博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博 士 論 文 概 要

論 文 題 目

紡錘体と動原体の形成を制御する 新規因子 Kis1 の解析

Analysis of a novel factor, Kis1, which regulates formation of the spindle and

kinetochores

申 請 者

平井 隼人

Hayato HIRAI

生命医科学専攻 細胞骨格ロジスティクス研究

2018 年 12 月

No. 1

遺 伝 情 報 を 担 う 染 色 体 は 複 製 さ れ た 後 に 娘 細 胞 へ と 均 等 に 分 配 さ れ る 。 こ の 過 程 が 繰 り 返 さ れ る こ と で 同 一 の 遺 伝 情 報 を も つ 細 胞 が 増 殖 す る 。 染 色 体 の 不 均 等 な 分 配 は 、 細 胞 死 あ る い は 細 胞 の が ん 化 の 原 因 と な り 得 る た め 、 染 色 体 が 均 等 に 分 配 さ れ る メ カ ニ ズ ム を 解 明 す る こ と は 生 物 学 的 に も 医 学 的 に も 重 要 な 意 味 を も つ 。 本 研 究 で は 、 微 小 管 の 形 成 に 寄 与 す る 新 規 因 子 の 解 析 を 通 じ て 、 染 色 体 を 均 等 に 分 配 す る た め の 新 た な 分 子 メ カ ニ ズ ム の 一 端 を 明 ら か に し た 。

第 １ 章 の 序 論 で は 、 本 研 究 の 内 容 を 理 解 す る た め に 必 要 な 知 見 に つ い て 記 載 し た 。 第 １ 節 で は 、 複 製 さ れ た 染 色 体 が 分 裂 期 に 娘 細 胞 に 分 配 さ れ る 概 略 を 説 明 し た 。 複 製 さ れ た 染 色 体 は 、 分 裂 期 に 形 成 さ れ る 紡 錘 体 と 呼 ば れ る 装 置 に よ っ て 分 配 さ れ る 。 紡 錘 体 の 主 要 な 構 成 因 子 は 細 胞 骨 格 の ひ と つ で あ る 微 小 管 で あ る 。 第 ２ 節 で は 、 微 小 管 か ら な る 紡 錘 体 が ど の よ う に 形 成 さ れ る の か 概 略 を 説 明 し た 。 現 在 ま で に 、 紡 錘 体 の 形 成 に 寄 与 す る 数 多 く の 因 子 が 発 見 さ れ 、 機 能 の 解 析 が 行 わ れ て い る 。 し か し な が ら 、 未 だ に 発 見 さ れ て い な い 紡 錘 体 制 御 因 子 が 存 在 す る と 考 え ら れ る 。 第 ３ 節 で は 、 そ の よ う な 紡 錘 体 の 形 成 に 寄 与 す る 未 知 の 因 子 を 発 見 す る た め に ど の よ う な 研 究 が 国 内 外 で お こ な わ れ て い る の か 、 そ の 概 略 と 問 題 点 に つ い て 述 べ た 。 こ れ に 対 し て 、 申 請 者 が 所 属 す る 研 究 室 で は 分 裂 酵 母 を 用 い た 遺 伝 学 的 な ス ク リ ー ニ ン グ を 展 開 し て お り 、 同 節 で そ の 概 略 を 説 明 し た 。 ス ク リ ー ニ ン グ で は 、 分 裂 酵 母 細 胞 内 の 微 小 管 構 造 に 異 常 を 示 す 変 異 体 を 多 数 単 離 し て お り 、 そ の な か に は 紡 錘 体 の 中 央 部 分 が 脆 弱 に な る 変 異 体 が 含 ま れ て い た 。 そ の な か の ひ と つ の 変 異 体 に つ い て 原 因 遺 伝 子 を 追 究 し た と こ ろ 、 機 能 未 知 の 新 規 遺 伝 子 で あ る こ と が 判 明 し 、 当 該 遺 伝 子 を そ の 変 異 体 の 表 現 型 か ら k i s 1 (ki ne t oc h o r e a n d s p in d l e de f e c t iv e)と 名 付 け た 。 本 研 究 で は k i s 1 遺 伝 子 が コ ー ド す る タ ン パ ク 質 ( Ki s 1 )が 紡 錘 体 の 形 成 に ど の よ う に 寄 与 す る の か を 明 ら か に す る 目 的 で 、K i s 1 の 機 能 解 析 を 行 っ た 。

第 ２ 章 で は 、 本 研 究 を 遂 行 す る 上 で 使 用 し た 大 腸 菌 株 、 分 裂 酵 母 株 、 使 用 し た 培 地 を 記 載 し た 。 ま た 、 本 研 究 で 用 い た 実 験 手 法 に つ い て 記 載 し た 。

第 ３ 章 で は K i s 1 の 解 析 結 果 に つ い て 記 載 し た 。 第 １ 節 で は 、K i s 1 が 染 色 体 の 均 等 な 分 配 に 必 要 で あ る こ と を 示 し た 。先 行 研 究 の ス ク リ ー ニ ン グ の 過 程 で 、k i s 1 変 異 体 で は 染 色 体 不 安 定 性 を 示 す こ と が 示 唆 さ れ て い た 。 実 際 に 染 色 体 の 分 配 が 不 均 等 に な る か を 調 べ る た め 、第 ２ 染 色 体 の セ ン ト ロ メ ア 部 位 が G F P で 可 視 化 さ れ た 株 を 用 い て 染 色 体 分 配 の 様 子 を 観 察 し た と こ ろ 、k i s 1 変 異 体 で 染 色 体 が 不 均 等 に 分 配 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た 。ま た 、K i s 1 は 分 裂 酵 母 の 生 育 に 必 須 で あ る こ と が 判 明 し た た め 、 進 化 的 に 広 く 保 存 さ れ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 そ こ で 、K i s 1 と 相 同 性 の 高 い 配 列 が 別 の 生 物 種 に み ら れ る か 検 索 し た 結 果 、分 裂 酵 母 の 近 縁 種 内 に 相 同 性 の 高 い 配 列 が 発 見 さ れ た が 、 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ 、 線 虫 、 ヒ ト で は 相 同 性 の あ る 配 列 は 見 つ か ら な か っ た 。

No. 2

k i s 1 変 異 体 で は 紡 錘 体 の 中 央 部 が 脆 弱 に な る 表 現 型 が 既 に 観 察 さ れ て い た が 、

詳 細 は 明 ら か に な っ て い な か っ た 。 そ こ で 第 ２ 節 で は 、 分 裂 前 期 か ら 後 期 ま で 経 時 的 に 紡 錘 体 を 観 察 し た 結 果 を 示 し た 。 観 察 の 結 果 、k i s 1 変 異 体 で は 分 裂 中 期 か ら 後 期 に か け て 、 紡 錘 体 の 太 さ を 保 つ こ と が で き ず 、 伸 長 で き ず に 崩 壊 す る こ と が 判 明 し た 。

第 3 節 で は 、K i s 1 の 細 胞 内 局 在 を 観 察 し 、 そ の 観 点 か ら 機 能 を 推 測 し た 。k i s 1 変 異 体 で は 紡 錘 体 形 成 に 異 常 を 示 し た た め 、K i s 1 が 微 小 管 結 合 タ ン パ ク 質 で あ る 可 能 性 が 予 想 さ れ た 。 そ こ で K i s 1 と G F P（ 緑 色 蛍 光 タ ン パ ク 質 ） の 融 合 タ ン パ ク 質 を 細 胞 内 で 発 現 さ せ 、 そ の 局 在 を 観 察 し た と こ ろ 、 微 小 管 に は 局 在 せ ず 、 間 期 の 細 胞 に お い て １ 点 の ド ッ ト 状 に 観 察 さ れ た 。K i s 1 の 局 在 箇 所 を 特 定 し た と こ ろ 、 動 原 体 お よ び S P B（ 酵 母 の 中 心 体 に 相 当 す る 器 官 ） が 隣 接 す る 位 置 に K i s 1 が 局 在 す る こ と が 判 明 し た 。 し か し な が ら 、 分 裂 期 に は K i s 1 は 局 在 を 消 失 さ せ た 。こ れ ら の こ と か ら 、K i s 1 は 分 裂 期 に は 機 能 せ ず 、間 期 に 動 原 体 あ る い は S P B に 局 在 す る こ と で 紡 錘 体 形 成 に 寄 与 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。

こ れ ら の 結 果 か ら 、K i s 1 は 間 期 に S P B あ る い は 動 原 体 の 構 築 を 促 す こ と に よ っ て 、 分 裂 期 の 紡 錘 体 形 成 を 促 進 す る 可 能 性 が 予 想 さ れ た 。 そ こ で 第 ４ 節 で は

ki s 1 変 異 体 に お い て S P B あ る い は 動 原 体 を 構 成 す る 因 子 の 局 在 に 異 常 が み ら れ

る か を 検 証 し た 。 そ の 結 果 、 主 要 な S P B 構 成 因 子 は い ず れ も 正 常 に 局 在 し た が 、 動 原 体 の 主 要 な 構 成 因 子 の う ち 、 動 原 体 形 成 の 基 点 と な る C n p 1 /C EN P - A（ セ ン ト ロ メ ア 特 異 的 ヒ ス ト ン H 3 バ リ ア ン ト ）、 お よ び 動 原 体 の 内 側 に 位 置 す る M i s 6 / CE N P- I の 局 在 が 消 失 し た 。 以 上 の 結 果 か ら 、K i s 1 は 間 期 に お い て 動 原 体 タ ン パ ク 質 C n p 1 お よ び M i s 6 の 局 在 化 に 必 要 な 因 子 で あ る こ と が 判 明 し た 。

第 ５ 節 で は 、K i s 1 と C n p 1 お よ び M i s 6 の 遺 伝 学 的 相 互 作 用 を 調 べ た 。k i s 1 変 異 体 で C n p 1 お よ び M i s 6 の 局 在 異 常 と 、 紡 錘 体 形 成 異 常 の 2 つ の 症 状 を 示 す こ と か ら 、こ れ ら 2 つ の 異 常 が 独 立 し て 生 じ る の か を 追 究 し た 。m i s 6 変 異 体 に お い

て も k i s 1 変 異 体 と 同 様 に 紡 錘 体 の 形 成 異 常 が 観 察 さ れ た 。 こ の こ と か ら K i s 1 は

M i s 6 お よ び C n p 1 を 局 在 さ せ る こ と を 介 し て 、紡 錘 体 の 安 定 化 に 寄 与 し て い る と

結 論 付 け た 。

M i s 6 お よ び C n p 1 が 局 在 す る た め に は 動 原 体 因 子 の M i s 1 6- M i s 1 8 複 合 体 が 必 要 で あ る こ と 、 お よ び M i s 1 6 - M i s 1 8 複 合 体 は K i s 1 と 同 様 に 間 期 に の み 局 在 す る こ と が 先 行 研 究 に よ り 明 ら か と な っ て い た 。 そ こ で 第 6 節 に お い て 、 K i s 1 と M i s 1 6 - M i s 1 8 複 合 体 の 関 係 性 を 追 究 し た と こ ろ 、両 者 に は 相 互 依 存 関 係 が あ る こ と が 判 明 し た 。さ ら に 、申 請 者 が 所 属 す る 研 究 室 に お い て 、K i s 1 と M i s 1 6- M i s 1 8 複 合 体 が 結 合 す る こ と が 示 さ れ た 。 以 上 の こ と か ら K i s 1 は M i s 1 6 - M i s 1 8 と 複 合 体 を 形 成 す る こ と が 判 明 し た 。

K i s 1 は 動 原 体 タ ン パ ク 質 C n p 1 お よ び M i s 6 の 局 在 制 御 を 介 し て 紡 錘 体 の 安 定

No. 3

化 に 寄 与 す る こ と が 第 ５ 節 で 示 さ れ た 。 動 原 体 の 内 側 に 位 置 す る こ れ ら の タ ン パ ク 質 が ど の よ う に 紡 錘 体 の 安 定 化 に 寄 与 す る の か を 次 に 追 究 し た 。k i s 1 変 異 体 で 紡 錘 体 が 不 安 定 に な る 原 因 と し て 、 動 原 体 と 紡 錘 体 微 小 管 の 接 着 が 不 十 分 で あ る 可 能 性 が 挙 げ ら れ る 。

そ こ で 第 ７ 節 で は 、 動 原 体 と 微 小 管 の 接 着 の 可 否 を モ ニ タ ー す る た め に D i s 1 タ ン パ ク 質 の 局 在 に 着 目 し た 。D i s 1 は 微 小 管 結 合 タ ン パ ク 質 で あ る が 、紡 錘 体 微 小 管 と 動 原 体 が 結 合 す る こ と で 動 原 体 に も 局 在 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。D i s 1 の 挙 動 を 観 察 し た 結 果 、 野 生 型 に 比 べ て ki s 1 変 異 体 に お い て は D i s 1 が 動 原 体 に 局 在 し な い 細 胞 の 割 合 が 増 加 し た 。 こ の こ と か ら 、k i s 1 変 異 体 で は 微 小 管 と 動 原 体 の 接 着 に 欠 陥 が あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。

し か し 、k i s 1 変 異 体 で は 内 側 因 子 が 局 在 を 失 っ て も 、 微 小 管 と 結 合 す る た め に 必 要 な N d c 8 0 な ど の 動 原 体 の 外 側 に 位 置 す る 因 子 は 正 常 に 局 在 し て い た 。そ こ で 第 8 節 で は 、C n p 1 お よ び M i s 6 な ど 内 側 因 子 の 消 失 が 、な ぜ 微 小 管 と 動 原 体 の 接 着 異 常 を も た ら す の か を 追 究 し た 。C n p 1 は 動 原 体 が 形 成 さ れ る セ ン ト ロ メ ア 領 域 の ヌ ク レ オ ソ ー ム を 構 成 す る こ と か ら 、C n p 1 の 消 失 に よ り セ ン ト ロ メ ア の 立 体 構 造 が 野 生 型 に 比 べ て 変 形 し た 可 能 性 が 挙 げ ら れ る 。 そ こ で 、 セ ン ト ロ メ ア の 中 央 領 域（ コ ア セ ン ト ロ メ ア ）と 周 辺 領 域（ ペ リ セ ン ト ロ メ ア)を 蛍 光 タ ン パ ク 質 で 可 視 化 し て 、姉 妹 染 色 分 体 に お け る こ れ ら 2 領 域 の 距 離 を 測 定 し た 。そ の 結 果 、 姉 妹 染 色 分 体 の コ ア セ ン ト ロ メ ア 間 に 生 じ る 距 離 は 野 生 型 に 比 べ て k i s 1 変 異 体 で は 減 少 し た 。 ま た 、 同 一 染 色 体 内 の コ ア セ ン ト ロ メ ア − ペ リ セ ン ト ロ メ ア 間 の 距 離 は 野 生 型 に 比 べ て k i s 1 変 異 体 で は 増 加 し た 。こ の よ う な セ ン ト ロ メ ア の 立 体 構 造 変 化 は 、 ヌ ク レ オ ソ ー ム を 構 成 す る ヒ ス ト ン の 状 態 が 変 化 し た こ と に よ る と 予 想 し た 。 そ こ で ク ロ マ チ ン 免 疫 沈 降 法 に よ り 、 コ ア セ ン ト ロ メ ア に お け る ヒ ス ト ン の 結 合 状 態 を 調 べ た と こ ろ 、k i s 1 変 異 体 で は C n p 1 量 が 減 少 し 、 代 わ り に ア セ チ ル 化 を 受 け た ヒ ス ト ン H 3 量 が 増 加 し た 。ア セ チ ル 化 型 H 3 は D N A と の 静 電 的 結 合 を 弱 め 、 ク ロ マ チ ン 構 造 を 弛 緩 さ せ る 可 能 性 が 指 摘 さ れ て お り 、 そ の 結 果

ki s 1 変 異 体 で は セ ン ト ロ メ ア 構 造 に 歪 み が 生 じ た 可 能 性 が あ る と 考 察 し た 。

以 上 の 結 果 か ら 、K i s 1 は M i s 1 6 お よ び M i s 1 8 と 複 合 体 を 形 成 し て 、 間 期 に 動 原 体 タ ン パ ク 質 M i s 6 お よ び C n p 1 の セ ン ト ロ メ ア 局 在 を 促 進 す る 。C n p 1 は セ ン ト ロ メ ア 構 造 の 維 持 を 介 し て 、 紡 錘 体 と 動 原 体 の 正 確 な 結 合 に 寄 与 す る と 結 論 付 け 、第 ４ 章 で は 、既 存 の 知 見 を 踏 ま え て 、得 ら れ た 結 果 に 対 す る 解 釈 を 記 載 し た 。 本 研 究 で は 、新 規 因 子 K i s 1 が ヒ ス ト ン H 3 バ リ ア ン ト C n p 1 の セ ン ト ロ メ ア へ の 局 在 を 規 定 す る こ と 、C n p 1 ヌ ク レ オ ソ ー ム は セ ン ト ロ メ ア 領 域 を 立 体 的 に 正 し く 構 築 す る こ と 、 お よ び セ ン ト ロ メ ア の 立 体 構 造 の 維 持 が 紡 錘 体 微 小 管 と の 結 合 お よ び そ の 安 定 性 に 寄 与 す る こ と で 、 染 色 体 の 正 確 な 分 配 に 重 要 な 役 割 を 担 う こ と 、 な ど の 新 し い 知 見 が 得 ら れ 、 染 色 体 分 配 メ カ ニ ズ ム の 解 明 に 貢 献 し た 。

Ｎｏ.1

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

氏 名 平井 隼人 印

（2018年 11月 現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

論文

学会発表

○Hayato Hirai, Kunio Arai, Ryo Kariyazono, Masayuki Yamamoto, Masamitsu Sato The Kinetochore Protein Kis1/Eic1/Mis19 Ensures the Integrity of Mitotic Spindle through Maintenance of Kinetochore Factors Mis6/CENP-I and CENP-A.

(PLoS One, 9-11-e111905, 2014)

1. ○平井隼人、仮屋園遼、新井邦生、佐藤政充

スピンドル微小管と動原体を制御する新規遺伝子spm1(kis1)の解析 第 36 回日本分子生物学会、日本・神戸、12 月・2013 年

2. ○平井隼人、仮屋園遼、新井邦生、佐藤政充 紡錘体と動原体を制御する新規遺伝子 kis1 の解析 第 66 回日本細胞生物学会、日本・奈良、6 月・2014 年

3. ○平井隼人、仮屋園遼、新井邦生、佐藤政充

動原体構造とスピンドル微小管の安定化に寄与する新規因子 kis1 の解析 酵母遺伝学フォーラム・第 47 回研究報告会、日本・東京、9 月・2014 年

4. ○平井隼人、仮屋園遼、新井邦生、佐藤政充

Kis1/Mis19 は動原体構造とスピンドル微小管を安定化する 第 32 回染色体ワークショップ、日本・広島、12 月・2014 年

5. ○Hayato Hirai, Ryo Kariyazono, Kunio Arai, Masamitsu Sato

The kinetochore protein Kis1/Eic1/Mis19 ensures the integrity of mitotic spindle through maintenance of kinetochore factor Mis6 and Cnp1

8th International Fission Yeast Meeting, Kobe, Japan, June 2015

6. ○平井隼人、佐藤政充

分裂酵母 CENP-A がセントロメアに呼び込まれるメカニズムの解明 第1回クロマチン動構造ワークショップ、日本・北海道、7 月・2016 年

7. ○平井隼人、佐藤政充

分裂酵母 CENP-A の呼び込みはヒストン H3 のアセチル化修飾により阻害される 第 34 回染色体ワークショップ、日本・千葉、1 月・2017 年

8. ○平井隼人、佐藤政充

分裂酵母 CENP-A がセントロメアに呼び込まれる機構の解明

第 2 回クロマチン動構造ワークショップ、日本・北海道、7 月・2017 年

Ｎｏ.2

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

9. ○平井隼人、佐藤政充

分裂酵母 Mis6/CENP-I はセントロメアにおける CENP-A の維持に寄与する 第 35 回染色体ワークショップ、日本・愛知、12 月・2017 年

10. ○平井隼人、佐藤政充

Mis6/CENP-IはセントロメアからノンコーディングRNAが転写される際にCENP-Aを維持 する

第41回日本分子生物学会、日本・神奈川、11月・2018年