博 士 論 文 概 要
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(2) 骨および関節疾患の克服は全世界で大きな問題になっている。例えば、手や足 の 関 節 の 軟 骨 が 消 失 し て い く 変 形 性 関 節 症 ( o s t e o a r t h r i t i s , O A ) は 、日 本 だ け で も 1 0 0 0 万 人 も の 患 者 が お り 、我 が 国 を 含 め た 先 進 国 で は そ の 有 病 率 が 急 速 に 高 ま っ て い る 。O A の 発 症 は 加 齢 と 共 に 急 増 す る た め 、高 齢 化 社 会 の 大 き な 脅 威 で あ り 、 現在の社会的な要請である総医療費抑制の点からもその克服は重要である。しか し、これら骨および関節疾患については、発症機構が明らかにされておらず、病 気の進行機構についても不明な点が多いため、根本的な治療法がない。 現 在 ま で に 明 ら か に さ れ た OA の 軟 骨 破 壊 に お け る 初 期 の 発 症 機 構 は 、 異 常 な 機械的ストレス（臼蓋形成不全、下肢アライメント不良など）によって亢進した 軟骨マトリックスの破壊である。軟骨は修復能に乏しい組織であるため、破壊さ れた軟骨マトリックスの再生は大きな課題である。軟骨の維持および再生には、 軟骨の形成および破壊機構を明らかにすることが重要であり、軟骨特性を維持し て い る 軟 骨 型 プ ロ テ オ グ リ カ ン の aggrecan (AGC1) や typeⅡ collagen (COL2A1) などの細胞外マトリックスタンパク質、さらにこれらのタンパク質を調節する複 数のタンパク質分子が重要な因子と想定される。 本 論 文 で は 、 OA な ど の 骨 お よ び 関 節 疾 患 の 発 症 に 関 与 す る 二 つ の 重 要 な 軟 骨 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス 分 子 、 c a r t i l a g e l i n k p r o t e i n ( C RT L 1 ) と a s p o r i n ( A S P N ) の 機 能解明を行い、その成果をまとめた。具体的には、これまで転写制御機構が不明 で あ っ た CRTL1 が 軟 骨 形 成 の 主 要 制 御 因 子 で あ る SOX9 に よ り 直 接 転 写 誘 導 さ れ る こ と を 示 し た 。ま た 、ASPN が 軟 骨 の 主 要 成 長 因 子 で あ る T GF-β1 に よ り 転 写 誘 導 さ れ る こ と を 示 し 、新 た に T G F - β 1 に よ る A S P N の 転 写 誘 導 が シ グ ナ ル 伝 達 タ ン パ ク 質 Smad3 を 介 す る こ と を 示 し た 。 さ ら に 、 ASPN に お け る TGF-β1 結 合 部 位 を 特 定 し 、 ASPN に よ る TGF-β1 活 性 抑 制 機 構 を 解 明 し た 。 第１章では、軟骨形成における軟骨細胞外マトリックス分子の役割を概説する ことにより、本研究の意義と役割を示した。 第 2 章では、本研究で用いた主な実験方法について説明した。すなわち、プラ ス ミ ド DNA の 抽 出 、 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 方 法 、 PCR に よ る 遺 伝 子 増 幅 方 法 、 real-time PCR 法 、 細 胞 培 養 法 な ど に つ い て 記 述 し た 。 第 3 章 で は 、軟 骨 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス の 主 要 分 子 の 一 つ で あ る C RT L 1 の 転 写 調 節 機 構 の 解 明 を 行 っ た 。 具 体 的 に は 、 軟 骨 形 成 の 主 要 制 御 因 子 で あ る SOX9 の 単 独 導 入 に よ り 、非 軟 骨 系 株 化 細 胞 で C R T L 1 m R N A の 転 写 が 誘 導 さ れ る こ と 、ま た 、 S O X 9 の c o - a c t i v a t o r で あ る S O X 5 、S O X 6 を コ ー ド す る 遺 伝 子 ( L - S O X 5 , S O X 6 ) と SOX9 を コ ー ド す る 遺 伝 子 (SOX9) と を 同 時 に 導 入 す る こ と に よ り CRTL1 mRNA の 転 写 誘 導 が 促 進 さ れ る こ と を 示 し た 。株 化 細 胞 だ け で な く 、ヒ ト 間 葉 系 幹 細 胞 、 皮 膚 繊 維 芽 細 胞 に お い て も SOX9 を 単 独 導 入 す る こ と に よ り CRTL1 mRNA の 転 写 が誘導されることを示した。しかし、ヒト間葉系幹細胞、皮膚繊維芽細胞では培 養 方 法 に よ っ て 反 応 が 異 な り 、 ペ レ ッ ト 培 養 で は SOX9 の 単 独 導 入 と L-SOX5、 No.1.
(3) SOX6 お よ び SOX9 の 同 時 導 入 で CRTL1 mRNA の 転 写 量 に 大 き な 差 が 見 ら れ な か っ た の に 対 し 、よ り 生 体 内 の 状 態 に 近 い 培 養 法 で あ る 3 D 培 養 で は S O X 9 の 単 独 導 入 よ り L-SOX5、 SOX6 お よ び SOX9 の 同 時 導 入 で CRTL1 mRNA の 転 写 量 が 著 し く 上 昇 し た 。 さ ら に 、 RNA 干 渉 法 を 用 い て SOX9 mRNA の 転 写 を 抑 制 し た と こ ろ 、 CRTL1 mRNA の 転 写 が 低 下 し た 。 そ こ で 、 CRTL1 の プ ロ モ ー タ ー 解 析 を 行 い 、 CRTL1 が SOX9 に よ っ て 直 接 転 写 制 御 さ れ る か ど う か を 調 べ た 。 CRTL1 と SOX9 の 同 時 導 入 に よ り C R T L 1 の 転 写 活 性 が 上 昇 し 、S O X 9 が C R T L 1 を 直 接 転 写 誘 導 す る こ と を 示 し た 。 ま た 、 CRTL1 の 5’非 翻 訳 領 域 (+120－ +126) に 存 在 す る 7 塩 基 の S O X 9 結 合 部 位 ( C A C A A A G ) を 同 定 し 、ゲ ル シ フ ト 法 を 用 い て 、特 定 し た S O X 9 結 合 部 位 に S O X 9 が 直 接 結 合 し 、C R T L 1 を 転 写 制 御 す る こ と を 示 し た 。以 上 よ り 、 C RT L 1 遺 伝 子 産 物 の 不 足 あ る い は 過 剰 な 蓄 積 に よ る 骨 お よ び 関 節 疾 患 の 発 症 お よ び 進 行 を SOX9 遺 伝 子 発 現 制 御 に よ り 抑 制 で き る 可 能 性 を 示 唆 し た 。 第 4 章 で は 、OA の 相 関 解 析 に よ り 同 定 さ れ た 疾 患 感 受 性 遺 伝 子 、 ASPN の 組 織 発 現 に つ い て 検 討 し た 。 具 体 的 に は Aspn の in situ hybridization を 行 い 、 組 織 お よ び 肢 の 関 節 に お け る A s p n m R N A の 転 写 部 位 を 確 認 し た 。免 疫 組 織 染 色 を 行 い 、 組 織 お よ び 肢 の 関 節 に お け る ASPN タ ン パ ク 質 の 発 現 を 確 認 し た 。 関 節 軟 骨 に A S P N の 発 現 は 認 め ら れ な か っ た が 、椎 骨 や 長 管 骨 の 軟 骨 膜 に 発 現 が 認 め ら れ た 。 ま た 、 Aspn mRNA の 組 織 分 布 は 、 Aspn と 同 じ ク ラ ス I の small leucine-rich proteoglycan (SLRP) family に 属 す る decorin (Dcn) お よ び biglycan (Bgn) mRNA の 組織分布と部分的に重複することを確認した。以上より、構造的に類似したクラ ス I SLRP が 機 能 的 に も 類 似 し 、 互 い の 機 能 を 補 っ て い る 可 能 性 を 示 唆 し た 。 第 5 章 で は 、 TGF-β が DCN お よ び BGN の 転 写 を 制 御 す る こ と か ら TGF-β に よ る ASPN の 転 写 制 御 に つ い て 検 討 し 、 TGF-β 添 加 に よ り ASPN mRNA の 転 写 が 誘 導 さ れ る こ と を 示 し た 。 ま た 、T G F - β 1 添 加 に よ る A S P N m R N A の 転 写 量 の 経 時 的 な 変 化 に つ い て 検 討 し た と こ ろ 、ASPN は TGF-β1 添 加 後 3-6 時 間 で 転 写 上 昇 が 認 め ら れ 、 24 時 間 ま で 経 時 的 に 上 昇 す る こ と を 確 認 し た 。 ま た 、 TGF-β I 型 受 容 体 の キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 で あ る SB431542 を 作 用 さ せ 、 TGF-β1 添 加 に よ る ASPN mRNA の 転 写 に つ い て 検 討 し た と こ ろ 、 SB431542 存 在 下 で は TGF-β1 添 加 に よ る ASPN mRNA の 転 写 が 抑 制 さ れ た 。 つ ぎ に 、 TGF-β シ グ ナ ル の 下 流 分 子 で あ る Smad2、 Smad3 の 低 分 子 干 渉 RNA (siRNA) を 用 い て 、 TGF-β1 添 加 に よ る ASPN mRNA の 転 写 に つ い て 検 討 し た 。一 般 に S m a d 2 と S m a d 3 は 類 似 し た 役 割 を 担 う と 考 え ら れ て い る が 、s i S m a d 3 を 作 用 さ せ た 場 合 に の み T G F - β 1 添 加 に よ る A S P N m R N A の 転 写 が 著 し く 抑 制 さ れ た 。 ま た 、 Smad3 の 強 制 発 現 に よ り ASPN mRNA の 転 写 が 有 意 に 上 昇 し た 。 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ を 行 い 、 siSmad3 を 作 用 さ せ た 場 合 に は TGF-β1 添 加 に よ る ASPN タ ン パ ク 質 の 発 現 量 が 低 下 し 、 Smad3 を 強 制 発 現 さ せ た 場 合 に は ASPN タ ン パ ク 質 の 発 現 量 が 上 昇 す る こ と を 確 認 し た 。 さ ら に 、 ヒ ト正常関節軟骨細胞に対してタンパク合成阻害剤であるシクロヘキシミド、ある No.2.
(4) い は RNA 合 成 阻 害 剤 で あ る ア ク チ ノ マ イ シ ン D を 作 用 さ せ た と こ ろ 、TGF-β1 添 加 に よ る ASPN mRNA の 転 写 お よ び ASPN タ ン パ ク 質 の 発 現 が 抑 制 さ れ た 。 こ の こ と か ら 、T G F - β 1 添 加 に よ る A S P N m R N A の 転 写 お よ び A S P N タ ン パ ク 質 の 発 現 に は TGF-β1 添 加 に よ っ て 発 現 す る 未 知 の タ ン パ ク 質 が 転 写 因 子 と し て 必 要 と さ れ る こ と を 示 し た 。以 上 よ り 、T G F - β 1 は S m a d 3 を 介 し て 遺 伝 子 発 現 制 御 の 段 階 、 と く に 転 写 段 階 で ASPN の 調 節 を 行 っ て お り 、 TGF-β1 お よ び Smad3 に よ る ASPN の転写過程を抑制することによって、変形性の骨および関節疾患の進行を抑制で きる新たな可能性を示唆した。 第 6 章 で は 、固 相 結 合 法 を 用 い て 、3 73 個 の ア ミ ノ 酸 残 基 か ら な る マ ウ ス ASPN タ ン パ ク 質 が TGF-β1 に 直 接 結 合 す る こ と を 示 し た 。 ASPN と TGF-β1 と の 結 合 中 心 を 特 定 す る た め 、 3 種 類 (N 末 端 、 中 央 部 、 C 末 端 ) の ASPN 部 分 タ ン パ ク 質 を 作 製 し た 。 部 分 タ ン パ ク 質 と TGF-β1 の 結 合 の 強 さ は 、 部 分 タ ン パ ク 質 添 加 に よ る ASPN と TGF-β1 の 結 合 阻 害 に よ り 評 価 し た 。 各 々 の 結 合 阻 害 能 を 比 較 し た と こ ろ 、1 5 9 番 目 か ら 2 8 4 番 目 の ア ミ ノ 酸 領 域 の 部 分 タ ン パ ク 質 ( P 1 5 9 - 2 8 4 ) が 最 も 強 く 阻 害 し た 。さ ら に 、P 1 5 9 - 2 8 4 領 域 に つ い て 3 種 類 の 部 分 タ ン パ ク 質 を 作 製 し 、 阻 害 能 を 比 較 し た と こ ろ 、 159 番 目 か ら 205 番 目 の ア ミ ノ 酸 領 域 の 部 分 タ ン パ ク 質. (P159-205) が 最 も 強 く 阻 害 し た 。 す な わ ち 、 ASPN と TGF-β1 結 合 中 心 が. P 1 5 9 - 2 0 5 領 域 に 存 在 す る こ と を 特 定 し た 。さ ら に 、特 定 し た 結 合 部 位 ( P 1 5 9 - 2 0 5 ) の ペ プ チ ド を 細 胞 に 添 加 す る こ と に よ り TGF-β1 に よ る AGC1 お よ び COL2A1 の 転 写 誘 導 が 有 意 に 低 下 し た 。 す な わ ち 、 ASPN が TGF-β1 と 結 合 す る こ と に よ り 、 T G F - β 1 に よ る 軟 骨 特 異 的 遺 伝 子 の 転 写 誘 導 を 抑 制 し 、軟 骨 細 胞 分 化 の 促 進 を 妨 げ る こ と を 示 し た 。 A S P N は 、 i n v i t ro 実 験 系 に お い て 単 独 あ る い は t y p e Ⅱ c o l l a g e n 存 在 下 で は TGF-β1 の Ⅱ 型 受 容 体 (TβRⅡ ) へ の 結 合 を 阻 害 し な い 。 し か し 、 ヘ パ リ ン ／ ヘ パ ラ ン 硫 酸 存 在 下 で TGF-β1 の TβRⅡ へ の 結 合 を 阻 害 し た 。 ヘ パ リ ン ／ ヘ パ ラ ン 硫 酸 は TGF-β を 多 量 体 化 す る こ と に よ り シ グ ナ ル 伝 達 を 促 進 す る と 考 え ら れ 、 ASPN が TGF-β1 と 結 合 す る こ と に よ り 、 ヘ パ リ ン ／ ヘ パ ラ ン 硫 酸 に よ る T G F - β の 多 量 体 化 を 妨 げ 、シ グ ナ ル 伝 達 を 抑 制 し て い る 新 た な 可 能 性 を 示 唆 し た 。 第 7 章 で は 、 本 研 究 を 総 括 し た 。 本 研 究 で は SOX9 が 既 知 の AGC1 や COL2A1 だ け で な く 、新 た に CRTL1 を 直 接 転 写 誘 導 す る こ と を 示 し た 。こ れ に よ り 、主 要 な 軟 骨 マ ト リ ッ ク ス 分 子 に は SOX9 に よ る 共 通 の 転 写 制 御 機 構 が 存 在 す る こ と が 強 く 示 唆 さ れ 、S O X 9 は 軟 骨 再 生 の 強 力 な ツ ー ル と な り 得 る こ と を 示 し た 。ま た 、 A S P N は T G F - β 活 性 を 抑 制 す る こ と が 知 ら れ て い た が 、本 研 究 で は T G F - β が A S P N の 発 現 を 誘 導 し 、A S P N と T G F - β 1 の 間 に ネ ガ テ ィ ブ フ ィ ー ド バ ッ ク 機 構 が 存 在 す る こ と を 示 し た 。 本 研 究 で 特 定 し た ASPN と TGF-β1 と の 結 合 部 位 を 標 的 と し た 抗 A S P N 抗 体 は 、O A で 亢 進 し た A S P N の 機 能 を 抑 制 し 、破 綻 し た 恒 常 性 維 持 機 構 を 正 常 化 さ せ る 可 能 性 が あ り 、 OA の 発 症 お よ び 進 行 を 抑 制 す る 新 た な 治 療 法 の 開発が期待できる。 No.3.
(5) Ｎｏ.1. 早稲田大学 氏 名. 稲葉. 郁代. 博士（工学）. 学位申請. 研究業績書. 印 （２０１１年. 種 類 別. 題名、. 発表・発行掲載誌名、. 発表・発行年月、. １月. 現在）. 連名者（申請者含む）. ① 論文 ○ 1.. 2.. Ikuyo Kou, Masahiro Nakajima, and Shiro Ikegawa. Binding Characteristics of Osteoarthritis-associated Protein Asporin, J. Bone Miner. Metab., 28(4), July 2010, 395-402. Masahiro Nakajima, Atsushi Takahashi, Ikuyo Kou, Cristina Rodriguez-Fontenla, Juan J Gomez-Reino, Tatsuya Furuichi, Jin Dai, Akihiro Sudo, Atsumasa Uchida, Naoshi Fukui, Michiaki Kubo, Naoyuki Kamatani, Tatsuhiko Tsunoda, Konstantinos N Malizos, Aspasia Tsezou, Antonio Gonzalez, Yusuke Nakamura, and Shiro Ikegawa. New Sequence Variants in HLA class II/III Region Associated with Susceptibility to Knee Osteoarthritis Identified by Genome-wide Association Study, PLoS One., 5(3), March 2010, e9723.. ○ 3. Seijiro Mori, Ikuyo Kou, Hidenori Sato, Mitsuru Emi, Hideki Ito, Takayuki Hosoi, and Shiro Ikegawa. Nucleotide Variations in Genes Encoding Carbonic Anhydrase 8 and 10 Associate with Femoral Bone Mineral Density in Japanese Female with Osteoporosis, J. Bone Miner. Metab., 27(2), March 2009, 213-216. ○ 4. Seijiro Mori, Ikuyo Kou, Hidenori Sato, Mitsuru Emi, Hideki Ito, Takayuki Hosoi, and Shiro Ikegawa. Association of Genetic Variations of Genes Encoding Thrombospondin, Type 1, Domain-containing 4 and 7A with Low Bone Mineral Density in Japanese Women with Osteoporosis, J. Human Genet., 53(8), August 2008, 694-697. ○ 5. Ikuyo Kou, Masahiro Nakajima, and Shiro Ikegawa. Expression and Regulation of the Osteoarthritis-associated Protein Asporin, J. Biol. Chem., 282(44), November 2007, 32193-32199. 6. Masahiro Nakajima, Hideki Kizawa, Masao Saitoh, Ikuyo Kou, Kohei Miyazono, and Shiro Ikegawa. Mechanisms for Asporin Function and Regulation in Articular Cartilage, J. Biol. Chem., 282(44), November 2007, 32185-32192..
(6) Ｎｏ.2. 早稲田大学 種 類 別. 題名、. 博士（工学）. 学位申請. 発表・発行掲載誌名、. 研究業績書. 発表・発行年月、. 連名者（申請者含む）. 7. Hideki Kizawa, Ikuyo Kou, Aritoshi Iida, Akihiro Sudo, Yoshinari Miyamoto, Akira Fukuda, Akihiko Mabuchi, Akihiro Kotani, Akira Kawakami, Seizo Yamamoto, Atsumasa Uchida, Kozo Nakamura, Kohei Notoya, Yusuke Nakamura, and Shiro Ikegawa. An Aspartic Acid Repeat Polymorphism in Asporin Inhibits Chondrogenesis and Increases Susceptibility to Osteoarthritis, Nat. Genet., 37(2), February 2005, 138-144. ○ 8. Ikuyo Kou, and Shiro Ikegawa. SOX9-dependent and -independent Transcriptional Regulation of Human Cartilage Link Protein, J. Biol. Chem., 279(49), December 2004, 50942-50948. 9. Toshiyuki Ikeda, Satoru Kamekura, Akihiko Mabuchi, Ikuyo Kou, Shoji Seki, Tsuyoshi Takato, Kozo Nakamura, Hiroshi Kawaguchi, Shiro Ikegawa, and Ung-il Chung. The Combination of SOX5, SOX6, and SOX9 (the SOX trio) Provides Signals Sufficient for Induction of Permanent Cartilage, Arthritis Rheum., 50(11), November 2004, 3561-3573. ② 総説. なし. ③ 講演. 1. 腰椎椎間板ヘルニアの全ゲノム相関解析、 第 53 回日本人類遺伝学会、横浜、 講演要旨集. p. O-009、2008 年 9 月.. 唐杉. 樹、三宅 敦、川口 善治、三上 靖夫、千葉. 飯田. 有俊、中島. 正宏、黄. 戸山. 芳昭、水田. 博志、池川 志郎. 一裕、古市 達哉、. 郁代、岸川 昭太郎、木村 友厚、久保 俊一、. 2. Osteoarthritis (OA) の疾患感受性遺伝子アスポリン (asporin) の機能解析、 第21回日本整形外科学会基礎学術集会、長崎、 講演要旨集 稲葉. p. S801、2006年10月.. 郁代、中島. 正宏、宮本 恵成、池川 志郎. 3. SOX9-dependent and SOX9-independent transcriptional regulation of human cartilage link protein, 26th Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research, Seattle USA, Abstract p.188, 2004 年 10 月. Ikuyo Kou, and Shiro Ikegawa.
(7) Ｎｏ.3. 早稲田大学 種 類 別 ③ 講演. 題名、. 博士（工学） 発表・発行掲載誌名、. 学位申請. 研究業績書. 発表・発行年月、. 連名者（申請者含む）. 4. SOX9 は Cartilage Link Protein 遺伝子の 5'UTR のエンハンサー配列に作用して、その 転写を活性化する、 第18回日本整形外科学会基礎学術集会、福岡、 講演要旨集 黄. p. S1107、2003年10月.. 郁代、池田 敏之、成田 彩、馬淵 昭彦、星 和人、鄭 雄一、木村 友厚、. 池川 志郎 ④ 著書 ⑤ その他. なし (論文) 1. Tomohiko Murakami, Atsushi Saito, Shin-ichiro Hino, Shinichi Kondo, Soshi Kanemoto, Kazuyasu Chihara, Hiroshi Sekiya, Kenji Tsumagari, Kimiko Ochiai, Kazuya Yoshinaga, Masahiro Saitoh, Riko Nishimura, Toshiyuki Yoneda, Ikuyo Kou, Tastuya Furuichi, Shiro Ikegawa, Masahito Ikawa, Masaru Okabe, Akio Wanaka, and Kazunori Imaizumi. Signalling Mediated by the Endoplasmic Reticulum Stress Transducer OASIS is Involved in Bone Formation, Nat. Cell Biol., 11(10), October 2009, 1205-1211. 2. Ching-Lung Cheung, Benjamin Yick-Yeung Chan, Vivian Chan, Shiro Ikegawa, Ikuyo Kou, Heidi Ngai, David Smith, Keith Dip-Kei Luk, Qing-Yang Huang, Seijiro Mori, Pak-Chung Sham, and Annie W.C. Kung. Pre-B-Cell Leukemia Homeobox 1 (PBX1) Shows Functional and Possible Genetic Association with Bone Mineral Density Variation, Hum. Mol. Genet., 18(4), February 2009, 679-687. 3. Kohtaro Kirimura, Masashi Yoda, Ikuyo Ko, Yuichi Oshida, Kouichiro Miyake, and Shoji Usami. Cloning and Sequencing of the Chromosomal DNA and cDNA Encoding the Mitochondrial Citrate Synthase of Aspergillus niger WU-2223L, J. Biosci. Bioeng., 88(3), May 1999, 237-243. (注). 結婚の前後で黄 郁代 (Ikuyo Ko または Ikuyo Kou) と稲葉 郁代 (Ikuyo Inaba) と 発表時の名前に相違があるが、同一人物による研究業績である。 (以上).
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