学位論文内容の要旨

学 位 論 文 題 名

博 士 （ 歯 学 ） 王    寶 禮

Activation of SH2 一 Containing Proteins by Insulin in     I ′

    Proliferating Mouse ParotidGland Acinar Cells      （イン スリンによる耳下腺細胞の SH2 含有蛋白質の活性化）

学位論文内容の要旨

f

ネ許 言1

｜ 唾 液 は 懴 科 と 医 科 の

領 域 に 亜 要 な 関 迎 を も つ に も か か わ ら ず 、 血 液 な ど に 比

す る と 彑 こ 化 学

な 研 究 が

堕 れ て い た 。 と く に

！ 唾 液 ｜ 巌 の 機 ガ ヒ と 成 長 に 及 ぼ す イ ン ス リ ン な ど の 多 機 能 囚 予 の 影 駕 ！ に つ い て は 、 こ れ ま で ほ と ん ど 報 ・ ＆ が な か っ た 。 本

リ

こ 究 は 耳 下

斑 ネ 川 胞 に 対 す る イ ン ス リ ン の 作 川 機

雛 に え

｜ ヨ し た も の で あ る 。 イ ン ス リ ン の 機 能 は

觀 ｜

嫌 下 作

以 外 に 多 種 類 ！ の 荊

胞f ｜ ｜動のf み．I ・′．1 こイヒ能およびJ 仰苅1 ：f ガヒがI 川らかになりつつある。これらの作川は い ず れ も 檪 的 ネ 川 胞 表 而 の イ ン ス リ ン レ セ ブ タ ー を 介 し て 発 現 し て お り ， そ の う を 現 は チ 口 シ ン キ ナ ー ゼ が 活 性 化 （ リ ン 酸 化 ） す る こ と に よ っ て け

始 さ れ る 。 そ の 後 の 情 報 伝 達 の メ カ ニ ズ ム に つ い て は 、 現 征 、 次 の よ う な ー

が

リ

ら か に な り つ つ あ る 。 す な わ ち 、 活 セ ｜ ． ・ イ ヒ し た チ ロ シ ン キ ナー ゼは 、IRS ・

（

恥

じ じ

（ ） ．

ヒ

じ ．

） と

｜ チ ばれ る斑 白質 と 結合 して その チ口 シ ン を り ン 巧 菱 化 す る 。 そ し て こ の 活 ´

！ ヒ 化 し た

．

、 さ ら に

（

（ ）

） と 呼 ば れ る 配 ， ダ ｜

を も つ 一 群 の 斑 白 質 （

含 有 蛋 白 質 ） と 結 合 し て 複 合 体 と な り 、 次 段

； 皆 の 反 応 を

虫 媒 す る と 考 え ら れ て い る 。 こ の 一

汁 の

含 有 蜑 白 質 に つ い て は 、

（

キ ナ ー ゼ ） の み が 結 合 す る と ぃ う

ら の 説 が 、 一 般 に 認 め ら れ て き た が ， 他 の

含 有 蛋 白 質 に つ い て

よ← ｜．// ナにはnn ！認さj ′し てし、なしヽo

さ て，近．イI ミj ￥哲らのグル ーフ゜はI ！！疋i 霞亅亅泉ネmJj 包の網胞‖炎にインスリンレセプ タ ー の イ

イ

！ を う も メ己 し， そ して イン スリ ンが ｜ 唾液 〃泉 翁川 包 のj 田 殖を 促

墜す る 働 き が あ る こ と を 報 告 し た 。 そ こ で 本 研 究 で は ， す で に 著 者 ら が 碓 立 し た マ ウ スの ｜ 亜f 皮

亅 泉の ネ 川J 包 エt1 恥 災！ 験系 をJu い て， 耳下

亅 泉荊‖胞に対するイ ンスリン の

ガ 報 伝 達 機

拵 を

眸

リ

す る こ と を

］ 的 と し た 。 研 究 を 逃 め る に あ た っ て 次 の

ー

を イ

； 架 仮 説 と し た 。 （

） イ ン ス リ ン は ，

（ 上 皮 成

凶 丁 ） 、

ー116 ‑

PDGF（J（I［ 小1牧m爿 ミ 成 長IN予 ） とlid U2に チ ロ シ ン キ ナ ー ゼjjfj´ に1： を も ち ， リ ガ ン ド の 紬 合 に よ ル チ 口 シ ン 残 艤 の1ヨ 己 リ ン 酸 化 を 凵 ニ ず る の で ， こ の こ と か ら EGF, PDGFの 系 に お け る レ セ ブ タ ー 以 降 の シ グ ナ Jレ 伝 述 様 式 が イ ン ス リ ン の 系 で も そ の ま ま 当 て は ま る も の と 予 懸 tさ れ る こ と 。 （ 2） し た が っ て イ ン ス リ ン ・ レ セ ブ タ ー に 結 合 す る IRS‑1に は 、 従 来 知 ら れ て い た PI3K 以 タ 、IのS1‑12含 罰 ・ 斑 白 質 （PLCy ホ ス ホ ル バ ー ゼCガ ジ マ ，GAI） ： グ ア ノ シ ン 三tリ ンiV:uI11：I｜ りtj止 斑 白 質 ） と も ネi｜ 合 す るT｜ 」 ． ガ ヒ は が あ り ， そ れ ぞ れ のSH2 含 有 蜑 白 質 が シ グ ナ ル 伝 達 経 路 や イ ン ス リ ン 作 川 の 多 様 性 に I瑚 与 し て い る 可 能1！I｜ がI｜ ｜い と考 え られ るこ と 。以 亅∴ のI：lrl´ 、jと イ1ミ 架 仮ぶ ぇに2｜ヒ づ き実 験を 逆 め た 。

  14；オ拳1． と)Jむ；l 1．実験動物

BALB/c系のマウスを川 い，1匝1にっき50′iiiolの インス1Jンを筋l′′ミJ内 注あ ；j．にて 反i襲技‑ した。 すなわち，インス リ，シ投与群を47mに分け，15 分，60分、24‖やI；；j、72‖寺川の系， ぐ実験に供した。 インスリンは15 分、60分の系は1回、24‖ヤ「lI‖および72時｜削 のlmでは、それぞれ 計3 匝lおよび71。1、12‖ やI：！JITffll;iyjで反復投与された 。

2．試蔕1イ1！ 製

  イ ン ス リ ン 投 与 後 jiお 出 し た 耳 下JJ泉 は ， 遠 心 分r.惟 法 で 翁II胞 を 分 面 し た 。 こ の方 法を川いネ川胞画 分とネ01胞質画分を 分離した。

  3．チ口シンl)ンI峻 化蛋[‑1質 の検i．t｜

  耳 下 亅 亅 袈 舖iljLiiilji分 か ら ウ エ ス タ ン フ ゛ 口 ッ ト 剋rで 抗 リ ンi峻 化 チ 口 シ ンj允f本 を 川い てりンI駿 化する斑白質を検 出した。すなわち ，試料をSDS．ポ1Jアクリ

ル ア ミ ドTLj:<L泳 勁 に 展 I；Hし ， 一 次 わ ．C体 と し て 抗 リ ン 酸 化 チ 口 シ ン 抗 体 と 反 応さ せ，2次わ ．C体と してProヒcinA‑ALPで反応さ せ発也させた。

   1．わ・LIIS，1j/￣1：fイ くを川いたノrQッ 隻沈｜睇剋：

  /r也7楚沈｜ 尓む：で上｜〜i｀．J亅昶ヰ川J包ぞf｜勺にイfイ｜：するチLJシン，ぐりンI＾i塗化する丑i山ずt と IRS．1と を 結 合 さ せ た 。 ジ 也 j曁 反 応 物 を SDS・ ボ 1Jア ク リ ル ア ミ ドf吐 気 泳 勁 に 展 ‖iJし ， さ ら に ウ エ ス タ ン ブ 口 ツHよ で 抗PLCy， わ ．CG八Pお よ びj/tP131くj´ ．c 体 と の 反J， ふ を 1251ラ ベ ル ブ 口 テ イ ン Aに よ る オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ イ ー −Iニ ． で 観 察 し た 。 そ し て 各 々 の4書 ユlt！rJ′ 、Jバ ン ド の 濃 度 を デ ン シ ト メ ト1Jー に て 比 Il皮 冫と 缶した。

  5．I〕KC（プ口テイ ンキナーゼC）fll゛ ルのみ！I亅）と

  PLCyitl´に ！：のマー・カー としてのPKC活´阯の測定はGIBC〇／BRLネ1： の

   「y ．  32PJ ATP を川いたブ口テインキすーゼC エンザイムアッセイシステ ムを使川した。

  f結果および考察j

  1．チ口シン1Jンi峻化賚白質の検H．j

  ill川 包i山fう ナを わ． じり ン酸 化 チ口 シン わ・ 〔体 を 川い てり ンn変化11長h質 のウ エス タ ンフ゛ロ ノトガ：で帚tみたネ！1i爿ニ，11：ード〃巌j';lll)jdからさまざまなりンI i変化チ口シン 含 イJ． ヱ垤fコ 質がlミ 凵．Iさ オし た。り！ね ：までの！翻ミ・告では80ー150kDaのrrd'iJ或に 行 イ1． 三 ，jー る ノ¥ン ド は ， イ ン ス リ ン レ セ ブ タ ー の チ 口 シ ン キ ナ ー ， ピtl´Vli化 に よ り ； 影 駕 ！ を 受 け る 可 能 性 の あ る'Illj： ．H・ ミ 伝 達 物 質 が 多 い と ぃ わ れ て い る が ， 本 実 L灸 ネjl爿 こ か ら も イ ン ス1Jン 投 与7f゛Fに は 80ー150kDaの 釘iJ或 に 複 数 の ノ ヾ ン ド カ リ7；I｜ さjL，PI3K (85kD．1） ，G八P（12（）kDa)，PI̲Cy（1′1（〕kDa)と考 えらjL る バ ン ド の 位t＆ に41う せ 的 な 反J， ふ が み ら れ た 。 そ こ で ， こ れ ら の 斑 白 を ユ ヒ 斫 ！ に ｜ffJ定 す る た め に ネ 川 胞'irOilii分 を 一 旦 ， 抗IRS‑1抗 体 に よ っ て 免 疫 沈1蜂 物 を 得 ， その1｜Jに抗PI3K．GAP，PLCy抗体と反応するバンドを追及した。

  2tわ．じIRS．］jJ￣じf 卜を川いたノr也j妾沈lj尓泓：

  )j'LIRS．HJ．じfイくによる沈b没！1勿IIIにfよ，jJ．［1 13K．GAP，PLCアj/．L′f本と反Jふする ノ ヾ ン ド が1リjら か に 検fl｜ さ れ ， こ れ ら3種 の 酵 素 の 行 イt： が ｜ 碓 認 さ れ た 。 そ れ ら は ， イ ン ス リ ンAiiii22に1fい ，IRS‑1と ネllf合 す る3乎fnのnflそ （PI3K．G八P． PLCy． ） は 坩 カ ‖ 灯 （11を ヵ ： す バ ． ン ド を5！ し た 。 そ し て ，125Tラ ベJレ ブ 「 」 テ イ ンAに よ る A‑ー ト ラ ジ オ グ ラ フ イ ー 上 で 各 々 の 4書 興 「 向 ノ て ン ド の 濃 度 を デ ン シ ト メ ト リ ー に て 比ll岐 ） ヒ ． 廿 し た 紺 爿 こ ，3純 と も す ぺ てJI17)J11 (LljliiJが ， 刺 激 15分 ぬ 後 か ら は じ ま り 24‖ 薯 ｜ f：Jま で 継 ネ 光 し た 。 以 上 の 分 析 紺 来 か ら PLC ア ，GAP;よ24‖I川 ま でjl｜ カIし ，72lllj:川 で はdiik少 し た 。 こ ゴ ′ し は イ ン ス1J ンllilj激 に1ヤ う レ セ ブ タ ー 数 の む 史 少か ，あ ．る い はイ ンス リン と の反J ふJ， ふ谷 が 鈍 く な っ た こ と が 考 え ら れ た 。 一 方 ，PI3Kに Nせ っ て は72‖/lftJま で ー ； ヒ し ていた。

3． PKC活´j：！：の測定

  PKC活 ′ 幽 ： を 礼 ！0jと し た 剄 ！ 山 は イ ン ス リ ン が レ セ ブ タ ー に 結 合 し 、 チ 口 シ ン キ ナー ，ピ カ ミf轟 ′1：1：化 さオ ′L，さ らにIRS‑1とPI̲CyのもつSH2音｜5位にネ【！f合しPLC yカミ活´ヒト化さオ′し，さらにPKCカ；活´VL化さj′しる，とし、う考えにゴ｜ヒづく。ネilf爿こfよ インスリンポ0 Jj7.に1ヤし、，PI< cin. 'vi:.ti/lfよlmん‖{LIIIiiJを示した。この変化fよニ1こに 示 し た 免 疫 沈 ｜ 蜂 ， ウ エ ス タ ン ブ ロ ソ ト 泣 ： に よ っ てIRS‑1とPLCyが 結 合 を 証

‑118 ‑

明 したオート ラジオグラフイーをデンシトメーターで分わ´ r した値の傾向に 一致していた。このネ llf −とは，IRS ・1 がPLC アと複合体を71 彡成し、それを介し て PKC が活´ll ：化されて，シグナルが伝遵することを示す：丑災なiiI 三拠をj 是qI するものであろ。

irilj論1

本li)r究においては，既に著者らがインスリンによるjii{ii髄を珊！認したll‑r JJ5！ネ刪包を実験系として川い、IRS‑1.と結合するSII2含イ丁斑白質には，著名．ら が最初に提案したイ1三漿仮説どおりにPI3Kの他に，GAPとPLCyがあること

を硼！認し，新しいインスリンのJtIIlj報伝達経路を児いfHした。これらのおfし

い m翻ミ伝遵縦H行は・」，1〜1 ．J燥荊川包の剰川笹J11ボfなどに！；髟々半を．り，える．11J．ガヒ 1．′，，1：が示‖変 された。

学 位 論 文 審査 の 要 旨 主 査    教 授    谷    宏 副 査    教 授    久保 木 芳 徳 副 査    教 授    松 本    章

学 位 論 文 題 名

Activation of SH2 ― Containing Proteins by Insulin in     ProliferatlngMOuSeParotidGlandACinarCe11S      （インスリンによる耳下腺細胞のSH2 含有蛋白質の活性化）

論文 帯A は 、主査およ び剛査全員 の出〃苫の もとで、まう 、lll 識者に 論 文 の 概 要 の 説 明 を 求 め た 後 、 各 委 員 か ら 木 論文 の 内容 と その 関 連事

項 に つい て 口 頭に よ り 言式 m ］ し た。、

  I 唾 液 は 口 腔 の 健 康 や 機 能 の 維 持 に と っ て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る f 本 液 で あ り 、 歯 科 と 医 科 の 両 領 域 に ま た が る 重 要 な 休 液 で あ る に も か か わ ら ず 、 血 液 な ど に 比 較 す る と 生 化 学 的 研 究 は 遅 れ て い た 。 と く に 唾 液 J 腺 の 成 長 と 機 能 に 及 ば す イ ン ス リ ン な ど の 多 機 能 因 子 の 景 彡 響 に つ い ては、こ れまで ほとんど 報告が なかった 。

   本 il 究 は 、 唾 液 J1 泉 に お け る イ ン ス リ ン の 作 用 機 構 を 解 明 す る こ と を Ej 「 n と し て 行 わ れ た 。 イ ン ス リ ン の 機 f 兜 は 血 椡 i 降 下 作 jTi 以 外 に 多 種 類 の t ｜ J JILi 活 動 の 活 性 化 能 お よ び j 酋 殖 能 が 1 リ 1 ら か に な り つ フ あ る 。 イ ン ス リ ンのn ！川I ．よい 1 ′れ ・も I 輩的組‖Jl 色峩 if 量T のインスリンレ，ヒプクーを介して 行 わ れ 、 そ の チ 口 シ ン キ ナ ― ゼ を 活 性 化 す る こ と に よ っ て 開 始 さ れ る 。 そ の 後 の 情 報 伝 達 の メ カ ニ ズ ム に つ い て は 、 活 性 化 し た チ 口 シ ン キ ナ ― ゼ は 、 I IIS ー 1 （ Insulin l<eceptor SubstraLe ー 1 ） と い う ク ン パ ク TtL の チ 口 シ ン を り ン n 隻 化 し 、 II{S ー 1 は S112 と 呼 ば れ る ア ミ ノ n 釜 襾 己 列 を も っ ‑1 ！ I の ク ン バ ク 質 （ Src llom （ ） logyZ 合 ね タ ン バ ク 質 ） と キ 占 合 し て

120 ‑

複 合 体 と な り 、 次 の 反 応 を 触 媒 す る と 考 え ら れ て い る 。 こ の 一 群 の Sll2 含 有 ク ン バ ク 質 に つ い て は 、 こ れ ・ よ で に PI3 キ ナ ― ゼ （ PI3k ） の み が 知 ら れ て い た が 、 本 研 究 で は 、 す で に イ ン ス リ ン に よ る j 曽 殖 を 確 認 し た i 唖 液 Jl 泉 の 災 験 系 を 川 い て 、 そ の 他 の Sll2 合 カ タ ン パ ク 質 も 関 与 す る と の 作 業 仮 言 兜 を た て 、 グ ア ノ シ ン 三 リ ン 酸 活 性 タ ン バ ク 質 （ GAP ） フォスフォリパ―ゼCY （PI ．.CY ）について検討した。

   実 験 は 、 BALB/c 系 マ ウ ス の 筋 肉 内 に 、 イ ン ス リ ン を 反 復 投 与 し 、 ま ず 、 荊 ll 胞 画 分 を 抗 リ ン 酸 化 チ 口 シ ン 抗 体 を 用 い て チ ロ シ ン リ ン 酸 化 タ ン バ ク 質 を ウ エ ス ク ン ブ 口 ッ 卜 法 に て PI3K 、 GAP 、 PLCY の 分 子 量 に キ 口      ，t

当 す る バ ン ド を 検 出 し て い る 。 次 に 、 細 胞 質 画 分 を 抗 IRS − 1 抗 体 を 用 い て 免 疫 沈 降 さ せ 、 沈 降 画 分 を 抗 P13K 、 抗 GAP お よ び 抗 PLCY 抗 体 を 用 い て ウ エ ス ク ン ブ 口 ッ ト を 行 っ て 、 PI3K 、 GAP お よ び PI.Cy の 存 在 と 、 IRS − 1 と の 結 合 を 確 認 し て い る 。 さ ら に PLCY の 活 性 化 の 指 標 と な る PKC 活 性 値 を 測 定 し 、 イ ン ス リ ン 投 与 に 伴 う PI ー CY の 活 性 が 増 大 することを確認している。

   木 研 究 に お い て 、 す で に 中 言 青 者 ら が イ ン ス リ ン に よ る 増 殖 を 確 認 し た尖験 系のI 「下 ii 泉莉‖ J1 包 を川い、 ins ー 1 と納合 すろS112 クンバクf てにはめ め に 立 て た 仮 説 ど う り に PI3K の 他 に 、 GAP と PLCy が あ る こ と を 確 認 し 、 新 し い イ ン ス リ ン の 「 ｜ マ報 伝 述 経路 の 存在 を 示 唆し た 。こ の こ とは こ の 分 野 に お け る 進 歩 発 展 に 寄 与 す る と こ ろ 極 め て 大 き く 、 本 研 究 は 高 く i F カ TIi さ れ 、 ま た、 こ れら の 新 しい 情 報伝 達 経 路は 耳 下 J 腺細 胞 の 細

｜色j 竹鮒などに影嚮を与える可ガヒ性を示唆している´f ；i 、において．b9 世｜昧深 い。

   彊｜：tJ は、1 ） f 唾液JJ 泉翁‖ Jl 色においてインスリンの作川t 幾 1 師を迎及した

理 山 、 2 〕 本 実 験 系 に 川 い た イ ン ス リ ン 投 与 量 に つ い て 、 3 ） 唾 液 分

泌 に つ い て 、 4 ） リ ン 酸 化 に つ い て 、 な ど 多 岐 に わ た っ た 。 概 要 の 説

l リ 1J 、木研究の意義、発展および関連分里f に関する質fHi にも、満足すべ き解答が 得られた。    以 上の結果から、 本論文は衛科医学の避歩、発 展に寄与するところ大であり、本学位巾，請者は博士（歯学）の学位を 授与されろに十分値するものと認めた。

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