y+dy,z+dz)‑E。@,〃,z))

‑q(E・(x ,〃,z)+響 砒+特 吻+響dz一 恥 圃

一q(響 薦 暑 吻+嶺 の

=(q(dx ,dy,dz)・ ▽)E、c

=(ガ ・▽)Ex(2・2)

ガ は 双 極 子 モ ー メ ン ト で あ る 。y方 向 の 誘 電 泳 動 力FIDEP(y)、.Z方 向 の 誘 電 泳 動 力 FDEP(。)は 式22と 同 様 に 、

F[)EP(y)=(ガ ●▽)Ey(2.3) Fl⊃EP(z)=(ガ'▽)Ez(2.4)

で 表 さ れ る 。 よ っ て 、 丹)EPは 式2.2,2.3及 び2.4よ り 、 式2.5で 表 さ れ る 。 FI⊃EP=(ガ.▽)E(2.5)

づ

ま た 、 双 極 子 モ ー メ ン ト ガ は 式2.6で 表 さ れ る 。 α は 分 極 率 で あ る 。

づ

ガ=αE(2.6)

次 に 、 誘 電 媒 質 中 に 中 性 粒 子 が 置 か れ た 場 合 を 考 え る(図2.2)。

Z

y

X

図2.2:誘 電 媒 質 中 に お か れ た 中 性 粒 子

媒 質 及 び 粒 子 の 誘 電 率 をE7n及 び6pと す る 。 電 界 強 度Eoの 電 界 を 印 加 し た 際 、 点 rに お け る 半 径Rの 球 内 部 の ポ テ ン シ ャ ル Φ1及 び 外 部 の ポ テ ン シ ャ ル Φ2は 任 意 の 係 数A及 びBを 用 い て 式2.7及 び2.8で 表 さ れ る 。

Φ1(r,θ)=Aγcosθ(r〈R)(2・7) BCOSθ

、(r>R)(2・8) Φ2(r,θ)一 一E・rc・Sθ+

粒 子 表 面(r=R)の 境 界 条 件 は 、 ポ テ ン シ ャ ル 連 続 条 件 及 び 粒 子 表 面 に お け る 単 位 面 積 当 た り の 自 由 電 荷 量 の 保 存 式 か ら 、 次 式 を 満 た す こ と が 必 要 で あ る 。

Φ1(r=R,θ)=Φ2(r=R,θ)(2・9) ま た 、 球 表 面 に お い て ガ ウ ス の 式 は 式2.10で あ り、

emEr ,2(r=R,θ)=Ep,Er.1(r=R,θ)(2.10)

式2.7,2.8,2.9及 び2.10よ り 任 意 係 数A及 びBは 、 3Em Eo(2.11)

A=‑

Ep‑e26η 〜

Ep‑̀mR・E

。(2.12)

B=

Ep十2Em

P,ffCOSθ

(2ユ3) φ伽 ε。=47「C

mr2

こ こ で 、 几 〃 は 、 双 極 子 モ ー メ ン ト の 実 効 値 で あ る 。 式2.12及 び2.13よ りP。ft' は 、

P・ff‑4・ …B‑4π ・蓄 謝3E・(2・14)

式2.6及 び2.14か ら 、 α は 、

α̲4πR・,。 、.EL・一̀m(2.15)

6P十2Em とな る 。

実 際 は 、 導 電 率 が 存 在 す る た め 、 考 慮 す る 必 要 が あ る 。 媒 質 及 び 粒 子 の 導 電 率 を σm及 び σ,と す る。 複 素 誘 電 率 喘 及 びc声 は 、

・㍍ らバ ゴ㍗,・ 声 ・・一 ブ書(2・ ・6)

と 表 さ れ る 。 式2.15は

α=4πR3E.Re[K(ω)*]R3(2.17)

E*‑6*Pm(2 .18)

κ(ω)*=

Cp十2Cm

と 表 す こ と が で き る 。K(ω)*はClausius‑Mossotti関 数 と 呼 ば れ る 粒 子 の 分 極 を 表 す 因 子 で あ る 。

し た が っ て 、 誘 電 泳 動 力FDEPは 、2.5及 び2.17よ り

づ  

・FDEP=:(P・ ▽)E・‑9▽El・‑2π ・mR・[K(ω)rR・ ▽(畏)(2・19)

と 表 さ れ る 。

K(ω)・ の 実 部 で あ るRe[K(ω)*]は 一〇.5<rmRe[K(ω)*]<1の 値 で あ る が ・ こ の 値 の 正 負 に よ っ て 誘 電 詠 動 力 の 方 向 が 決 定 す る 。 図2.3の よ う に 、Re[K(ω)]が 正 の 時 は 、 双 極 子 モ ー メ ン ト と 電 界 が 同 じ 方 向 を 向 き 、 強 電 界 側 へ 泳 動 す る 、 こ れ を 正 の 誘 電 泳 動(positiveDEP)と 呼 ぶ 。 一 方 、 図2.4の よ う に 、Re[K(ω)]が 負 の

と き は 、 弱 電 界 側 へ 泳 動 す る 、 こ れ を 負 の 誘 電 泳 動(negativeDEP)と 呼 ぶ 。

⇒ 霊

釦

Re[K(ω)]>0

図2.3:正 の 誘 電 詠 動

0 釦 昌

⇒

Re【K(ω)1<0

図2.4:負 の 誘 電 詠 動

2.2誘 電 泳 動 イ ン ピ ー ダ ン ス 計 測 法

電 極 ギ ャッ プ 間 に 交 流 電 圧 を 印 加 す る と正 の 誘 電 詠 動 に よ り、 媒 質 中 の微 生 物 は 高 電 界 方 向 に駆 動 し、 電 極 近 傍 に 捕 集 され る。 電 極 間 に お い て 微 生 物 は電 界 に沿 っ て 整 列 し、 パ ー ル チ ェ ー ン と 呼 ば れ る数 珠 つ な ぎ の 微 生 物 鎖 を 形 成 す る 。 パ ー ル チ ェー ン に よ り電 極 間 が 短 絡 す る と ギ ャッ プ 間 の イ ン ピ ー ダ ン ス が 時 間 と共 に 変 化 す る 。 こ の 電 気 変 化 を イ ン ピ ー ダ ン ス 検 出 装 置 に よ り測 定 す る こ とで 、 媒 質 中 に お け る 微 生 物 の 初 期 濃 度 や 電 極 間 に捕 集 さ れ た 細 菌 数 が 推 定 で き る 。 本 手 法 を誘 電 詠 動 イ ン ピ ー ダ ン ス 計 測(dielectrophoreticimpedancemeasurement:DEPIM)

法 と呼 ぶ[34]。DEPIM法 で は 、 捕 集 さ れ た 微 生 物 を等 価 的 に 電 気 回 路 と し て 扱 う。

DEPIM法 に お け る 電 極 部 の 等 価 回 路 モ デ ル に つ い て 述 べ る 。 電 極 の イ ン ピ ー ダ ン スZE及 び 微 生 物 単 体 の イ ン ピ ー ダ ン スZBは 抵 抗 とキ ャ パ シ タ ン ス の 並 列 接 続 で モ デ ル 化 で き る(図2.5(a)参 照)。 パ ー ル チ ェ ー ン を 含 む 電 極 の 等 価 回 路 を 図 2.5(b)に 示 す 。 電 極 間 の イ ン ピ ー ダ ンスZAは 、 媒 質 の 影 響 を 含 め た 電 極 固 有 の イ ン ピ ー ダ ン スZEと 捕 集 さ れ た 微 生 物 の イ ン ピ ー ダ ン スZTの 並 列 回 路 で 表 さ れ 、 次 式 で 示 さ れ る 。

ZEZT (2.20)

ZA=Z

E十ZT

こ こ で 、ZEは 電 極 に お け る微 生 物 の 捕 集 に依 存 せ ず 一 定 と し、ZBは 微 生 物 の 形 状 及 び 誘 電 特 性(誘 電 率 、 導 電 率)は 均 一 で あ る と す る 。 パ ー ル チ ェ ー ン の イ ン

ピー ダ ン スZpは 微 生 物 単 体 の イ ン ピー ダ ン スZBの 直 列 接 続 で 表 さ れ る(図2.5(c) 参 照)。 以 上 よ り、Zpの 抵 抗 成 分 と キ ャパ シ タ 成 分 は 次 式 か ら求 め られ る 。mは パ ー ル チ ェ ー ン を1本 形 成 す る微 生 物 数 で あ る 。

Rp‑mRB,・P一 生(2.21)

m

微 生 物 の イ ン ピ ー ダ ン スZTは 、 パ ー ル チ ェ ー ン が 複 数 形 成 さ れ た と す る とZpの 並 列 接 続 で 表 され る 。ZTの 抵 抗 成 分 と キ ャパ シ タ 成 分 は 次 式 で 示 さ れ る 。nは 電 極 間 の パ ー ル チ ェ ー ン の 総 数 で あ る 。

RT一 童,OT‑n・P(222)

多 くの 微 生 物 が 捕 集 さ れ る と パ ー ル チ ェ ー ン は 互 い に 接 触 す る が 、 電 界 の 向 き に 沿 っ て 整 列 す る た め 、 電 気 的 に は 無 視 す る こ と が 出 来 る 。 以 上 か ら、 捕 集 さ れ た 微 生 物 数1Vは 次 式 か ら 求 め ら れ る 。

N‑一 一磯 一鵡(223)

こ こ で 、 菌 形 状 及 び 電 気 特 性 は 均 一 で あ る こ と か ら、RB、OB、mは 一 定 と 見 な す こ とが で き る 。 コ ン ダ ク タ ン ス とGTとRTは 次 式 で 示 さ れ る 。

GT=可(224)

1

従 っ て 、 式(2.23)よ り コ ン ダ ク タ ン スGTと キ ャパ シ タ ン スOTは 、 捕 集 さ れ た 微 生 物 数!Vと 線 形 とな り次 式 を 求 め る こ と が 出 来 る 。

OT=OBRB(=]T(2.25)

つ ま り、GTとOTはOBRBを 係 数 と した 一 次 関 数 の 関 係 を示 す 。 以 上 の こ と か ら、

捕 集 微 生 物 数Nは 次 式 か ら求 め られ る。CBは 微 生 物 単 体 の コ ン ダ ク タ ン ス 、GT は 全 パ ー ル チ ェ ー ン の コ ン ダ ク タ ン ス で あ る 。

N‑nm‑m・ 竃(226)

計 測 時 間tに お け るGTは 次 式 で 示 す こ と が 出 来 る。GAは 電 極 間 の コ ン ダ ク タ ン ス 、GEは 電 極 固 有 の コ ン ダ ク タ ン ス で あ る 。

GT=GA(t)一(]E(t)(2.27)

GTは 、 微 生 物 の 捕 集 数 の 増 加 に 伴 っ て 経 時 的 に 変 化 す る 値 で あ り、 本 論 文 で は 、

△σ と表 示 す る 。

以 上 よ り、 本 モ デ ル か ら次 式 の 結 論 を導 く こ と が で き る 。

ノVo(△G (2,28)

(a)

z挿RE

ZBIORB

(b)

ゆ 函 趣

隔/〆●

PearlChain

ゆ ゆ

(c)

ZT

ゆ

o

■ 腫

鵬願9

■

lZBIIZBl lZBl

匿 置 1

12BllZBl Iz81

● ■ ■

ZZ z

図2.5:等 価 回 路 概 略

(a)電 極 及 び 微 生 物 の 等 価 回 路,(b)捕 集 時 の 電 極 の 等 価 回 路,(c)PearlChainの 等 価 回 路