博 士 論 文 概 要
論 文 題 目
ミオシン V の逐次運動性における アクチン線維の役割
Single-molecule studies revealing the role of actin filament in the processive motility of myosin V
申 請 者
久保田 寛顕 Kubota Hiroaki
物理学及応用物理学専攻
2010 年 7 月
Ｎｏ.1 本 論 文 は 、 ア ク チ ン に ア ミ ノ 酸 置 換 や 結 合 タ ン パ ク 質 に よ る 制 御 、 そ し て 力 学 的 操 作 に よ る 張 力 付 加 と い っ た 種 々 の 変 化 を 施 し 、ミ オ シ ン V 一 分 子 の 運 動 に 対 す る 影 響 を 顕 微 解 析 す る こ と に よ り 、ミ オ シ ン V の 逐 次 前 進 運 動 性 に お け る ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト の 役 割 を 解 明 し よ う と す る も の で あ る 。
ミ オ シ ン V の 運 動 性 に 関 す る 今 日 ま で の 研 究 で は 、ア ク チ ン は 単 な る 足 場 に 過 ぎ な い と み ら れ て い る 。し か し 、筋 収 縮 の 原 動 力 と な る ミ オ シ ン I I の 研 究 に お い て は 、 ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト は た だ の 足 場 で は な く 、 能 動 的 に ミ オ シ ン の 運 動 を 制 御 し う る も の で あ る と い う 考 え 方 が あ る 。 そ の 根 拠 と し て 、 ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト は 柔 軟 な 構 造 を 持 ち 、そ の 柔 軟 さ と ミ オ シ ン I I の 酵 素 活 性 化 と の 間 に は 関 連 性 が 見 ら れ る こ と や 、 生 体 内 で は ア ク チ ン を 制 御 す る 様 々 な タ ン パ ク 質 同 士 の 作 用 が 干 渉 し 合 い 、 ア ク チ ン を 介 し て 生 体 機 能 の 調 節 が な さ れ る 機 構 が 存 在 す る こ と な ど が 挙 げ ら れ る 。 し た が っ て 、 ミ オ シ ン V の 運 動 性 に お い て も ア ク チ ン の 能 動 的 な 寄 与 が 大 い に 期 待 で き る 。
第 １ 章 は 序 論 で あ り 、 ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト の 構 造 や 細 胞 内 で の 役 割 、 ミ オ シ ン V の 運 動 機 構 と い っ た 本 研 究 の 背 景 と 、 本 論 文 の 概 要 に つ い て 述 べ る 。
第 ２ 章 で は 本 研 究 に 用 い た 試 料 の 調 製 方 法 と 、 実 験 方 法 に つ い て 述 べ る 。 前 半 部 で は 、リ コ ン ビ ナ ン ト ア ク チ ン や リ コ ン ビ ナ ン ト ミ オ シ ン V を 調 製 す る に あ た っ て 用 い た D i c t y o s t e l i u m 細 胞 や 昆 虫 細 胞 の 培 養 方 法 と 形 質 転 換 、 陰 イ オ ン 交 換 カ ラ ム を 用 い た 精 製 方 法 な ど に つ い て ま と め た 。
後 半 部 で は 調 製 し た 変 異 ア ク チ ン や 、 制 御 タ ン パ ク 作 用 下 で の ア ク チ ン の 機 能 を 探 る た め の 実 験 方 法 、 す な わ ち ミ オ シ ン V の 一 分 子 運 動 観 察 や 共 沈 実 験 、
AT P a s e 測 定 の 方 法 な ど を ま と め た 。 ま た 、 張 力 を 付 加 し た ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン
ト 上 で 、 ミ オ シ ン V の 一 分 子 運 動 を 観 察 す る た め の 、 光 ピ ン セ ッ ト を 用 い た 実 験 方 法 に つ い て も ま と め た 。
第 ３ 章 で は ア ク チ ン 分 子 内 の サ ブ ド メ イ ン ２ に 位 置 す る D - l o o p（3 8 番 目 か ら 5 2 番 目 の 残 基 に よ っ て 構 成 さ れ て い る ） 内 の ア ミ ノ 酸 を 変 異 さ せ た ア ク チ ン 、
D - l o o p の 一 部 を 切 断 し た ア ク チ ン の 機 能 解 析 に つ い て 述 べ る 。
D - l o o p は 柔 軟 な 構 造 で あ り 、D N a s e I と い っ た 、D - l o o p に 直 接 結 合 し 固 定 す る よ う な 物 質 を 利 用 し な け れ ば 結 晶 構 造 解 析 に お い て 位 置 を 特 定 で き な い 。
D - l o o p は ア ク チ ン 分 子 が 重 合 す る 際 、 分 子 間 の 連 結 部 に 位 置 し 、 フ ィ ラ メ ン ト 構
造 の 安 定 性 に お い て 特 に 重 要 で あ る こ と が 知 ら れ て お り 、特 に ミ オ シ ン V の 運 動 性 に お い て も 重 要 で あ る と 想 定 さ れ た た め 、こ の l o o p に 局 所 的 に 変 化 を 与 え る こ と に し た 。 与 え た 変 化 は 二 種 類 で 、 ひ と つ は 遺 伝 子 組 換 え 技 術 を 利 用 し た ア ミ ノ 酸 置 換（M 4 7 A：4 7 番 目 の メ チ オ ニ ン を ア ラ ニ ン に 置 換 ）、も う ひ と つ は 部 位 特 異
的 な 酵 素 切 断 （S u b t i l i s i n 処 理 ア ク チ ン （S u b ア ク チ ン ）： 主 に 4 7 番 目 の メ チ オ ニ ン と 4 8 番 目 の グ リ シ ン の 間 を 切 断 ） で あ る 。 そ れ ぞ れ 調 製 し た ア ク チ ン を 重 合 さ せ 、 機 能 解 析 に 供 し た 。
い ず れ の ア ク チ ン も 、AT P 存 在 下 に お い て ミ オ シ ン V- S 1（ ミ オ シ ン V の 頭 部 と 首 部 で 構 成 さ れ る 断 片 ： 歩 行 す る 際 に は “ 足 ” と 呼 ば れ る 部 分 ） と の 結 合 親 和 性 を 弱 め る 一 方 、A D P 存 在 下 で は 親 和 性 に 影 響 し な か っ た 。 ま た 、 こ れ ら の ア ク チ ン を 蛍 光 標 識 し た 後 、 フ ロ ー セ ル 内 で ガ ラ ス 面 に 固 定 し 、 そ の 上 を 歩 く ミ オ シ ン V 一 分 子 の 様 子 を 顕 微 観 察 し た 。そ の 結 果 、D - l o o p の 変 異 は 歩 行 速 度 に 影 響 せ ず 、 結 合 頻 度 と r u n l e n g t h を 著 し く 減 少 さ せ た 。D - l o o p は ミ オ シ ン V の 前 足 が ア ク チ ン に 結 合 す る 際 の 結 合 親 和 性 に 関 わ る も の と 考 え ら れ る 。 加 え て 、D - l o o p 変 異 ア ク チ ン 、 あ る い は 未 処 理 ア ク チ ン の B 端 に 、 架 橋 固 定 し た ゲ ル ゾ リ ン （ ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト の B 端 に 結 合 す る キ ャ ッ プ タ ン パ ク 質 ）を 介 し て ポ リ ス チ レ ン ビ ー ズ を 結 合 さ せ 、 光 ピ ン セ ッ ト で 捕 捉 し た ま ま ガ ラ ス 面 に 固 定 し た ミ オ シ ン I I 上 で 滑 り 運 動 さ せ る こ と に よ り 力 測 定 を 行 っ た と こ ろ 、D - l o o p 変 異 ア ク チ ン は 未 処 理 の も の に 比 べ て 発 生 力 は 小 さ か っ た 。
ミ オ シ ン V の 足 が ア ク チ ン に 着 地 す る 際 の 結 合 親 和 性 や 、 ミ オ シ ン I I の 力 発 生 に D - l o o p 変 異 が 変 化 を 与 え た こ と か ら 、D - l o o p は A D P・P i 状 態 に あ る ミ オ シ ン の 結 合 部 位 の 一 部 で あ る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た 。
第 ４ 章 で は 、 ア ク チ ン 結 合 タ ン パ ク 質 で あ る ド レ ブ リ ン の 作 用 下 で の 、 ミ オ シ ン V の 逐 次 前 進 運 動 性 に つ い て 述 べ る 。
前 述 し た D - l o o p の 研 究 に お い て は ア ク チ ン 分 子 の 構 造 と 、 ミ オ シ ン V の 運 動 性 と の 関 わ り に つ い て 探 る た め 、 い わ ゆ る 自 然 界 に は 存 在 し な い ア ミ ノ 酸 置 換 等 の 処 理 を 施 し た 。 本 研 究 に お い て は よ り 正 常 な 細 胞 内 で 起 こ り う る 状 況 に 迫 る た め 、 ア ク チ ン 結 合 タ ン パ ク 質 の 一 種 で あ る ド レ ブ リ ン を ア ク チ ン に 作 用 さ せ 、 ミ オ シ ン V の 歩 行 運 動 と の 関 連 性 を 調 べ る こ と に し た 。ド レ ブ リ ン は ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト の ネ ッ ト ワ ー ク 構 造 を 調 節 す る タ ン パ ク 質 で 、 脳 の 発 達 段 階 に お い て 樹 状 突 起 の ス パ イ ン 形 成 に 必 須 で あ る こ と が 知 ら れ て い る 。
ま ず 、 ガ ラ ス 面 に 固 定 し た ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト に ド レ ブ リ ン を 結 合 さ せ 、 そ の 上 に お け る ミ オ シ ン V の 運 動 を 調 べ た と こ ろ 、D - l o o p 変 異 の と き と 同 様 に 、ド レ ブ リ ン 未 結 合 の ア ク チ ン と 同 じ 速 度 で 歩 行 運 動 す る 一 方 、r u n l e n g t h は 5 0 %程 度 減 少 し た 。 な お 、 単 純 に ド レ ブ リ ン が ま だ ら 状 に ア ク チ ン に 結 合 し て お り 、 未 結 合 の 部 分 を ミ オ シ ン V が 運 動 し た だ け な の か ど う か を 検 証 す る た め に 、ド レ ブ リ ン に 蛍 光 標 識 を 施 し た と こ ろ 、 蛍 光 ド レ ブ リ ン は ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト 全 体 に ま ん べ ん な く 結 合 し 、 ミ オ シ ン V は そ の 上 を 運 動 し て い た 。 一 方 、 共 沈 実 験 に お い て も 第 ３ 章 に お け る 実 験 と 同 様 、AT P 存 在 下 で は 親 和 性 を 弱 く し 、A D P 存 在 下 で は 影 響 し な い と い う 結 果 を 得 た 。 ま た 、 ミ オ シ ン V を 結 合 し た ポ リ ス チ レ ン ビ
Ｎｏ.3 ー ズ を 光 ピ ン セ ッ ト で 捕 捉 し た ま ま 、 ガ ラ ス 面 に 固 定 し た ア ク チ ン 上 に 近 づ け 、 ス テ ッ プ 運 動 を 観 察 し た と こ ろ 、 ド レ ブ リ ン の あ る な し で ス テ ッ プ サ イ ズ に 違 い は な か っ た 。 一 般 的 に 各 ス テ ッ プ の 滞 在 時 間 （d w e l l t i m e） は 負 荷 の 上 昇 に 伴 い 延 長 す る こ と が 知 ら れ て い る が 、 ド レ ブ リ ン 結 合 ア ク チ ン に お い て は 未 結 合 の ア ク チ ン に 比 べ て 負 荷 感 受 性 が 強 く 、d w e l l t i m e の 延 長 す る 度 合 い が 大 き か っ た 。 ド レ ブ リ ン の 効 果 は D - l o o p 変 異 の も の と よ く 似 て お り 、 ミ オ シ ン V の 前 足 が 着 地 す る 際 の 結 合 親 和 性 が 弱 ま っ た た め に 、 負 荷 感 受 性 の 強 い 片 足 状 態 で の 結 合 時 間 が 延 長 す る こ と と な り 、S t a l l F o r c e が 減 少 し た に も か か わ ら ず 、d w e l l t i m e の 負 荷 依 存 性 を 高 め た も の と 結 論 し た 。
第 ５ 章 で は 光 ピ ン セ ッ ト に よ り 張 力 を 付 加 し た ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト 上 で の ミ オ シ ン V の 逐 次 運 動 性 に つ い て 述 べ る 。
先 行 研 究 に よ る と 、 ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト の 両 端 に ポ リ ス チ レ ン ビ ー ズ を 結 合 し 、光 ピ ン セ ッ ト に よ り 張 力 を 付 加 す る と 、約 1 0 か ら 2 0 p N 程 度 の 力 で ア ク チ ン に 分 子 歪 み が 生 じ る こ と が 示 さ れ て い る 。 こ の 分 子 歪 み は ア ク チ ン 分 子 内 の 3 7 4 番 目 の シ ス テ イ ン を 標 識 し た 蛍 光 色 素 の 強 度 変 化 に よ っ て 示 さ れ た も の で あ る 。 こ の シ ス テ イ ン は D - l o o p と 同 様 に ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト の 分 子 間 連 結 部 に 位 置 す る た め 、D - l o o p の 構 造 が ミ オ シ ン の 運 動 性 に 深 く 関 わ っ て い る こ と を 考 え る と 、 張 力 が 引 き 起 こ す 分 子 間 連 結 部 の 歪 み が ミ オ シ ン Vの 運 動 性 を 変 化 さ せ る こ と が 期 待 さ れ る 。
先 行 研 究 と 同 様 に ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト の 両 端 に 結 合 し た ビ ー ズ を 光 ピ ン セ ッ ト に よ り 捕 捉 し つ つ 張 力 を 付 加 し 、 量 子 ド ッ ト を 結 合 さ せ る こ と に よ り 可 視 化 し た ミ オ シ ン V 一 分 子 の 運 動 を 観 察 し た 。 そ の 結 果 、 約 1 5 p N 程 度 の 張 力 下 で は ミ オ シ ン V は 正 常 に 運 動 し 、 ま た 、 歩 行 速 度 と r u n l e n g t h は こ の 程 度 の 張 力 に は 依 存 し な い こ と も 明 ら か に な っ た 。
第 ６ 章 で は 本 論 文 の 総 括 と 、 今 後 の 研 究 に お け る 展 望 を ま と め た 。
D - l o o p に 点 変 異 や 切 断 を 施 し た 実 験 か ら 、ア ク チ ン の 分 子 内 構 造 が ミ オ シ ン V
の 逐 次 前 進 運 動 性 を 制 御 で き る こ と 、 ま た 、 そ れ と 同 様 の 変 化 が ア ク チ ン 結 合 タ ン パ ク で あ る ド レ ブ リ ン に よ り 実 現 し う る こ と が 示 さ れ た 。 一 方 、 張 力 付 加 の 実 験 に よ る と 、1 5 p N 程 度 の 力 で は ミ オ シ ン V の 逐 次 前 進 運 動 性 が 乱 さ れ な い こ と が 示 さ れ た 。
本 研 究 で 得 ら れ た 知 見 は 、 ア ク チ ン-ミ オ シ ン V 間 の 相 互 作 用 メ カ ニ ズ ム に ア ク チ ン に よ る 制 御 と い う 新 た な 視 点 を 与 え る と と も に 、ミ オ シ ン V を 軸 と し た 細 胞 内 物 質 輸 送 に お け る 局 所 的 な 調 節 機 構 に つ い て 新 し い 見 方 を 与 え た と い う 点 で 、 大 き な 意 義 が あ る と 考 え る 。
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
氏 名 久保田 寛顕 印
（２０１０年 ７月 現在）
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
論文
○
○ 講演
（本人）
Modulation of the processive motility of myosin V by drebrin: Insights into the regulation of myosin V mediated by the actin-binding proteins.（投稿準備中）Kubota, H. Ishikawa, R. Ohki, T. Ishizuka, J. and Ishiwata, S.
D-loop of actin differently regulates the motor function of myosins II and V.
J. Biol. Chem. 284, 35251-35258. (2009) Kubota, H. Mikhailenko, S.V. Okabe, H.
Taguchi, H. and Ishiwata, S.
Myosin V stepping mechanism: Insights from the mutations in the converter domain.
J. Biol. Chem.（投稿中）Ohki, T. Yoshimoto, J. Mikhailenko, S.V. Kubota, H. Oguchi, Y. and Ishiwata, S.
Regulation of Myosin Motility by D-loop of Actin. Biophysical Society the 54th Annual Meeting, San Francisco, CA, U.S.A. (2010.2) Kubota, H. Mikhailenko, S.V.
and Ishiwata, S.
張力のかかったアクチンフィラメント上でのミオシン V 一分子運動、日本生物物理学会 第 47 回年会、徳島市 (2009.10) Kubota, H. Oguchi, Y. Ohki, T. and Ishiwata, S.
アクトミオシン相互作用における D-loop の役割、日本生物物理学会第 46 回年会、福岡 市、(2008.12) Kubota, H. Mikhailenko, S.V. and Ishiwata, S.
D-loop is important for the motility of myosins II and V. 2nd International Symposium on Bio-nanosystems, Tokyo (2008.10) Kubota, H. Mikhailenko, S.V. and Ishiwata, S.
In vitro analysis of the interaction of modified actins with myosins II and V ‒ To elucidate the active role of actin in actomyosin interaction-. NTU-WU Joint Symposium 2008 on Bioscience and Biomedical Engineering, Singapore (2008.3) Kubota, H.
Interaction of actins modified in D-loop with myosins II and V. Biophysical Society the 52th Annual Meeting, Long Beach, CA, U.S.A. (2008.2) Kubota, H. Ohki, T. and Ishiwata, S.
アミノ酸変異によるアクチン D-loop の機能の研究-アクトミオシン相互作用に着目して- 生体運動研究合同班会議、仙台市 (2008.1) 久保田寛顕、大木高志、石渡信一
Ｎｏ.2
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
講演
（本人）
講演
（共同）
アクチン D-loop に加えた変化がミオシンとの相互作用に及ぼす影響、日本生物物理学会 第 45 回年会、横浜市 (2007.12) 久保田寛顕、大木高志、石渡信一
Mutation of D-loop of actin and its effects on the interaction of myosins, II and V. Waseda University The 5th 21st century COE symposium on Physics of Self-organization Systems, Tokyo (2007.9) Kubota, H.
Functional analysis of M47A/E360H mutant actin expressed in Dictyostelium.
Biophysical Society the 51th Annual Meeting, Baltimore, MD, U.S.A. (2007.2) Kubota, H. Shimozawa, T. Mikhailenko, S.V. and Ishiwata, S.
Functional analysis of M47A/E360H mutant actin expressed in Dictyostelium cells.
5th East Asian Biophysics Symposium and 44th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, Okinawa (2006.11) Kubota, H. Shimozawa, T. Kubo, K. and Ishiwata, S.
Subtilisin 処理アクチン線維上でのミオシン V のプロセッシブ運動、日本生物物理学会 第 42 回年会、京都市、(2004.12) 久保田寛顕、石渡信一
Subtilisin 処理したアクチン線維上におけるミオシン V 一分子運動、日本生物物理学会 第 41 回年会、新潟市、(2003.9) 久保田寛顕、上村想太郎、石渡信一
細胞内アクチンの SS 結合による二量体の研究、日本生物物理学会第 47 回年会、徳島市 (2009.10) Fukuhara, D. Kubota, H. Ohki, T. and Ishiwata, S.
ミオシン V の運動性におけるトロポミオシンの役割、日本生物物理学会第 47 回年会、徳 島市 (2009.10) Ishizuka, J. Oguchi, Y. Yoshimoto, J. Kubota, H. Ohki, T. and Ishiwata, S.
ミオシン V の運動性におけるコンバーター内疎水性残基の重要性、生体運動研究合同班 会議、東京大学 (2009.1) 吉本順一、大木高志、Sergey Mikhailenko、久保田寛顕、小 口祐伴、石渡信一
ミオシン V のコンバータードメインにある疎水残基は分子内の力の伝達において重要で あ る 。 日 本 生 物 物 理 学 会 第 46 回 年 会 、 福 岡 市 、 (2008.12) Yoshimoto, J. Ohki, Mikhailenko, S.V. Kubota, H. Oguchi, Y. and Ishiwata, S.
Expression of Dictyostelium and mouse alpha-skeletal actins in the baculovirus/Sf9 cell system. Biophysical Society the 52th Annual Meeting, Long Beach, CA, U.S.A.
(2008.2) Ohki, T. Kubota, H. Ohno, C. and Ishiwata, S.
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
講演
（共同）
バキュロウイルス/昆虫細胞システムを使った細胞性粘菌、ショウジョウバエとマウス骨 格筋アクチンの発現、日本生物物理学会第 45 回年会、横浜市 (2007.12) 大木高志、久 保田寛顕、大野力徳、栗原雅、石渡信一
昆虫細胞−バキュロウイルス発現系による細胞性粘菌アクチンの高収量発現と特性評 価、日本生物物理学会第 45 回年会、横浜市 (2007.12) 大野力徳、大木高志、久保田寛 顕、栗原雅、石渡信一
細胞性粘菌アクチンの部位特異的変異を用いたアクチン SS ダイマーの研究、日本生物物 理学会第 45 回年会、横浜市 (2007.12) 栗原雅、氏家加洋子、大木高志、久保田寛顕、
大野力徳、石渡信一
ミオシン V 運動の温度依存性、日本生物物理学会第 43 回年会、札幌市 (2005.11) 井上 智裕、久保田寛顕、石渡信一
細胞性粘菌で発現した変異アクチンの機能評価、日本生物物理学会第 43 回年会、札幌市 (2005.11) 久保圭、小口祐伴、久保田寛顕、芹沢加洋子、石渡信一
