博 士 （ 水 産 科 学 ） 寺 崎 将
学 位 論文 題 名
Studies on Free Fatty Acids and Galactolipase in Red‑Tide Flagellates
（ 赤 潮 藻に存在す る遊離脂 肪酸とガ ラクトリ パーゼに 関する研 究）
学位論文内容の要旨
動 植 物 を 問 わ ず ， 遊 離 脂 肪 酸(FFA)が 生 体 内 に 多 量 に 存 在 す る こ と は 稀 だ が ， Chattonella marina, Heterosigma akashiwoなどの赤潮を形成するプランクトンやある種の 珪 藻は ，FFAを藻 体 内に 蓄 積 する こ と が知 ら れて い る 。一 般 にFFAは ，赤 血球を破 壊 し ，溶 血 活 性を 示 す。 赤 潮 藻の 産 生 する 高度不 飽和FFAは魚 の鰓の上 皮組織に ダメー ジを与 えること から，FFAが 魚介類の へい死原 因物質の ーっである と考えられている。
し かし ， 赤 潮藻 を 含む 藻 類 のFFA生 成 に関 する研究 はこれま でほとん ど実施さ れてい ない。
C． marina及 び ″．akashiwoに 蓄積 す るFFAは藻 体内に存在 するガラ クトリパ ーゼ (GLase，EC 3.1.1.26)の作 用によっ て細胞膜を構成する主要脂質成分であるグリセロ糖 脂質か らアシル 基が加水 分解され て生成すると考えられる(Fig.l)。GLaseはグリセロリ ン 脂質 に 対 しても活 性を持つ ことから， 非特異的 脂質アシ ル基加水 分解酵素 とも呼ば れ てお り ， 高等植物 の葉や塊 茎を中心に 盛んに研 究されて いる。し かしなが らこれま で海洋生物のGLaseに関する報告は無い。
O n o驚OCR
R さ。＿‐轟H HzC ‑O
H2COH Galactolipase
+ 2Hz0− − ― → HOIトC=<H
HzC ‑0 H
RC00H 十 ． R COOH
Free fatty acids Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) Galactosylglycerol
Figure l. Galactolipase hydrolysis of MGDG.
本研究では，赤潮藻におけるFFA の生成機構を明らかにすることを目的とし，以下 の項目について研究を行った。(1) 赤潮藻の産生する FFA の高感度組成分析法の確立。
(2) 比較的入 手の容易な 食用藻を用いた GLase 活性の測定とその精製法の確立。(3) 前項で確立した方法を用いた赤潮藻GLase 活性の測定とその部分精製。(4) FFA の由来 と考えられるグリセロ糖脂質分子種の迅速・高感度分析法の開発。 (5) 赤潮藻における FFA の産生条件。
(1) 蛍光検出 HPLC による赤潮 藻の FFA 組 成の高感度 分析法の確立
FFA を含む総脂質 (50‑100 Vg) に 9 ‐アンスリルジアゾメタン(ADAM) を反応させて螢 光誘導体を調製し，これを逆相 HPLC で分析してFFA 組成を求める方法を検討した。そ の結果，一度の分析で 60 分以内にC12 〜C22 （二重結合数0 〜6 ）の19 種のFFA を明瞭に 分離できた。本手法は FFA をフェムト (10'12) モルレベルで検出できるため，赤潮藻 FFA の 組 成 分 析 と GLase 活 性 の 測 定に き わめ て 有 用で あ るこ と が認 め られ た 。
(2) 褐藻オキナワモズク及び紅藻オゴノりに存在する GLase
オキナワモズクとオゴノりの両藻体からGLase 活性を初めて見出した。オキナワモズ クの粗酵素は37 ℃，pH9(Tris buffr ）で，オゴノりは37 ℃，pH8Qhosphatebu 脇r 冫で最も 強い GLase 活性を示した。両藻体の粗酵素はモノガラクトシルジアシルグリセロール
（MGDG ）とホスファチジルコリン￠C ）に対して高い活性を示した。両藻体内の脂質成分 中， MGDG は主要 成分である が PC は少量成分であるため， GLaSe の加水分解作用によ って生成す る FFA は 主に MGDG 由来であることが強く示唆された。オゴノりの粗酵素 から硫安沈殿・イオン交換・ゲル濾過．FPLC ．SDS ‐PAGE を用いて（也aSe を精製した 結果，比活性は3 ．2 倍になり，分子量がおよそ20kDa の二量体（40kDa ）であることが明 らかとなった。
（3 ）赤潮藻Chattonella marina 及び Heterosigma akashiwo に存在するFFA とGLase
C ． marina と〃．akashiwo は，生育が進むにっれて藻体のFFA が増加し，グリセロ糖脂
質が減少し た。 MGDG の加水 分解物のー っであるモ ノガラクトシルモノアシルグリ
セロール(MGMG) が検出されたことから，藻体内のFFA は， GLase の作用によって主に
MGDGか ら 加 水 分 解 さ れ て 生 成 す る と 推 測 さ れ た(Fig.1） 。 事 実 ， 両 種 の 粗 酵 素 か ら GLase活性が見出された。C｜marinaは25゜C，pH9(Tris bufer）で，〃．ロ施ぷヵfwDは37°C， pH7＠hosphatebuf．fer） で 最 も 強 いGLase活 性 を 示 し た 。 両 種 の 粗 酵 素 はMGDGに 対 し て 最 も 強 い 活 性 を 示 し ，MGDGの 両 ア シ ル 基 を 加 水 分 解 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 前 項 で 適 用 し た イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 用 い てGLaseの 部 分 精 製 を 試 み た 結 果 ， C． 朋 ぴf門 口 とHロ施 ゞカMDのGLaSeの比 活性 はそ れぞ れ14．0倍 と8．1倍 にな った 。さ らな る 精 製 は ， 原 料 と な る 赤 潮 藻 粗 酵 素 を 大 量 に 必 要 と し ， 今 後 の 課 題 と し て 残 さ れ た 。
(4)グ リ セ ロ 糖 脂 質 の 分 子 種 分 析
グ リ セ ロ 糖 脂 質 の 分 子 種 を 迅 速 か つ 高 感 度 に 分 析 す る こ と はFFAの 生 成 機 構 を 明 ら か に す る 上 で 必 要 で あ る 。MGDG分 子 中 に 存 在 す る4っ のOH基 にUVラ ベ ル 試 薬3，5‐ ジニ トロ フェ ニル イソ シア ネー ト を反 応さ せて 調製 した テト ラキ ス（3，5‐ジ ニト ロフ ェ ニ ル ウ レ タ ン ） 誘 導 体 は ， ．100 pmolレ ベ ル でHPLCに よ る 分 析 が 可 能 で あ っ た 。 ま た ， こ の 誘 導 体 の 検 出 限 界(S/N=3/1)は ，0.5 pmolで あ り ， 負 イ オ ンLC/ESUMSで は 明 瞭 な
［M十Cl］ ・ と 分 子 種 の 同 定に 有 用な 幾っ かの 分子 量関 連イ オン が得 られ た。 本誘 導体 は 調 製 が 容 易 で あ り ， 逆 相HPLCで 分 子 種 を 明 瞭 に 分 離 で き ， 定 量 性 に 優 れ て い る こ と か ら ， 赤 潮 藻 のMGDGの 分 子 種 組 成 を 明 ら か に す る 上 で 役 立 っ 。 こ の 方 法 を 用 い てC．marina の 生 育 期 間 中 のMGDGの 分 子 種 を 調 べ た 結 果 ， 主 要 分 子 種 は16:0/16:1（ 対 数 増 殖 期28％
→定常期後期26％），18:4/18:4 (25‑+1％），20:5/18:4(19→8％）及び20:5/20:5 (2‑+12％）であ った 。一 方， 生育 期間 中のFFAの 主要 成分 は16:0(31→27％） ，18:4 (17‑+5％ ），20:5 (19‑+
34％ ） で あ っ た 。 従 っ て ，GLaseが 作 用 す るMGDG分 子 種 の 組 成 は 生 育 期 間 中 変 動 し ， 藻体内に蓄積するFFAの組成も変わることが分かった。
(5) FFAの 産 生 条 件
C． marinaの 総 脂 質 中 のFFA含 量 は50％ 以 上 と の 報 告 が あ る が ， 本 研 究 で 単 一 培 養 し てFFA含 量 を 調 べ た 結 果 ， 定 常 期 後 期 の 試 料 で あ っ て も15％ に す ぎ な か っ た 。 こ の た め ， 本 研 究 で はFFAが 多 量 に 生 成 す る 条 件 を 種 々 検 討 し た 。 定 常 期 前 期 のC．marinaと
″ ． akashiwoか ら ホ モ ジ ネ ー ト を 調 製 し てFFA含 量 を 測 定 し た 結 果 ， ホ モ ジ ナ イ ズ直 後 と ホ モ ジ ネ ー ト を 長 期 凍 結 保 存(‑30℃ ） し た 後 のFFA含 量 は 数 ％ に す ぎ な か っ た 。 し か し ホ モ ジ ネ ー ト を 室 温 で 放 置 し た 結 果 ，FFAは 劇 的 に 増 加 し て 両 種 と も24時 間 で 総 脂 質 中60％ に 達 し た 。 一 方 ， グ リ セ ロ 糖 脂 質 は 徐 々 に 減 少 し ，24時 間 後 に は ほ ぼ 消 失 し
た 。 ま た ， 細 胞 ホ モ ジ ネ ー 卜 及 び 藻 体の 脂 質 成分 (MGDG ，FFA など ）は 生細 胞を 殺す 殺 藻 効 果 を 示 した 。特 にFFA は最 も強 い殺 藻効 果を 示し た。 従って ，通 常生 体膜 中に 存 在し ，活 性が 抑えら れて いる GLase が ，膜の破壊に伴って活性化してグリセロ糖脂質 を 徐 々 に 加 水 分解 する と推 測さ れる。 これ まで 赤潮 藻は 細胞 内に FFA を 多量 に蓄 積す る と言 われ てき たが， これ は細 胞の 一部 がホ モジ ネー トに なっ てい るか，あるいは実 験 中に 急速 にGLase が 活性 化し た可 能性 が考えられる。また藻体内の脂質成分自体に殺 藻 効果 があ るこ とから ，細 胞膜 の破 壊に よる 細胞 内容 物の 漏出 が同 種の壊死を引き起 こ し， かつ GLase の活 性化 によ って FFA が 増加 して ，壊 死を さら に促 進するものと推測 さ れる 。
本研 究で は赤 潮藻 C ． marina と ″． akashiwo にっい てFFA の 産生 条件とGLase の諸性
質 を初 めて 明ら かに した 。本 研究 で得 られた成果は，今後赤潮藻におけるGLase の生理
的 役割 を明 らか にす る上 で重 要な 知見 とな る。 褐藻オ キナ ワモ ズク 及び紅藻オゴノり
か らも GLase が 見出 された こと から ，GLase は海 洋の光 合成 を行 う生 物に広く存在して
い る と 考 え ら れる 。螢 光検 出HPLC に よる FFA の 微量 定量 分析 法は 今後 ，種 々の 生物 の
FFA 組成及ぴ脂質加水分解酵素活性を調べる上で役立っ。テトラキス（3 ，5 ‐ジニトロフェ
ニ ル ウ レ タ ン ） 誘 導 体 を 用 い る HPLC 分 析 法は ，他 の様 々な 生物 に含 まれ るMGDG の 分
子 種を 迅速 に分 析す る上 で有 用で ある 。赤潮藻ホモジネートにおけるGLase 活性の急激
な 上昇 は， 生体 膜に 結合 して いる GLase がどのような生理条件下で活性化するのかを今
後解明する上で重要な知見となると考えられる。
学位論 文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 教授 助教授
板 橋 豊 原 彰 彦 宮 下 和 夫 安 藤 靖 浩
学 位 論 文 題 名
Studies on Free Fatty Acids and Galactolipase in Red‑Tide Flagellates
（ 赤 潮 藻 に 存 在 す る 遊 離 脂 肪 酸 と ガ ラ ク ト リ パ ー ゼ に 関 す る 研 究 ）
通 常 、 生 物 組 織 に 遊 離 脂 肪 酸(FFA)が 多 量 に 存 在 す る こ と は な い が 、 赤 潮 藻 を 含 む 微 細 藻 の 多 く は 、 こ れ を 藻 体 内 に 著 量 蓄 積 す る と 言 わ れ て い る 。FFA は 赤 潮 に よ る 魚 介 類 へ い 死 の 原 因 物 質 の ー っ で あ る と 考 え ら れて い る が、 微 細 藻 が 何 故 多 量 のFFAを 産 生 す る か は 明 ら か に さ れ て お ら ず 、 生 化 学 的 に も 興 味 が も た れ て い る 。 本 研 究 は 、 赤 潮 藻 のChattonella marinaとHe terosigma akashiwoに お け るFFAの 生 成 機 構 を 明 ら か に す る た め に 行 わ れ た も の で あ る 。 得 ら れ た 成 果 は 以 下 の よ う に 要 約 さ れ る 。
（1）FFAを9― ア ン ス リ ノ レ ジ ァ ゾ メ タ ン(ADAM)と 反 応さ せ て9→ ア ン ス リル メ チ ル エ ス テ ル 誘 導 体 を 調 製 し 、 こ れ を 螢 光 検 出HPLCを 用 い て 測 定 す る 簡 便 な 高 感 度 分 析 法 を 確 立し た 。 この 方 法 によ り 、 赤潮 藻 に 存在 す るFFA（ 炭 素 数12―22、 二 重 結 合 数0ー6） と 酵 素 実 験 で 生 成 す るFFAの 含 量 と 組 成 を フ ェ ム ト モ ル レ ベ ル で 求 め る こ と が 可 能 と な っ た 。
(2)赤 潮 藻 を 無 菌 的 に 培 養 し て 、 生 育 過 程 に お け る 脂 質組 成 を 調べ た 結 果、FFA の 他 に グ リ セ ロ 糖 脂 質 （ 主 に 、 モ ノ ガ ラ ク ト シ ルジ ア シ ルグ リ セ ロー ル ） と そ の 加 水 分 解 物 と 考 え ら れ る り ゾ 体 が 主 要 成 分と し て 藻体 内 に 存在 す る こ と を 見 出 し た 。 こ の 結 果 か ら 、 赤 潮 藻 体 内 に グリ セ ロ 糖脂 質 を 加水 分 解 し てFFAを 生 成 す る ガ ラ ク ト リ パ ー ゼ(GLase)の 存 在 す る こ と を 推 定 し た 。
(3)赤 潮 藻 体 か ら 調 製 し た 粗 酵 素 中 にpH7―9、37℃ 付 近 に 至 適 活 性 を も つ GLaseの 存 在 す る こ と を 見 出 し 、 イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 等 を 用 い て 酵 素 の 部 分 精 製 を 試 みた 。 そ の結 果 、 酵素 の 比 活性 は8 ‑‑‑14倍 に な り、
微 細 藻 か ら のGLaseの 精 製 の 可 能 性 を 示 し た 。
(4) GLase活 性 を 海 藻 （紅 藻 オ ゴノ り と 褐藻 オ キ ナワ モ ズ ク） か ら も見 出 し た 。 オ ゴ ノ り の 粗 酵 素 か ら 、 硫 安 沈 澱 、 イ オ ン 交 換 、 ゲ ル 濾 過 、FPLC及 び
SDS−PAGEを 用い てGLaseを精製し たところ 、比活性 は3．2倍に なり、分 子 量 が お よ そ20kDaの 二 量 体(40kDa)で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 これ ら の結 果 か ら、GLaseは 海 洋の 植 物 に広 く 分布 す るもの と考えら れ た。
(5) GLaseを含む粗 酵素は種々 のグリセ ロ糖脂質 とりン脂 質（ホス ファチジ ル コ リ ン ） を 加水 分 解 した が 、 モノ ガ ラク ト シ ルジ ア シル グ リ セ口 ー ル (MGDG)に 対し て 最 も高 い 活性 を 示 した こ とか ら 、 赤潮 藻に存 在するFFA の由来は主にMGDGであることを明らかにした。
(6)赤 潮 藻 の 生 育に っ れて 総 脂 質中 のFFA含 量 は 徐々 に 増加 し た が、 定 常 期 後期の試 料でも、そ の含量は 十数％に すぎず、組織に多量に蓄積する(50%
以 上 ） と い う 従 来 の 報 告 と 大 き く 異 な る 現 象 を 見 出 し た 。 (7)赤 潮 藻 の 細 胞膜 を 破壊 （ ホ モジ ナ イズ ） す るこ と によ っ てFFAは 急 激 に 増加し、GLase活性も著し く高くな ることを 見出した 。このこ とから、 藻 体を 培 地か ら 遠 心分 離 によっ て回収し た場合、 条件によ っては細 胞膜が 破壊 し 、そ の 結 果FFAが 多く 生 成 する 可 能性 を 指 摘し た。 また、藻 体か ら抽 出 した 総 脂 質や 構 成成分 にも殺藻 効果が認 められた ことから 、細胞 膜の破壊 による細胞 内容物の 漏出が同 種の壊死 を引き起 こし、か つGLase の活 性 化に よ っ てFFAが 増加 し 、 壊死 を さら に 促 進す ると の仮説を 提案 した。
(8) MGDGを3，5− ジ ニ トロ フェ ニルイソ シアネー トと反応 させて、 テトラキ （3，5― ジ ニ ト ロ フ ェ ニ ル ウ レ タ ン 、DNPU） 誘 導 体 に 変 換 し 、 逆 相 HPLC/ESI−MSによ っ て 、分子種 をピコモ ルレベル で決定す る簡便なHPLC 法を開発 した。反応 は15分程度 で完了し 、HPLCでの分離は良好であった。
負イオンMSでは［M+Cl］― や［M―DNPU]― などの分子種の同定に役立っ明 りょ う なイ オ ン が得 ら れた。 この方法 を用いて 、藻体のMGDG分子種の 組 成を調べた結果、18：4―18：4、20:5一18：4、20：5‑20：5などの高度不飽和 脂肪 酸 を含 む 分 子種 が 主要成 分である ことが明 らかとな った。こ の分子 種組 成 と構 成 脂 肪酸 の 位置 特 異 分析 の 結果 か ら 、赤 潮 藻に存在 するFFA は 藻 体 内 のGLaseの 作 用 に よ り 、MGDG分 子 種 のsrr1位 とsn‑2位の 両 位 置から生成すると結論した。
以 上 の成 果 は、 赤 潮 藻Chaオtonella marlnaとHeterosigma akashiwoに存 在す るFFAの生成機 構を構成 成分（グリ セロ糖脂 質）と関 連酵素（ ガラクト リ パーゼ） の視点か ら明らか にしたも のであり、 審査員一同は本研究が博士（水 産 科 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 の あ る も の と 判 定 し た 。
