ヘ モ グ ロ ビ ン の リ ガ ン ド結 合 と サ ブ ユ ニ ッ ト間 相 互 作 用
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(2) (28). Vol. 14. 生 物 物 理. α 鎖,β 鎖(四 性 は高 く,ヘ. 量 体)と. もに 酸 素 結 合 に お い て は親 和. ム 間 相 互 作 用 とBohr効. い て,HbAの. る が,4な. 果 は な くな っ て. 表2.. の水 素 結 合 に 変 化 は な い.こ. 対 し α1β2接触 で は,CDβ. 性 質 は α, β二 種 の サ ブ ユ ニ ッ トか らな. る 四 量 体 で あ る こ と が必 要 条 件 と思 わ れ る.表2に. い し5個. い がCDα. 種. とFGβ. とFGα. れに. と の接 触 は 変 化 しな. との 接 触 は 図1の. α 鎖 ど うし の 間 で は 図2Cに. よ うに 変 化 す る.. 示 す よ う にN末. ず る 二 対 の イ オ ン結 合 ば あ るが,リ 種 々の再構 成 ヘモ グ ロビンの機 能. No.1 (1974). 端 を主 と. ガ ン ド結 合 に よ り. 消 失 す る.β 鎖 間 に は 直 接 の 結 合 は な い.. 種 の サ ブ ユ ニ ッ トか ら ヘ モ グ ロ ビ ン を再 構 成 した と き の 機 能 を示 す.単 は,そ. 離 鎖(た. れ と異 名(β. 鎖)の. と結 合 す る と低下 し,正 (3価. 鉄)を. と え ば α鎖)の. 常 の 機 能 を持 た な い メ トヘ ム. 持 つ ポ リペ プ チ ド(β+鎖)と. 合 に は さ らに 正 常 値 に近 づ く.後 ほ ぼHbAに. 酸 素親 和 性. ヘ ム を欠 くポ リペ プ チ ド鎖. 図1.. 結合 した場. 者 で はBohr効. α1β2接触 の変 化 を示 す. 果は. 等 し い 大 き さで 表 わ れ るが ヘ ム 間相 互 作. 用 は 小 さ い.n値. は2価. 3.. 鉄 ヘ ム を含 む 異 名 鎖 と再 編 成. さ れ な い と,正 常 値 に近 い も の と は な らな い.. Perutzの. ア ロ ス テ リ ッ ク 効 果 の モ デ ル2)8). ヘ モ グ ロ ビ ン の機 能 の 特 性 を構 造 と関 連 づ けて 論 ず る とき に は 近 頃 で はX線. 2.. 四 量 体 の 構 造. え られ たPerutzの. 四 量 体 ヘ モ グ ロ ビ ン で は4個. の サ ブ ユ ニ ッ トは正 四. 面 体 の各 頂 点 に位 置 す る よ う に配 位 し,分 2回 対 称 軸 を持 つ.α. 子 は1本. 鎖 と β鎖 との 接 触 面 に2種. で,こ. 解 析 と結 晶 型 と の 結 果 か ら 考. モ デ ルが 基 本 と され る こ とが 多 い の. の モ デ ル の概 略 を述 べ る.こ. れ は リ ガ ン ド結 合. に よ りサ ブ ユ ニ ッ トの 三 次 構 造 変 化 と四 次 構 造 変 化 と. の. あ り,. が 協 調 的 に 起 こ り,こ. の変 化 を通 して ヘ ム 間 相 互 作 用. 鉄 原 子 間 距 離 が長 く接 触面 積 が大 き く,結 合 が主 と し. や ヘ テ ロ ト ロ ピッ ク な ア ロ ステ リ ッ ク効 果 が 表 わ れ る. てvan. とす る も の で あ る.. der. Waals力. に よ る も の を α1β1接 触 と い い,. 接 触 点 が 主 と してFG角,Gヘ. リ ッ ク ス とCヘ. リック. 図3に. 示 す よ うに リ ガ ン ド結 合 した ヘ ム 鉄 は2価. ス の一 部 と で 小 さ い も の を α1β2接触 と呼 ぶ.先 に の べ. 低 ス ピ ン状 態 で,こ. た よ うに 酸 素 結合 能 に表 わ れ る機 能 の特 徴 は 四量 体 の. フ ィ リ ン環 の 面 内 に あ る.デ. コ ン ホ メー シ ョン 変 化 に依 存 して い る が,最. で鉄 は ポ ル フ ィ リン 面 か ら近 位 ヒ ス チジ ン側 へ0.75. シ 型 と デ オ キ シ型 と の高 次 構 造 の差 がX線 見 い だ され た.さ. 解析により. ら に分 解 能 を あ げ た結 果 で は,デ. キ シ型 が リガ ン ド結 合 型(ま ト型)に. 初 にオキ. た は 鉄 が3価. な る とα1β1接触 は"ゆ. る む"が"ず. く,接 触 に関 与 す る原 子 数 は110か. ら98へ. Å変 位 して い る.鉄. の メ トヘ モ グ ロ ビ ン で も低. ス チ ジ ン側 へ 変 位 して い る.デ. になった メ れ"は. が3価. オ キ シ 型 は高 ス ピン 状態. ス ピン で は鉄 は 面 内 に あ り高 ス ピ ンで は0.4Å. オ. な. の. の 鉄 の原 子 半 径 だ と鉄 原 子 は ポ ル. 近位ヒ. オ キ シ型 に 酸 素 が 結 合. す る と上 記 の鉄 の原 子 半 径 の 変 化 に よ りポ ル フ ィ リン. と減 少 ず. 環 と近 位 ヒ スチ ジ ン の 属 す るFヘ 28. リ ッ ク ス と の距 離 は.
(3) ヘ モ グ ロ ビ ンの リガ ン ド結 合 とサ ブ ユ ニ ッ ト間 相 互 作 用. 図3.. (29). 鉄原 子 のポ ル フ ィリン面 に対 す る位置. 近 く な る.そ. してFヘ. き が狭 く な る.図2に. リッ ク ス とHヘ. リ ッ ク スの 間 げ. 示 す よ うに デ オ キ シ 型 で はC末. 端 か ら二 番 目 の チ ロ シ ン残 基(HC2)の はVal. FG5のCOと. フ ェ ノ ー ル基. 水 素 結 合 して チ ロ シ ン側 鎖 はHと. Fと の ヘ リッ ク ス の間 に 入 っ て い る が,オ. キシ型で チ. ロ シ ン側 鎖 は外 に 出 て い る.こ の た めC末. 端残基の. Arg. HC3α1とHis. 1α2とAsp C6α2と. HC3β1と. H9α2と. は そ れ ぞ れVal. の水 素 結 合,Asp. NA. FG1β1とLys. の 水 素 結合 を切 断 す る.三 次 構 造 の 変 化 に よ. る α1β2接 触 の 変 化 に つ い て は 図1に. 示 し た.. C末 端 の 三 次 構造 変 化 と 四 次構 造 の 変 化 と の 関 連 は 図2.. C末 端 を修 飾 した ヘ モ グ ロ ビ ンの 結 晶 型 か ら推 論 さ れ. ウマ ・ヘ モ グロ ビンの(A) デ オキ シ型 をβ鎖側 か ら,(B). オ キシ型 をβ鎖 側 か ら,(C). る.9)ヒ トヘ モ グ ロ ビ ンのC末. α鎖側 か らみ. HC3β. 端 のArg. HC3α. とHis. と を酵 素 作 用 に よ り除 い た ヘ モ グ ロ ビ ン,お. た図.α‑ヘ リックスを円筒で表わ しA, B… の番 号 を つ け,C末 端部 の α‑炭素を黒 点で表わ してあ る.機. よ びArg. 能 に関係 す るか,DPG結. シ ミ ドを結 合 させ た ヘ モ グ ロ ビ ン は,と. もに酸素親和. 性 が強 くヘ ム 間 相 互 作 用 を示 さ な い.そ. れ ら のデ オ キ. 合 に関係 する 側鎖 のみ を. 示 して ある.. HC3α. を 除 きCys. F9β. にN‑エ. チ ルサ ク. シ 型 結 晶 は重 常 ヒ トヘ モ グ ロ ビ ン の オ キ シ型 結 晶 と 同 29.
(4) Vol. 14. 生 物 物 理. (30) じで あ り,ウ マ ヘ モ グロ ビンで β鎖C末 断 した もの もオ キ シ型,デ. 端 の2残. の 二 つ の コ ン ホ メ ー シ ョ ン を考 え,tは. 基 を切. オ キ シ型 の 結 晶 と もに 正 常. ヘ モ グ ロ ビ ン の オ キ シ型 結 晶 と同 型 を示 す.こ. No.1 (1974) デ オ キ シ型 に. 相 当 し高 ス ピ ンで リ ガ ン ド低 親 和 性,rは. のよ う. オ キ シ型 に. 相 当 し低 ス ピ ンで 高 親 和 性 で あ る とす る.四. 次構造 に. に し て あ るヘ ム に リガ ン ドが 結 合 して 四 次 構 造 が 変 化. も デ オ キ シ型 に相 当 す る水 素 結 合 で 結 ば れ たTと. オキ. した とき,他. シ 型 に相 当 す る水 素 結 合 の切 れ たRと. 次構. の ヘ ムの リ ガ ン ド親 和 性 が 変 化 す る で あ. ろ う か.Perutz8)は. メ トヘ モ グ ロ ビ ン を部 分 的 に還 元. し,還. 鉄 ヘ ム を持 つ サ ブ ユ ニ ッ トが デ オ. 元 され た2価. キ シ 型 の と き とCO型. 造 が た とえ ばTを と る とそ の 分 子 内 の サ ブ ユ ニ ッ トは 一 般 的 に は 三 次 構造tを と る とい うMonodら12)の 考. の と き と で メ ト型 サ ブ ユ ニ ッ ト. え た よ う なconcerted. に ど の よ う な相 違 が 表 わ れ る か を差 スペ ク トル で 調 べ た.デ. オ キ シ型 で はCO型. nmの. よ リ メ トの630nm,. ピー ク が 長 波 長 側 に ず れ,吸. い る こ とが わ か っ た.こ. Perutzら. 1000. 態 とR状. い る.Bohr効 のC末. mechanismを. 態 と の平 衡 の変 化 と して 説 明 し て. 果 につ い て は,図2Aに. で は 同 一 サ ブ ユ ニ ッ トのAsp. も よ り高 ス ピ ン状 態 に あ り,リ. そ の た めpKが. やESRか く2価. 吸 収 スペ ク トル. 鉄 状 態 で の 酸 素 親 和 性 が高 い が,Cys93が. た 場 合 に は ほ と ん ど高 ス ピ ン と な り同 時 に2価. FG1と. 上 昇 し て い る.オ. 水 素 結 合 を作 り. キ シ型 で は 図2Bの. よ うに 三 次 構 造 の 変 化 か らC末 端 は2つ. ら単 離 β鎖 の メ ト型 は低 ス ピ ンの 割 合 が 多. 切 れ て 自由 に な る が,こ. 安息. 香 酸 水 銀 と結 合 した 場 合 やα 鎖 と結 合 してHbAと. 示 す よ うに β鎖. 端 の ヒ スチ ジ ンの イ ミ ダ ゾー ル 基 は デ オ キ シ 型. あ る こ と を示 す.10)すなわ ち デ オ キ シ 型 で は他 方 の ヘ ム ガ ン ド親 和 性 も減 少 し. 考 え た.. は ヘ テ ロ トロ ピ ッ ク な ア ロ ステ リッ ク効 果. も こ のT状. 収 強 度 が 減 少 して. れ は鉄 が よ り高 ス ピ ン状 態 に. て い る と 考 え られ る.Banerjeeら11)は. を考 え,四. が 低 下 して 水 素 イ オ ン(Bohrプ α 鎖 のC末. なっ 鉄 とし. H9α2と. た と き の 酸 素 親 和 性 が 低 下 し て い る こ と を示 した.. 端 は 図2Cの. の 水素 結合 が. の た め イ ミ ダ ゾー ル基 のpK ロ トン)が. よ う にVal. 放 出 され る.. NA1α2とAsp. の 間 に水 素 結 合 を形 成 して い る が オ キ シ 型 で. は こ れ が 切 れ てN末. 端 の ア ミ ノ基 か ら プ ロ トンが 放 出. さ れ る.有 機 リン 酸 塩 の うち2, 3ジ ホ ス ホ グ リセ リ ン 酸(DPG)の. 結 合 の部 位 が 明 らか で あ る が 図2Aの. よ うに デ オ キ シ型 で は 分 子 の 中心 の 空 洞 内 に あ りβ 鎖 間 を塩 結 合 で架 橋 し,T状 性 を低 下 させ て い る.オ. 態 を安 定 化 し リガ ン ド親 和 キ シ型 で は β 鎖 間 の 間 隙 が 狭. く な る た め分 子 外 に 排出 され る. 4.. 中 間 体 の モ デ ル と して の ハ イ ブ リ ッ ドヘ モ グ ロ ビ ン. ア ロ ステ リ ッ ク効 果 の 典 型 と して 興 味 の 中心 と な っ て い るヘ ム 間 相 互 作 用 は,四 量 体 の サ ブ ユニ ッ トの い くつ か に リガ ン ドが 結 合 した 場 合 に 他 の サ ブ ユ ニ ッ ト の リガ ン ド親 和 性 の 低 下 に よ る と し て理 解 さ れ て い る. ヘ ム が他 の サ ブ ユ ニ ッ トか ら受 け る影 響 を検 出 す る 多 く の試 み が な され て い る.Perutzは. 前 述 のご と くメ. トヘ モ グ ロ ビ ン の 一 部 を ヂ チ オ ナ イ トで 還 元 して 還 元 図4.. (a) ヘ ム鉄 の ス ピン状 態に よ り三 次構造 がtとrと 変化 する.. に. さ れ た ヘ ム の リガ ン ド結 合状 態 の 変 化 に よ る残 っ た メ トヘ ム の 吸 収 スペ ク トル の 変 化 を調 べ た.も. (b) β鎖 が メ トヘ ム を含 む四量体 で α鎖 にO2が 結 合 す る ことによ り三次構造 と四次構 造 が同時に変 化す る.T状 態 の β鎖 間の 実線 は2, 3‑DPGを,他 の 実線 は水素 結合 を表 わす.. 記 半 分 の ヘ ム を一 定 の状 態 に,例. 合 型 に 固 定 す るた め に α鎖 と β鎖 を分 離 して処 理 した 後 再 構 成 した ハ イ ブ リ ッ ドヘ モ グ ロ ビ ンが 用 い られ る. Banerjeeら13)は. こ の よ うに 四 次 構 造 が 変 化 す る とそ の 分 子 内 の他 の. 一 方 の サ ブ ユ ニ ッ トを メ ト型 に した. サ ブ ユ ニ ッ トの 三 次 構造 お よ び リガ ン ド親 和 性 が変 化. 四量 体 の酸 素 平 衡 を測 定 した.α2+β3+. す る と考 え られ る こ とか らPerutzは. 親 和性 はHbAと. デ ル機 構 を考 え た.サ. 図4の. っ と正 確. え ば メ ト型 やNO結. よ うな モ. の 方 が 少 し親 和 性 が 高 か っ た.両. ブ ユ ニ ッ トの 三 次 構 造 にtとr 30. , α3+β2+共 に. 単 離 鎖 と の中 間 に あ る が α3+β2+ 者 と もBohr効. 果 を.
(5) ヘ モ グ ロ ビ ン の リガ ン ド結 合 とサ ブ ユ ニ ッ ト間 相 互 作 用. 示 しnは. α3+β2+で. いpHで は1よ. は1.3,. α2+β3+はpH依. (31). 存性 で低. り大 き い値 を示 した.Brunoriら14)は. 一. 方 の サ ブ ユ ニ ッ トを シ ア ン メ ト型 と し てBanerjeeら とほ ぼ 同 じ効 果 を得 た がnは α+CNβ. で は1.2,. αβ+CN. で1,親 和 性 は両 者 等 しか っ た.Banerjeeら15)は に メ ト型 サ ブ ユ ニ ッ トにF,. CN,. N3を. さら. 結 合 させ た と. き の他 方 の酸 素 平 衡 を測 定 し た.図5に. 示 す よ うに メ. ト型 が 高 ス ピ ンの とき他 方 の ヘ ム の酸 素 親 和 性 は 低 い. またESRの. 測 定 か ら高 いpHで メ ト型 が低 ス ピ ンに な. り易 い条 件(pH約10)で キ シ 型(高. は α3+β2+で. ス ピン)だ. とg=6附. βヘ ム が デ オ. 近 に高 ス ピ ン の 吸 収. が み られ オ キ シ型 で は吸 収 が 消 え る.し で は デ オ キ シ型,オ たHenryとBanerjee16)は NOを. か し α2+β3+. キ シ 型 が 等 しい ピー ク を示 す.ま. 図6.. αNOβ. 6.95.. 結 合 さ せ た ハ イ ブ リッ ドヘ モ グ ロ ビ ン でNOの. ESRに. NMRを. 対 す る β サ ブ ユ ニ ッ トの 影 響 を調 べ た(図6).. β3+が 低 ス ピ ン の と きは α2+NOは. α2+NOの. ハ イ ブ リ ッ ド・ヘ モ グ ロ ビ ン の 室 温 で のESR. スペ ク トル.ヘ. α2+に 不 対 電 子 を 持 つ. DPPH:. ム 濃 度 は0.2mM.. 0.1Mリ. ン酸 緩 衝 液pH. 1,1‑diphenyl‑2‑picrylhydrazyl. radical.. 検 出 法 と し て用 い た 同 種 の 実 験 でOgawa. ら18)は片 方 の サ ブ ユ ニ ッ トを シ ア ン メ ト と した ヘ モ ダ. 単 離鎖 と. 同 じ ピー ク を示 し β3+が高 ス ピ ン の と き は 異 な る型 の. ロ ビ ン を用 い た.図7は. ピ ー ク を示 す.こ. ン に よ る低 磁 場 の ス ペ ク トル で あ る.オ. れ らの こ と か ら彼 らは ヘ ム 間相 互 作. ポ ル フ ィ リ ン の メチ ル プ ロ ト キ シ型 サ ブ ユ. ニ ッ トは こ の領 域 で は は っ き り した ピ ー ク を 示 さ ず. 用 は β か ら αの 方 向 の み に 伝 わ る と い っ て い る.X線 解 析 の 結 果 で は メ ト型 高 ス ピ ンで はヘ モ グ ロ ビ ンの 三. HbIIICNは. 次 ・四 次 構 造 は す で に い わ ゆ るR型. で あ る19).β鎖 が オ キ シ型 か らデ オ キ シ型 に な る と αIII. Banerjeeら. になって い るので. の 結 果 は機 能 変 化 がX線. CNの. 解 析上 の構造変. 化 と直 接 対 応 しな い と解 釈 す べ き だ ろ うか.β. か らα. 定 で,nが. ピー クは 高 磁 場 の方 ヘ シ フ トす る.図7(e)の. はDavisら. ピ ン ラベ ル した ヘ モ グ ロ ビ ンの 種 々 の 一酸. 化 炭 素 飽 和 度 で のESR測. の和. HbII deoxyの‑24ppmの ピー クは β鎖 に よ る も の で ‑18ppm附 近 の ピー ク は α 鎖 に よ る も の で あ る こ と. へ の み 伝 わ る とか な らず し も解 釈 で き な い こ とは 後 で 述 べ る.ス. ほ ぼ αIIICN・βIIO2と αIIO2・βIIICNと. に よ り種 々 の異 常 ヘ モ グロ ビ ン の 測 定 か ら. 推 定 され て い る20).図7(c)で は βII deoxyの. 大 きいヘモ グロ. Hb. が,Hb. ら18)は αIIICN・βIIの αIIICNは βIIが オ キ シ 型 の と き. Yakima,. Hb. chesapeakeな. ど相 互 作 用 の な. い も のは 鋭 い 等 吸 収 点 を示 す17).. deoxyの. ピー ク は. ビ ン は等 吸 収 点 が 存 在 せ ず 中 間体 の存 在 が 考 え られ る. ピー ク の位 置 と変 っ て い な い.Ogawa. はHbIIICNと"変. 化 の な い"ピ. キ シ型 の と き はBis 型,リ した"ピ. ー ク を示 し βIIが デ オ. Tris緩 衝 液 中 で は"変. ン酸 緩衝 液 中 ま た はDPGの ー ク を示 す と した.αII・. は αIIが デオ キ シ 型 の と き,強. 化 の な い". 存 在 下 で は"変. 化. βIIICNの βIIICN. い ア ロ ス テ リ ッ クエ フ. ェ ク タ ー で あ る イ ノ シ トー ル 六 リ ン酸 の 存 在 す る と き の み"変. 化 した"ピ. はHillのnが1よ. ー ク を示 す."変. 化 した"ピ. ータ. り大 き い 状 態 で み られ る こ とか ら,. これ は リガ ン ド結 合 の 中 間 体 に相 当 し,αIIICN・ βIIの 方 が αII・βIIICNよ り中間 体 の構 造 を と り易 い こ とが,先 に の べ たBanerjeeら13)の. 酸 素 平 衝 で α3+β2+のnが. 1.3と 高 い こ とに 関 連 す る の で は な い か と述 べ て い る. 図5.. α2+β3+の. 誘 導 体 のpHに 対 す るlogP1/2の. β3+H2O(+);. α2+β3+F‑(‑△‑△‑);. (‑●‑●‑); ○‑○‑).タ. α2+β3+OH‑(≠); ンパ ク濃 度6mg/ml,. 変 化a2+. また シ ア ン メ トサ ブ ユ ニ ッ トが"変. α2+β3+CN‑ α2+β3+N3‑(‑ 0.1Mリ. 化 し た"ピ ー ク を. 示 す と き デ オ キ シ サ ブ ユ ニ ッ トの ピ ー ク はHb. deoxy. と変 っ て い な い と述 べ て い る.. ン酸お よび硼. Lindstromら21)は. 酸 緩 衝 液,20°.. 31. デ オ キ シヘ モ グ ロ ビ ン のNMRの. 低.
(6) 生. (32). 物. 物. 磁 場 スペ ク トル の ピー ク は リガ ン ドと して ブ チ ル イ ソ. 理. Vol. 14 No.1 (1974). 上 述 の ご と くあ る ヘ ム を メ ト型 に した りNO型. サ イ ア ナ イ ドを 加え て い く と まず β 鎖 に 相 当 す る ピー. にし. て そ れ に対 す る他 の サ ブ ユ ニ ッ トの 影 響 を み て い る こ. ク か ら消 え て 行 く こ とか ら リ ガ ン ドは β鎖 に 先 に 結合. と が 多 い.こ. す る と し て い る.. ム 間 相 互 作 用 を示 す 機 能 と関 連 を持 つ な らば,そ. の よ う な リ ガ ン ド型 で み た 構 造 変 化 が ヘ. 相 手 の サ ブ ユ ニ ッ トが デ オ キ シ 型 の と き,す. れは. なわ ち中. 間 体 の と き と四量 体 中 の 全 サ ブ ユ ニ ッ トが リガ ン ド結 合 型 の と き と で,リ と を示 す.デ. ガ ン ドの解 離 速 度 定 数 が 異 な る こ. オキ シ型の ヘムだ 中間体 中に ある ときと. 他 の サ ブ ユ ニ ッ ト もデ オ キ シ 型 で あ る と き と で 異 な る 構 造 を表 わ し,そ れ が 機 能 の 上 に表 わ れ る な らば デ オ キ シ型 へ の 結 合 速 度 定 数 の相 異 と な る わ け だ が,デ キ シ型 の ヘ ム の 変 化 を測 定 した 報 告 は 少 な い.杉. オ. 田ら. は 側 鎖 を修 飾 した ヘ ム を含 む ヘ モ グ ロ ビ ンの 吸 収 スペ ク トル は ピー クの 波 長 が 互 い に 異 な る こ と22)を利 用 し て α鎖 と β鎖 に異 な る ヘ ム を持 つ ハ イ ブ サ ッ ドヘ モ ダ ロ ビ ン を再 構 成 し だ23).図8に 構 成 単 離 鎖 を重 ね 合 わ せ た も の を対 照 と した ソー レー帯 の差 スペ ク トル を示 す24). デ オ キ シ 型 で は 四 量 体 は 単 離 鎖 よ り ピー クが大 き い こ と が 知 られ て い る が,差 ピ ー ク に 一致 な い.ま. た αNO・ β deoxyの. ン で は,αNOの βNOよ. スペ ク トル の ピ ー クは α 鎖 の. しβ 鎖 の ピー ク の位 置 に は 差 は 認 め られ ハ イブ リ ッ トヘ モ グ ロ ビ. 吸 収 は単 離 した αNOお. り非 常 に 小 さ く,β. β鎖 の吸 収 に 等 しい.α. deoxyの. deoxy・. よび αNO・ 吸収はほぼ単 離. βNOで. トル で大 きな ピ ー ク は み られ な い.こ. は差 スペ ク. れ ら の結 果 か ら,. α鎖 は リガ ン ド結 合 した 中間 体 の とき は単 離 鎖 お よ び リ ガ ン ド結 合 四 量 体 の 両 方 と異 な る 構 造 で(こ. の時 ハ プ. ト グ ロ ビ ン と の結 合 速 度 か ら 四 次構 造 も両 者 と異 な る こ とが示 され た25).),デ. オ キ シ型 中 間 体 は 単 離 鎖 に近. い 構 造 で あ る とい え よ う.β 鎖 は ソ ー レー 帯 で 単 離 鎖 と 異 な る ピー ク を示 す こ とは な い. 二 種 類 の サ ブ ユ ニ ッ トの一 方 の ヘ ム ヘ リガ ン ドを脱 着 さ せ た と き の 三 次,四 SH基. 次構 造 の 状 態 をCys. β93の. の 反 応 性 か ら解 析 した もの にMaedaら26),Anto‑. niniら14)の. 報 告 が あ り,ス. む ヘ モ グ ロ ビン のERSを. ピ ン ラ ベ ル した ヘ ム を含. 測 定 した もの にAsakuraら27). の 報 告 が あ る の で 参 照 され た い. 5.. リ ガ ン ド結 合 の 中 間 段 階 のX線. 解 析. デ オ キ シ 型 とメ ト型 と のX線 解 析 結 果 に 基 くPerutz の説 が正 しい か ど うか中 間 段 階 を確 め る た め,Ander‑ 図7.. 220MHz. NMRス. ペ ク トル.. son28)は. 母 液 に ア ク リル ア ミ ドを加 え て デ オ キ シ型 を. 結 晶 さ せ た.つ. い で ア ク リル ア ミ ドを重 合 させ て 四 次. 構 造 をT状 態 に 固 定 した 後,酸 次 構 造 をr状 32. 素 でヘム を酸化 して三. 態 に し た も の(T;r)のX線. 解 析 を行.
(7) ヘ モ グ ロ ビ ン の リ ガ ン ド結 合 とサ ブ ユ ニ ッ ト間 相 互 作 用. (33). β2接 触 に 起 こ る 歪 み が 最初 の構 造 変 化 で こ の 歪 み は C末 端 がFH間. か ら 出 て 幾 つ か の水 素 結 合 を切 る こ と. に よ り解 消 さ れ,結. 果 と してFH間. な い か と推 論 して い る.ヤ. が狭 くな る の で は. ツ メ ウナ ギ の ヘ モ グ ロ ビ ン. で は 鉄 原 子 の移 動 は 認 め られ る がTyr 型,メ. ト型 と もに ヘ リ ッ ク スF,. 図9.. HCは. デ オキシ. Hの 間 に あ る29).. リガン ド結合 に よるα鎖 三 次構 造 変化 の機 構.こ の変 化 に よ り点 線で示 した水 素結合 が ゆるむ.. 遺 伝 的 ア ミ ノ酸 置 換 に よ り機 能 に異 常 の あ るヘ モ グ ロ ビン のX線 解 析 か ら,構 造 と機 能 と の 関係 を推 定 す る も の と して α1β2接 触 に置 換 の あ るHb Richmond,30) の あ るHb. Hb. Yakima,31)ま. Rainier32)な. Kansas,. たC末. 端 に置 換. どが あ りα また は β の ヘ ム鉄. に 配 位 し てい る ヒ ス チ ジ ン が チ ロ シ ン に 置換 し分 子 の 図8.. 半 分 が メ ト型 に な ったHbMの. プ ロ トヘム とメ ゾヘ ム を持 つ ハイブ リッ ドヘモ ダロビ. ル.αPβMは 四量 体.. 解 析 結 果33)34)も. 報告. さ れ て い る.. ンの 四量体 の吸収 か ら単離鎖 の吸収 を引 い た差 スペ ク ト α鎖 にプロ トヘ ム,β 鎖 に メゾヘ ムを持 つ. 6.. ハ イ ブ リ ッ ドヘ モ グ ロ ビ ン の フ ロー 法 に よ る リガ ン ド結 合 の 解 析 Gibsonら33)は. ン の酸 素 解 離,お な っ た.図9に. 示 す よ うに デ オ キ シ型 と く ら べ て 鉄 原. 子 は ボ ル フ ィ リ ン面 に近 づ きHis ッ ク ス が 引 き よ せ られLeu. F7α. F8α. β2接 触 が 図1に 1α とAsn. G4β. FG5α. に β鎖 の 方 が α鎖 よ り早 く,そ. ム は 鉄 を 中心 と. し く,結. り,ビ. ス(N‑マ. 次 構 造 をRに. 構 造 をtに. した も の(R;t)のX線. HC2はFとHの. Gibsonら. ー テ ル で β鎖 を. は,C末. 端 に ア ミ ノ酸 置 換 の あ る 異 常 ヘ モ. の 結 合 が二 相 性 で あ り,減 速的 で あ るこ と を見 出 し36,) こ れ は波 長 に 関 係 な い こ とか ら α, β鎖 の差 に よ る も. 解 折 で み られ る. の で な く,ま. か し(T;r). の 二 つ の 状 態 に よ る も の で も な く,CO結. 両 ヘ リッ ク ス の間 に あ り,. こ の 間 隙 は む しろ 開 い て い る.Anderson28)は. β鎖 と も. グ ロ ビ ンお よびC末 端 を修 飾 した ヘ モ グ ロ ビンで もCO. 固 定 した もの を還 元 し て三 次. 変 化9)と 逆 に対 応 す る変 化 で あ る.し. 結 合 だ け は 複 雑 で α,. 二 相 性 を示 した.. G. 説 を支 持 す る も の で あ. レ イ ミ ドメ チ ル)エ. 修 飾 し,四. 合 速 度 は そ れ ぞ れの 鎖 へ の最 初 の結 合 速 度 よ. り少 し大 き い.COの. とは接 近 す る が水 素 結 合 は 形 成 しな. れ ら の 変 化 はPerutzの. の解 離 速 度 は そ れ ぞ れ. ヘ モ グ ロ ビン 中 の β鎖 お よび α 鎖 か らの解 離 速 度 に 等. を 右 へ押 し α1. 示 す 変 化 の 方 向 に 変 わ る.Asp. い.こ. で はTyr. 解 離 の 速 度 を測定 した.反 応 は 皆 ほぼ 一 次 反 応 で,常. リ. がヘ ムの上方 のプロ. ピオ ニ ル基 の つ く部 分 を左 に 押 す.ヘ して 傾 き反 対 側 の 下 端 がVal. に よ りFヘ. シ ア ンメ トハ イ ブ リ ッ ドヘ モ グ ロ ビ よび ブ チ ル イ ソサ イ ア ナ イ ドの結 合. たHillのnが. 約2で. あ る こ と か らR,. T. 合速度 の異. な る二 つ 以 上 の 中 間状 態 が存 在 す る の で は な い か と考. α1. え た.CO結 33. 合 速 度 は イ ノ シ トー ル 六 リ ン酸 を加 え る.
(8) 生 物 物 理. (34). 10). と加 速 度 的 曲 線 に 変 わ りそ の形 は 波長 依 存 性 に な る. CO解. 離 速 度 も修 飾 ヘ モ グ ロ ビ ン と正 常 ヘ モ グ ロ ビ ン. とで 異 な る が,そ さい.α. れ はCO結. 11). 合 速 度 の 差 よ りず っ と小. に 一 次 反 応 に従 い 固 有 の速 度(β. 12). 行 なわ. れ て い る.β 鎖 は 単 離 鎖 の と き よ り も 四量 体 中 で は解 離 速 度 が 大 き い.中. 村 ら37)は同 じ試 料 でCOの. 酸 素 の解 離 と同 様 の性 質 を持 ち,CO結 で あ る こ と を示 した.す. 12, 88. M.. F. Leterrier,. 8, 2862 J.P.. and. Will‑. (1969) J. Mol.. R. Banerjee,. J. Mol. Riol., 42, 351 (1969). Amiconi,. Winterhalter:. E. Antonini,. J. Mol.. Biol.,. F. Stetzkowski,. Y. Henry,. R.J.P.. Changeus:. R. Cassoly: G.. Biol., 73, 455 16). Structure. (1965). Brunori,. K.H.. 合 は加 速 度 的. Y. Alpert,. J. Wyman,. R. Banerjee,. 15). Williams:. Biochemisty,. J. Monod,. 14). な わ ち ヘ ム間相 互 作 用 は リガ. ン ドの解 離 速 度 が 変 化 す る よ り も,リ. R. Banerjee,. 13). 解 離は. R.J.P.. 7, 1 (1970). Biol.,. β鎖 か ら独 立. 鎖 ≧ α鎖)で. Smith,. iams:. 鎖 とβ鎖 と に 異 な るヘ ム を持 つ ハ イ ブ リッ ト. 大 き くて も 解 離 はα,. D.W. Bonding,. ヘ モ グロビ ン を用 い,酸 素 解 離 速 度 を測 定 した杉 田 ら23) の 結 果 では,nが. Vol. 14 No.1 (1974). J. Wyman,. 49, 461. Y. Henry:. (1970). J. Mol.. (1973). R. Banerjee:. J. Mol.. Biol., 73, 469. ガ ン ドの結 合 速 (1973). 度 の 変 化 に よ る と こ ろ が 大 き い と考 え られ る.こ. れか. 17). ら ヘ ム 間 相 互 作 用 のヘ ム へ の影 響 は デ オ キ シ型 の 変 化 と して検 出 す る こ とが 重 要 で あ る.し か しAntoniniら38) は αNO・ β, α ・βNOの へ のCO結. 18). 半 リガ ン ド結 合 ヘ モ グ ロ ビ ン. 合 速 度 はデ オ キ シ型 ヘ モ グ ロビ ンへ の 結 合. 19). 20). に な る が,α,. 中 間 体 の数 が8個,解. 21). の リガ ン. lobin. in. Holland. Y.Sugita,. their. reactions Co.,. M.F.. 3). J. Wyman:. Perutz:. 19, 223 4). Nature,. J. Biol.. 6). 7). 8). Hemoglobin with. and. ligands,. 9). E. Bucci, 551. (1965). M.. Nagai,. M.F. bor. Mock,. Jones,. J.S. Olson, Biophys.. N.H.. Res.. S. Bannai,. Y. Sugita(投. 25). S.Bannai,. myog‑. J.J. Bal.. C. Ho:. J, Mol.. Mock,. Q.H. Gibson,. Commun.,. 46, 22. J. Biol. Chem.,. 246,. Y. Yoneyama,. 247,. 6092. T. Nakamura:. (1972). 稿 中) Y. Sugita:. T. Maeda,. J. Biol. Chem.,. 248,. 7527. Biochemistry,. 10,. 1177. Biochem.. Biophys.. S. Ohnishi:. 27). T. Asakura,. H.R.. 228,. 726. (1970). in Protein. Drott:. Res.. (1971). Chemistry,. 44, 1199. 28). L. Anderson:. 29). W.E.. (1971). J. Mol.. Love,. Biol., 79, 495. P.A.. Klock,. W.A.. Hendrickson:. (1973). E.E. Lattman,. E.A.. 502. K.B. (1973). 物 物 理61,. Y. Sugita,. 244, 1651 Perutz: Perutz, Symp.. 20. C. Fronticelli:. Padlan,. Chem.,. 240, PC. J. Biol.. 30). J. Greer:. 31). P.D.. 32). J. Greer, 261. (1969). L.F. Quant.. Ten. 237, 495 Eyck:. Quant.. Biol.,. Cold. 36, 349. Spring. Har‑. (1971). (1972). J. Biol.. Y. Yoneyama:. Nature,. Ward, Symp.. (1972) Cold. Biol., 36, 295,. Spring. Har‑. 34. Biol., 59,. M.F.. J. Mol. Perutz:. 99 (1971). Biol., 74, 57 Nature. (1973). New. Biol., 230,. (1971). 33). J. Greer:. 34). M.F. ture. (1971). J. Mol.. Pulsinelli:. J. Mol.. Perutz, New. P.D.. Biol.,. 59, 107. (1971). Pulsinelli,. Biol., 237,. 259. (1972). H.M.. Ranney:. C.. (1971) 389. (1971) North. London. 白 質 ・核 酸 ・酵 素,18,. 今 井 清 博:生. M.F.. N.H.. R.T.. (1964). 杉 田 良 樹:蛋. Chem.,. (1972). (1971). Chem.,. 24). bor 5). T. Yama‑. (1973). Amsterdam. Advances. Ho:. Biol., 70, 315. Fujiwara,. Lindstrom,. Y. Yoneyama:. Commun., 2). Jones,C.. (1971). 献. Pub.. M.. Biol., 70, 301. Biochem.. 23). 離 お よび 結 合 の 速 度 定数 が32. M‑Brunori:. Shulman,. T.R. Lindstrom,. Y. Sugita,. 26) E. Antonini,. J. Mol.. S. Charache,. 22). 定 す る の は ま だ 困 難 な段 階 に あ る と い え よ う.. 1). R.J.. (1970). Shulman:. Davis,T.R.. Ho:. β鎖 を区別す る と. 個 に も な る の で 電 算 機 を使 用 して もこ れ ら の 定 数 を決. 文. J. Mol.. D.G.. Biol., 60, 101. イ ア ナ イ ドを用 い フ ロー 法39)温 度 ジ ャ ン プ 法40)な ど で. ドが 結 合 す る とR型. R.G.. S. Ogawa,R.G.. dassare,. 区 別 して リ ガ ン ド結 合 の測 定 を,主 として ブ チ ル イ ソサ. に3個. S. Ogawa,. ne:. sonら はα 鎖 と β 鎖 と の ソー レー 帯 の 吸 収 ピー クが2 〜3nm異 な るこ とを利 用 して 四 量 体 中 の α鎖 ,β 鎖 を. ら の 結 果 に よ るT型. S. Charache, 9, 4707. (1972). 速 度 よ り少 し し か 大 き くな い こ と を示 して い る.Gib‑. 行 な っ て い る.彼. J.J. Baldassare, Biochemistry,. Na‑.
(9) ヘ モ グ ロ ビ ン の リ ガ ン ド結 合 とサ ブ ユ ニ ッ ト間 相互 作 用. 35) R. Cassoly, Q.H. Gibson: J.Biol. Chem., 247, 7332 (1972) 36) K. Moffat,J.S. Olson. Q.H. Gibson: J.Biol.Chem., 248, 6387 (1973) 37) T. Nakamura, Y. Sugita,S.Bannai: J.Biol.Chem., 248, 4119 (1973). 38) E.Antonini, M.Brunori ,J.Wyman,R.W.Noble: J.Biol. Chem.,241,3236(1966) 39)J.S. Olson ,Q.H.Gibson: J.Biol, Chem., 247, 1713(1972) 40) F.X.Cole, Q.H.Gibson: J.Biol. Chem.,248, 4998(1973). ABSTRACT. Subunit. Interaction on Ligand. Binding of Hemoglobin. Yoshiki SUGITA. Departmentof Biochemistry, Kanazawa University, Schoolof Medicine. The Preutz model for the cooperativeligand binding and the interactionsbetween hemoglobin subunits is brieflydescribed.Severalresultsare presented indicating thatthe binding of the ligandor changes of spin statesof the irons at some hemes of a tetramer alterthe statesof the otherhemes as detectedby spectrophotometry. ESR and NMR, which support the Perutz model. The importance of describingthe differencein the statesof deoxygenatedhemes between totally deoxygenatedHb and the intermediatesin ligand binding is stressed . Kineticresultssuggestingstingthe pre‑ sence of the intermediatestatesand the kineticparameters for half liganded tetramers are introduced.. 35. (35).
(10)
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