博 士 （ 医 学 ） 瀬 戸 一 寿
学位論文題名
HTLV ―I 持続感染ラットにおけるHAh/17TSP の
動 物 モ デ ル HAM ラ ッ ト 病 の 解 析
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
【は じめ に】
ヒ トの感染性レトロウイルスであるHTLV‑I (HumanTcell leukemla virus type I） は 、 成 人T細 胞 性 自 血 病(ATL)の 原 因 ウ イ ル ス の み なら ず 、 慢 性 進 行 性 脊 髄 症 (HAM/TSP)、 関 節 症(HAAP)、 細 気 管 支 肺 胞 炎(HAB)な ど に も 病 因 論 的 な 関 係 が示 され てい る。 我々 は、 これ らHTLV‑I関連 疾患 の発 症機序 解明 のた めHTLV‑I持続 感染 ラッ トを 作製 し、 これ まで に新 生仔 期にMT‑2を接種 した 抗体 陰 性 のWKAH/H kmラ ッ ト3頭 に 後 肢 の 対 麻 痺 が 出 現 し 、 胸 髄 主 体 の 脱 髄、 空胞 変 性 及 び マ ク ロ フ ァIジ 浸 潤 を み る 脊 髄 病 変 を 有 す るHAM/TSPモ デ ル 動物 とし て報 告し た。
本 研 究 で は 、 生 後3〜6カ 月 齢 にMT‑2を 接種 し抗 体陽 性と なっ たWKAH/H km系 ラ ッ ト にHAM/TSP様 症 状 を 認 め た の で 、 その 神経 病理 学的 及び 分子生 物学 的解 析を 報告 する と共 に、HAMラ ット 病の 末梢 神経 病変 、免 疫組 織化学的解析及び脊 髄 病 変 の 経 時 的 観 察 な ど に つ い て も 報 告 し 、 発 症 機 序 を 考 察 す る 。
【材料と方法】
1）HTLV‑I感 染 ヒ トT細胞 株MT‑2を 以 下 の 各 方 法 に て 接 種 し 、HTLV‑I持 続 感染 ラ ッ ト を 作 製 し た 。A群 ： ixi07個 ／ 頭 を 12〜37週 齢 のLEW/H km、 WKAH/Hkm、F344/Slc、ACI/H km、SDJ/H km、BUF/Hkm、LEJ/Hkm系 ラ ッ ト に 2回 静 脈 内 接 種 。B群 ：1X107個 ／ 頭 を8〜28週 齢 のLEW/Hkm、WKAH/Hkm系 ラ ッ ト に2回 腹 腔 内 接 種 。C群 ：1X107個 ／ 頭 を17週 齢 のWKAH/Hkm系 ラ ッ ト に 腹 腔 内 接 種 。D群 ：1X108個 ／ 頭 を14週 齢 のWKAH/H km系 ラ ッ ト に 腹 腔 内 接 種 。E群 ：ixi07個 ／ 頭 を 生 後24時 間 以 内 のWKAH/Hkm系 新 生 仔 ラ ッ ト に 腹 腔 内接種。
2） 血 清 及 ぴ 髄 液 中 の 抗HTLV‑I抗 体 価は ゼ ラ チ ン 凝 集 法 を 用 い て 測 定 し た 。 3) HTLV‑Iプ ロ ウ イ ル ス ゲ ノ ム の 検 出 は 、 末梢 リン バ球 及び 脊髄 から 抽出 した DNAを 鋳 型 と し 、HTLV‑IのpX領 域 の プ ラ イ マ ー 及 ぴプ ロ ー ブ 用 い たPCR法 にて 常法に従い行った。
4）病理組織学的検索には、HE染色、KB染色、KB‑PAS染色及ひ、：Toluidine‑blue染 色な どを 行い 、ま た免 疫組 織化 学的 検索 は各種 の一 次抗 体を 用いてABC法により
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行った。
5） 脊髄 にお けるア ポト ーシ スの 検索 は、 パラ フイ ン包 埋切 片で 核のDNA断片化 を検出するTUNEL (TdT‑mediated dUTP‑biotin nick end labeling)法を用いゝた。
【結果】
1）HTLV‑I持続感染の確認
末 梢 リ ン パ 球か ら 抽 出 し たDNAを 用 い 、PCR法 に よ りA〜E群 全 て に 持 続感 染 の 成 立 を 確 認 した 。 成 熟 期 にMT‑2を 接 種 し たA〜D群 は 抗 体 陽 性 、 新 生 仔期 に 接種したE群は抗体陰性の持続感染ラットとなった。
2）抗体陽性群におけるHAMラット病の発症
A及 びB群 ：WHAH/Hkmラ ッ ト5頭 中3頭 に 約16カ 月 の 潜 伏 期 を 経 て 後 肢 対 麻 痺 が 出 現 し 、 組織 学 的 には5頭全 てにHAMラ ット 病の 発症 を確 認し た。 髄液 中 の抗 体は 検索 し得 た1頭 では 陰性 であ った 。他 系統 のラ ット には麻 痺症 状及ぴ脊 髄 病 変 を 認 め な かっ た 。C群 ： 麻 痺 症 状 の な い接 種 後14〜16カ 月齢 の3頭 中3頭 に 、 組 織 学 的 にHAMラ ッ ト 病 の 発 症 を 確 認 し た。D群 ：接 種後15カ 月齢の2頭 に 後 肢 対 麻 痺 が 出 現し た 。 組織 学的 には 接種後11〜16カ 月齢 に検 索し た麻 痺症 状 のない3頭を含め、5頭にHAMラット病の発症を確認した。
3）抗体陽性HAMラット病の神経病理学的所見
脊 髄前 索及 び側 索周 辺帯 を主 体とす る左 右対称性の髄鞘の変性、消失、空胞変 性、グリオーシス及びミエリンを貪食するマクロファ ージ浸潤像を認めた。リン ノヾ球浸潤像は存在しなかった。病変は胸髄中部を中心に上下に拡がっていたが、
延髄 より 上部 の中 枢神 経系 には 病的変 化を 認めなかった。坐骨神経や神経根には 有髄 線維 の減 少、 脱髄 、髄 鞘の 再生及 びミ エリンを貪食するマクロファージ浸潤 像を認めた。
4）HAMラット病の免疫組織化学的所見
病 変 脊 髄 に は 、抗 マ ク ロフ ァー ジ抗 体陽性 の多 数の マク ロフ ァー ジ浸 潤、 抗 GFAP抗 体 陽 性 の 腫 大 し た ア ス ト ロ サ イ ト 増生 像 を 認 め た 。 抗PanT、CD4及 び CD8抗 体 を 用 い た 免 疫 染色 にお いて もTリンバ 球浸 潤を 認め ず、 抗HTLV‑Iコア 、 エ ン ベ ロ ー プ 及 びpX蛋 白 に反 応す るウ イ´レ ス感 染細 胞は 証明 され なか った 。 5）アポトーシスの検索
病 変脊 髄に 核ク ロマ チン の濃 縮、核 の断 片化 を呈 する 細胞 を認 めた 。TUNEL法 によ り、 前・ 側索 の白 質周 辺帯 を主体 とし て分布するアポトーシスによる細胞死 を確認した。
6）病変脊髄におけるHTLV‑Iプロウイルスゲノムの局在
抗 体 陽 性HAMラ ッ ト1/2頭で 脊髄 にプ ロウイ ルス ゲノ ムが 検出 され た。 また 、 HAMラ ッ ト 病 非 発 症 系 の 持 続 感 染 ラ ッ ト に も 陽 性 例 を 認 め た 。 7）脊髄病変の経時的観察
E群にお ける 経時 的な 組織 学的 検索 では 、接 種後12カ 月齢 に初め て限 局性の初 期 病 変 像 を 確 認 し た 。 発 症 に 至 る ま で り ン バ 球 浸 潤 は 認 め な か っ た 。
【考案】
1） 抗体 陽性群 にお いて もWKAH/Hkm系に 限りHAMラッ ト病の発症を認めた事 よ り 、 発 症 に 宿 主 の 遺 伝 的 背 景 が 関 与 す る こ と が 重 ねて 示 唆 さ れ た 。 2) HAMラット病は、脊髄におけるウイルスの存在のみでは発症に至らず、恒常 的なウイルスの存在は必要条件でない可能性が示唆された。更に、仮にウイル スが存在してもウイルス抗原の発現がない、あるいは特定の時期のみ表出されて いる可能性も考えられた。
3) HAMラット病の発症機序に関しては、浸潤マクロファージなどから放出され るTNFaに代表される各種のサイトカインや、アポトーシス誘導によるオリゴデ ンドロサイトの障害などが想定されるが、ヒトHAM/TSPと比較してエフェクタ ー T細 胞 に よ る 免 疫 学 的 脱 髄 機 序 の 関 与 は 乏 し い と 考 え ら れ た 。 4）HAMラッ ト病 は、ヒ トHAM/TSPの病態解明、更にその予防及び治療を検討 するための有用な動物モデルであると考えられた。
【結語】
1．7系 統の 抗体 陽性 持続感 染ラ ット の中で 、WKAH/Hkm系にのみHAMラット 病が発症した。
2.抗体陽性HAMラット病の神経病理学的所見は、胸髄を主体とした脱髄、空 胞変性、グリオーシス及びマクロファージ浸潤で、抗体陰性HAMラット病と 基本的に同様であったが、その程度は軽症の傾向を示した。また末梢神経にお い て も 脱 髄 、 有 髄 線 維 の 減 少 及 び マ ク ロ フ ァ ー ジ 浸 潤 等 を 認 め た 。 3. HAMラット病脊髄の経時的観察では、その全経過を通じてりンバ球浸潤像 を認めなかった。
4. HAMラット病の病変脊髄において、アポトーシスによる細胞死の存在を確 認した。
学位論文審査の要旨
学位論文題名
HTLV ーI 持続感染ラットにおけるHAIVI/TSP の
動 物 モ デ ル HAM ラ ッ ト 病 の 解 析
【研究目的】
HTLV‑I (HumanTcellleukemia virus typeI）は、成人T細胞性自血病の原因ウイルスの み ならず 、慢 性進 行性 脊髄 症(HAM門SP)、 関節 症(HAAP)など にも 病因論的な関係を有 することが示唆されている。これらHTLV‑I関連疾患の発症機序解明のためHTLV‑I持続感 染 ラット を作 製し 、こ れま でに 抗体 陰性WKAH系ラットにおいてHAMff SPの疾患モデル と なるHAMラ ット 病を 樹立 し既 報した 。本 研究 では 、抗 体陽 性WKAH系ラットに発症し たHAMラ ット 病の 神経 病理 学的 及び分 子生物学的検索を行い、同時にHAMラット病の末 梢 神 経 病 変 、 免疫 組織化 学的 検索 及び 脊髄 病変 の経 時的 所見 につ いて も検 討した 。 【材料及び方法】
1）HTLV‑I感染ヒトT細胞株MT‑2を以下の方法にて接種し、HTLV‐I持続感染ラットを作 製し た。A群 ：ixi07個 を7系 統の 成熟 ラッ トに2回静 脈内 に接 種し た。B群：ixi07個 を2系統 の成 熟ラッ トに2回 腹腔 内に 接種 した。C群 ：ixiぴ個 をWKAH系 成熟 ラッ トに 腹腔 内に 接種 した 。D群 ：ixi08個をWKAH系成熟 ラッ トに 腹腔 内に 接種 した 。E群 ：1 Xl07個をWKAH系新生仔ラットに腹腔内に接種した。
2） 血 清 及 び 髄 液 中 の 抗HTLV‑I抗 体 価 は ゼ ラ チ ン 凝 集 法 を 用 い て 測 定 し た 。 3）HTLV‑Iプ ロウイ ルス ゲノムの検出は、末梢リンバ球及び脊髄から抽出したDNAを鋳 型 と し 、HTLV‑IのpX領 域 の プ ラ イ マ ー 及 び プ ロ ー ブ 用 い たPCR法 に て 行 っ た 。 4）病理組織学的検索には、HE染色、KB染色及びToluidine‑blue染色などを行い、また免 疫 組 織 化 学 的 検 索 は 各 種 の 一 次 抗 体 を 用 い て ABC法 に よ り 行 っ た 。 5）apoptosisの検 索は 、パ ラフ イン 包埋 切片上 で核 のDNA断 片化 を検 出するTUNEL（ TdT‑mediated dUTP‑biotin nick end labeling)法を用いた。
【結果】
1）HTLV‑I持続感染の確認：末梢リンパ球から抽出したDNAを用い、PCR法にて感染成立 を 確 認 し た 。A〜D群 は 抗 体 陽 性 、E群 は 抗 体 陰 性 の 持 続 感 染 系 と な っ た 。 2） 抗 体 陽 性 群 に お け るHAMラ ッ ト 病 の 発症 ：A及 びB群 ；WHAH系 ラ ッ ト に 限 り5頭 中3頭に約16カ月の潜伏期を経て後肢対麻痺が出現し、5頭全てに脊髄病変を確認した。
保紀 雄 知邦 崎川 代 宮 皆 田 授授 授 教教 教 査査 査 主副 副
髄液中の抗体は陰性であった。C群；接種後14〜16カ月齢の3頭中3頭に脊髄病変を確認し た。D群； 接種後15カ 月齢の2頭に 後肢対麻 痺が出現 し、計5頭に脊髄病変を確認した。
3）抗体陽 性HAMラット 病の神経病理学的所見：胸髄前・側索周辺帯を主体とする左右対 称性の脱髄、空胞変性、グリオー江ス及ぴミエリンを貪食するマクロファージ浸潤を認め たが、リンパ球浸潤は存在しなかった。坐骨神経や神経根には有髄線維の減少、脱髄、髄 鞘再生及びマクロフアージ浸潤を認めた。
4）免疫組織化学的所見：病変脊髄に、抗マクロフアージ抗体陽性の多数のマクロファー ジ浸潤、 抗GFAP抗体陽 性の腫大し たアスト ロサイト 増生像を認めた。抗PanT、CD4及ぴ CD8抗体を用いた免疫染色においてTリンパ球浸潤は認められず、抗rmーV‑Iコア、エンベ ロ ー プ 及 び pX蛋 白 に 反 応 す る ウ イ ル ス 感 染 細 胞 は 証 明 さ れ な か っ た 。 5）apoptosisの検索：核クロマチンの濃縮、核の断片化を呈する細胞を認め、TUNEL法に て 前 ・ 側 索 の 白 質 周 辺 帯 を 主 体 に 存 在 す る apoptosis像 を 確 認 し た 。 6）脊髄に おけるHTLV‑Iプ ロウイルス ゲノムの 局在：抗体陽性HAMラット1/2頭、非発症 系持続感染ラット2/2頭にプロウイルスゲノムが検出された。
7）脊髄病 変の経時 的観察：E群における経時的な組織学的検索で、接種後12カ月齢に初 めて限局性の初期病変像を確認した。発症に至るまでりンパ球浸潤は認められなかった。
【考案及び結語】
1）7系 統の 抗 体 陽性 持 続感 染 ラ ット の 中 で、WKAH系 ラッ ト に 限りHAMラッ ト 病の発 症 を 認 め た 事 よ り 、 発 症 に 宿 主 の 遺 伝 的 背 景 の 関 与 が 示 唆 さ れ た 。 2）抗体 陽性HAMラット病の神経病理学的所見は、胸髄を主体とした脱髄、空胞変性、グ リ オー シ ス及 び マ クロ フ ァー ジ 浸 潤で あ った 。末 梢神経に も同様の 病変を認 めた。
3）血清中の抗体の有無を問わず発症し、髄液中の抗体は陰性であり、全経過を通じてり ンパ球 浸潤は認められなかった事より、ヒトHAM[TSPと比較してエフウクターT細胞によ る免疫学的脱髄機序の関与は乏しいと考えられた。
4）脊髄でのウイ丿レスの存在のみでは発症に至らず、恒常的なウイルスの存在は必要条件 でない 可能性が示唆された。発症機序に関しては、マクロフアージなどから放出される TNFロに代表されるサイトカインや、apoptosis誘導によるオリゴデンドロサイトの障害な どの関与の可能性が想定された。
以上の結 果、HAMラット病は、ヒトHAMff SPの病態解明、予防及び治療を検討するため の有用な 疾患モデ ルである と考えら れた。
以 上 よ り 、 本 研 究 は 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 論 文 と し て妥 当 な もの と 判断 さ れ る。
