博 士 （ 農 学 ） 竹 末 信 親
学 位 論 文 題 名
オ リ ゴ 糖 DFA IV の Bacillus sztbtilis に よ る 1 菌 株 生 産 系 の 構 築
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
di‑D‑fructofuranosyl2，6｜：2｜，6anhydride（DFAIりは難消化性のオリゴ糖であり，その機能とし て タ イ ト ジ ャ ン ク シ ョ ン を 開 放 す る こ と でCaやMg，Znな ど の ミ ネ ラ ル 吸 収 を 促 進 す る こ と や 腸 内 細 菌 に よ る 資 化 を 受 け 有 機 酸 へ と 変換 され るこ と が知 られ てい る． こ れら の機 能 か らDFAIVは プ レ パ イ オ テ イ ク ス の 素 材 と し て 期 待 さ れ て お り ， そ の大 量生 産 系の 構築 が 求め られ て いる ．DFAIVは1evan（fructoseがp‐2，6結 合し たフ ラク タン ） からDFAIV合成酵 素levanfr11CtotranSferaSe（EC4．2．2．16；LFTaSe）の働きによって合成される．leVanはSucroSeか らlevanSucraseの 働 き に よ っ て 合 成 さ れ る ．当 研究 室に お いてLFTaseを コー ド する 遺伝 子 孵 は 既 に ク 口 ー ニ ン グ さ れ ， そ の 大 腸 菌 に おけ る大 量発 現 系も 構築 され てい た ．し かし ， DFAIVの 大 量 生 産 に は ， そ の 基 質 で あ る1eVanが 長 鎖 高 分 子 体 で あ る た め 回 収 操 作 が 困 難 で あ る と い う 問 題が 残っ てお り ，こ の問 題を 解決 し ，DFAIV大量 生産 を可 能に す るた めに ， 単一培養系によるsucroseからのDFAIV生産に取り組んだ，
1．1菌株によるDFA IV生産系の構築
levan生 産 菌 の 中 か らBacillus subtilis 168を宿 主 とし て選 択し た ．IPTG誘 導に よっ て Arthrobacter nicotinovorans GS‑9由来 の孵 を発現させるプラスミドpLFT‑Gを作製して，ロ，
subtilislp LFT‑Gの 培養上清にLFTaseを産生さ せた．その後，Terrific brothを使用することで LFTaseの 生 産 量 が 上 昇 す る こと が分 かり ， その 培養 中に ，sucroseを 添 加す るこ とで ，培 養 上 清 にDFA IVが 生 産 さ れ る こ と を 示 し た ． こ の 際 の 培 養 上 清 のLFTase活 性 は最 大 で0.062 U/mlで あ り ， 培 養96時 間 後 に20.5 g/lのDFA IVが 生 産 さ れ た ． 一 方 で ， 培 養96時 間 後 の 上清 に53.9飢のsucroseが残 存し て おり ，添 加。 したsucroseの27.9％が 利用 され ず に培 地中 に 残 存 し た ，sucrose消 費 量 に 対 す るDFA IV生 産 量 の 重 量 収 率 は14.7％ で あ っ た ． 次 に ， 高 価 な 誘 導 剤 で あ るIPTGを 用 い ず にDFA IV生 産 を 可 能 に す る た め ， 本 生 産 系 の 基 質 で あ るsucroseに よ っ て 誘 導 可 能 な 圻 遺 伝 子 発 現 ベ ク タ ーpLFT‑Sを 構 築 し た ，pLFTS はsacB (levansucrase遺 伝 子） のプ ロモ ータ ー配列および分泌シグナル をコードする配列を合 んでいる，坂口フラ スコを用しゝた培養ではぢ ． subtilis/p LFT‑Sの培養上清にDFA IVが生産さ れ た が ， 一 方 で ， ジ ャ ー フ ァ ー メ ン タ ー を 用 い た培 養 では ，DFA IVは 生産 され ず， その 原 因 が 消 泡 剤 の 添 加 で あ る と 考 え た ． そ こ で ， 起 泡性 の 低い 培地 に変 更 し， 再び ジャ ーフ ァ ‑ 1262ー
ー メ ン タ ー を 用 い てDFA IVの 直 接 生 産 を 試 み た 結 果 ， 培 養96時 間 後 に22.8gnのDFA IV が 生 産 さ れ た ， し か し ， 培 地 中 に は 添加 量 の29.5％ に 相当 す る53.5餅 のsucroseが 残 存 し て お り ，DFA IV生 産 の 改 善 に はsucroseか ら のlevan生 産 の 促 進が 必 要 で ある と 考 え た，
2．調節因子degQの追加導入がlevanおよびDFA IV生産に与える影響
ぢ ． subtilisにお けるsacBの 発現は 調節因 子DegQによ って正 に制御 される ．しか し，本 研 究の宿 主ぢ，subtilis 168に おいてdegQの発現 レベル は低く 抑えら れている ことが 報告されて お り， 宿 主 の 細胞 内 にぬgQを効率よ く発現 させる ことを 試みた ，出g・Q高発現 変異（ ぬ飽3の を 導入 し た ぬg・Q遺 伝 子（ 以 下 ぬ 飽36遺 伝 子と 呼 称 ） を作 製 し ，pHT43ま たは折 発現ベク タ ー に挿 入 し た ，levan生 産に 対 す る 趣・Q追加 導入の 影響を 調べた 結果，ぬg・Q36遺 伝子を 含 むB．ぷ甜6ffzおりHT−D36はコントロール株B．ぷ 6釘仏/pHT43に比べ，sucrose消費速度，および levan生 産 速 度の 著 し い 上昇 を 示 し た，2株の 最終的 なレバ ン生産 量に差は 見られ なかっ た．
IPTG誘 導 型 の 珈 発 現 ベ ク タ ー を 用 い たDFAIV生 産 に お い て カg・Qj6遺 伝 子 を 含 むB． ぷ釘6灯ぬノpLFT―GD36は，コントロール株ぢ．JめガzむノpLFT‐Gに比ベsucrose消費速度，DFAIV 生 産 速 度 の上 昇 を 示 し， ま た ，B．s餅6灯 ぬ ノpLFT‐GD36の 培 養72時 間 後 のDFAIV生 産 量は ぢ．ぷ甜6f釘おノpLFT−Gの1，86倍に増加した．さらに，sucroSe誘導型の発現ベクターを用いたDFA IV生 産 に お いて も ， 出g・Qゴ6遺 伝 子を 含 むB．sM6釘仏/pLFT‐SD36は ，コン トロー ル株ぢ ． J甜6ガ 仏/pLFT−Sに 比 ベ ，sucrose消 費 速 度 ，DFAIV生 産速 度 の 上 昇を 示し，DFAIV生産 量も 増 加し た ． 以 上の 結 果より ，B．ぷ 甜6ガぬ168への ぬgQ追加 導入がsucroseからのlevan生産 を 促進すること，また，DFAIV生産を増強することを示した．
3． 直接 生 産 系 の課 題 と そ の対 策
本 研 究 で構 築 し たDFA IV直 接 生 産系 の課 題とし て培地 中のglucose蓄 積に着 目した ．levan が生 成 さ れ る際 には1分 子のsucroseから1分 子のglucoseが遊離す る，B．subtilis/pLFT‑GD36 を用 い た 培 養に お い て ，sucroseを250 g/l添 加 した 条 件 で は培 養96時 間後の 上清に 約120凹 のglucoseが 蓄 積 し た ． 高 濃 度のglucoseがlevan合 成 を 阻害 す る と の知 見 か ら ，蓄 積 す る glucoseの変 換 を 試 みた ．glucoseをgluconic acidに 変換す るglucose oxidaseをDFA IV直 接 生 産 系 に 添 加 し た と こ ろ ， 培 地 中のglucose蓄 積 が 軽減 さ れ ， 培養72時間 後 ， お よぴ96時 間後 のDFA IV生産 が 非 添 加の 条 件 に 比ベ 増 加 し た， こ の 結 果か らglucose oxidaseの添 加に よるglucose変 換 がDFA IV生 産 を 増加 さ せ る こと を 示 し た．
以上， 本研究 ではB． subtilisを宿 主とし ，折遺伝 子を発 現させ ること で単一 培養系による sucroseから のDFA IV生産 を 可 能 にし た ． ま た，degQ追 加 導 入 によってsucroseから のlevan 生 産 が 促 進 可 能 で あ る こ と や ，DFA IV生 産 が 増強 さ れ る こと を 示 し た． さ ら に ，glucose oxidaseの添 加 に よ って 培 地 中 に蓄 積 し たglucoseを 除 去 す るこ と で ，DFA IV生 産 の さ らな る増 強 が 可 能で あ る こ とを 示 し た ，今 後，levansucraseおよ びLFTaseの 生産を 増強させ た生 産株 の 構 築 や培 養条件 の最適 化，さ らにはglucose oxidaseの利 用など の改善 策を積 み重ね る ことでDFA IV生産性 の向上 は十分 可能で あると 考えら れる．
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学位論文審査の要旨
主査 教授 浅野行蔵 副査 教授 木村淳夫 副査 准教授 曾根輝雄 副査 助教 田中みち子
副査 名誉教授 冨田房男（放送大学北海道学習 センター長）
学 位 論 文 題 名
オリゴ糖 DFA IV のBacillus sztbtilis による 1 菌株生産系の構築
本 論文は ，本文119頁， 図33，表4，8章からなり，参考論文1編が付されている，
論 文 審 査 内 容
di‑D‑fructofuranosyl2，6．：2｜，6 anhydride (DFA IV)は難消化性のオリゴ糖である．DFA IVはプレバイオテ イ ク スと して 期待 され て おり ，そ の大 量生 産 系の 構築 が求 め られ てい る， DFA IVはlevanからDFA IV 合成 酵素levan fructotransferase (LFTase)の働きによって 合成される，levanはsucroseからlevansucrase の 働 き に よ っ て 合 成 さ れ る ．LFTaseを コ ー ド す る 遺 伝 子 ぴ は 既 に ク ロ ー ニ ン グ さ れ ， その 大量 発現 系 も 構 築 さ れ て い た ， し か し ， 基 質 で あ るlevanが 長 鎖 高 分 子 体で ある ため 回収 操 作が 困難 であ ると い う 問 題 が 残 っ て お り ， こ の 問 題 を 解決 し，DFA IV大量 生産 を 可能 にす るた めに ， 単一 培養 系に よる sucroseからのDFA IV生産に取り組んだ，
1．1菌 株 に よ るDFA IV生 産系 の 構 築
levan生産菌の中からBacillus subtilis 168を宿主として選択した．IPTG誘導によってArthrobacter nicotinovorans GS‑9由来のめを発現させるプラスミドpLFT‑Gを作製して，B．subtilis/pLFT‑Gの培養
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上清にLFTaseを産生 させた． その培 養液にsucroseを添加することで，培養上清にDFA IVが生産さ れることを示した，培養96時間後に20.5g／1のDFA IVが生産され，53.9ガ1のsucroseが残存した．sucrose
消費量 に対するDFA IV重量収率は14.7％であった
次に，sucroseによって誘導可能な鬱発現ベクターpLFT‑Sを構築した．DFA IVの直接生産を試みた 結果，培養96時間後に22.8 g/lのDFA IVが生産された．しかし，53.5酬のsucroseが残存しており，
DFA IV生 産の改 善にはlevan生産の促進が必要であると考えた
2 ．調節因子degQ の追加導入がlevan およびDFArv 生産に与える影響
ぢ，subtilisにおけるsacBの発現は調節因子DegQによって正に制御される，吻Q高発現変異（ぬ飽j6 変異）を導入したdegQ遺伝子（以下degQ36遺伝子と呼称）を作製し，pHT43または折発現ベクターに
挿入 した， levan 生 産に 対す るdegQ 追加 導入 の影 響を 調べ た結 果， 趣Q36 遺伝子を含むB
subtilisノpHT‑D36はコントロール株B．subtilis/pHT43に比べ，sucrose消費速度，levan生産速度の著しい
上昇を示した．IPTG 誘導型の発現ベクターを用いたDFAIV 生産においてdegQ36 遺伝子を含むB
subtilisノpLFT‑GD36は，B．subtilisノpLFT‑Gに比べsucrose消費速度，DFA IV生産速度の上昇を示し，ま た， 培養72時間後のDFA IV生産量も増加した．さらに，sucrose誘導型の発現ベクターを用いたDFA IV生産においても，degQ．ヨ6遺伝子を含むB．sめ灯Z西/pLFT．SD36は，ぢ，sMろf釘むノpLFT―Sに比べ，sucrose 消費速度，DFA IV生産速度の上昇を示し，DFA IV生産量も増加した，以上の結果より，deg，Q追加導 入 がlevan生産を促進すること，また，DFA IV生産を増強することを示した
本 生産系の 課題とその対策
本研究で構築したDFA IV生産系の課題としてglucoseの蓄積に着目した．高濃度のglucoseがlevan 合成を阻害するとの知見から，蓄積するglucoseの変換を試みた，glucose oxidaseをDFA IV直接生産
系に添加したところ，培地中のglucose蓄積が軽減され，glucose oxidase非添加の条件に比ベDFA IV 生産が増加した．
以上，本 研究で は単一培 養系に よるsucroseからのDFA IV生産を可能にした，また，degQ追加導 入によってlevan生産，船よびDFA IV生産が促進されることを示した，さらに，glucose oxldaseの添 加によってDFA IV生産のさらなる増強が可能であることを示した，
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これらの研究結果のうち，B．subtilis/pLFT‑Gを用いたDFA IV生産系の構築については原著論文一報 が英文学術誌であるEnzyme and Microbial Technologyに受理された(2007年41巻673‑676頁）．また，
DFA IVの製造方法として特許出願し，すでに公開されているJP 2008‑307010 A. degQ追加導入の影 響については原著論文一報が英文学術誌であるJoumal of Bioscience and Bioengmeermgに受理された
よ っ て 、 審査 員 一 同は 、 竹 末信 親 が 博士 （ 農 学） の 学 位を 受 け る のに 十分 な資格を 有する も のと 認 め た ．
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