博 士 （ 薬 学 ） 莚 田 泰 誠
学 位 論 文 題 名
ス ン ク ス に お け る 薬 物 代 謝 酵 素 に 関 す る 研 究 学 位 論 文 内 容 の 要 旨
1． はじめ に
医薬品 の開 発過程 におけ るヒト 臓器 などを 用いた 研究は ，ヒト の代謝物の生成を定性的に予測するに は適 し た方 法であ るが， その 結果か ら加vivoにおけ る薬物 動態や 毒性 を定量 的に予 測する ことは 困難 であり ，薬物 動態 や安全 性試験 には実 験動物 の使 用が依 然とし て必須となっている．ところが，薬物代 謝酵素 などの 生化 学的特 性は種 によっ て異な って いるた め，実 験動物からヒトヘの外挿を行う場合，数 多くの 実験動 物で のデータが必要であり，幅広い動物種を用いることが重要である．そこで，著者は，食 虫目， トガリ ネズ ミ科，ジャコウネズミ属に分類され，系統発生学的に齧歯類と霊長類の間に位置すると 考えら れてい るス ンクス(Suncus murinus)に着日 した， スンク スは嘔吐反応を示す唯一の小型動物であ り，鎮 吐薬の スク リーニングにおける有用性が報告されている．本研究ではスンクスの実験動物としての 有用 性 評価 の一環 として ，主 要組織 におけ る薬物 代謝酵 素の 発現量 及び活 性を調 べる ことを 目的と し た．
2．ス ンクス の主要 組織 におけ る種々 の薬物 代謝 酵素の 発現
既 に ス ンク ス はN‑ア セ チ ル 転 移 酵素(NAT)を 欠 損 するこ とが 明らか にされ ている ．本研 究で はNAT 以 外の薬 物代 謝酵素 がスン クスで 発現 してい るか否 かを調 べる目 的で ，7週 齢の スンク スの主要組織よ り 総RNAを 調 製 し ，8種 類 の チ トク ロ ー ムP450 (CYP)，5種 類 の フ ラ ピ ン含 有 モ ノ オ キシ ゲ ナ ー ゼ (FMO)，UDP一グ ル ク ロ ン 酸 転移 酵 素(UGT)1゛6， ア リ ル 硫 酸転 移 酵 素 ， グル タ チ オ ンS一 転 移 酵 素 (GST)j，カル ポキ シエステラーゼおよびエポキシドヒドロラーゼのcDNAをプローブとしてノーザンプロツ ト 分 析 を 行 った ． そ の 結 果， ス ン ク ス で はCYP3Aお よ びFM01〜5のmRNA発 現レ ベ ル が 極 めて 低 い こ と が判明 した ．さら に，ス ンクス 肺に おいてCYP2Aの 高発現 が見 られた ，
3．スン クス におけ るCYPの発現 量およ び酵 素活性
CYP3A誘 導 薬 デキ サ メ タ ゾ ンを 投 与 し た スン ク ス 肝 で はCYP3AのmRNAのシ グ ナ ル が 検出 さ れ た こ と よ り ， スン ク ス で はC YP3A遺 伝 子自身 は存在 するこ とが 示され たが， 常在的 なCYP3Aの発 現量は 低 い ことが 確認さ れた． また， スン クス肝 ミクロ ゾームにおいて，CYP3Aに特異的なミダゾラム水酸化酵素 活 性がラ ットの1/6で あるこ とが 判明し た，こ れらの 結果よ り， スンクスはCYP3Aが関与する代謝反応の poor metabolizer (PM)型の 表現型 を示す こと が示唆 された ．
ス ンクス 肺のCYP2Aの 発現量はラット，マウスの100倍以上であった．そこで，スンクスおよびラットの 肺 ミ ク ロ ゾー ム を 用 い て，CYP2Aに特 異的なSM−12502Sー酸化 酵素活 性の 速度論 的解析 を行っ たとこ ろ ，スン クスに おけるVmax/Kmはラッ トに比 べて99倍大き い値で あっ た．
さ らに，NNKを 被験物 質とし て用 いたAmes試 験に おいて ，スン クス肺S−9を 酵素源 として 用いた場合，
NNK濃度 依 存 的 に 復帰 変 異 コ ロ ニー 数 の 増 加 が 認め ら れ た ．7方 ， ラ ッ ト 肺S−9では ，NNK濃度 が増 加 し て も コロ ニ ー 数 は 増大 し な かっ た．す なわち ，肺CYP2Aが 代謝的 活性化 に関 与する 変異原 物質に 対 して， スンク スは高 感受性 であ ること が示唆 された ．
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4． ス ン ク ス に お け る ト リ メ チ ル ア ミ ンN‑酸 化 酵 素 の 低 発 現 ： 魚 臭 症 候 群 の実 験 モ デ ル とし て 魚 臭 症 候 群 はFMOの 遺 伝 的 欠損 が 原 因 と な る疾 患 で あ る ，こ の 疾 患 の 患者 は ト リ メ チル ア ミ ン (TMA)を ハ ト 酸 化体(TMAO)に 代 謝 する こ と が で きな い た め ， 尿， 汗 ， 唾 液 ， 呼気 中 に 大 量 のTMAを 排泄す る結 果，魚 のよう なアミ ン臭を 発す ること が知ら れてい る．
肝ミ クロゾ ームに よるTMA N‑酸化 酵素活 性にお いて， スンク スのlow‑Km酵素のパラメーターをラット と比較 した ところ ，スン クスのKm値は2倍 高く，Vmax値は1/4で あった．スンクス肝ミクロゾームによる TMAN「一 酸化酵 素活性 はFMO阻害 薬メチ マゾー ル，チ オウ レア， チオベ ンズア ミド によっ て活性が96〜 100％ 減 少 した が ，CYP阻 害 薬 の 影響 は見ら れな かった ，すな わち， スンク スに おけるTMAヘ ト酸化 反 応に関 与す る酵素 はCYPではな く，FMOであ るこ とが示 された ．スン クス とラッ トにお けるTMA N‑1S2化 酵素活 性の 差はス ンクス のVmaxが 低いこ と，す なわ ち，FMO酵素 量が少 ないこ とが 原因と 考えられた．
TMAを10 mg/kgの 用 量 で 腹 腔 内 投 与 し た と き ， 投 与 後24時 間 ま で の ス ン ク ス の 尿中TMA/TMAO 比は1.42であり，この値は健常人(0.05〜0.11)およびラット（O．11）より13倍高かった．すなわち，スン ク スはTMAヘト 酸 化 酵 素 活 性に お いてPM型の 表現型 を示し ，魚臭 症候 群の実 験モデ ルとな るこ とが示 された ，
5．パーキンソン病様症状誘発物質MPP+のスンクス脳内への蓄積
パーキンソン病様症状誘発物質である1−メチルー4−フェニル−1，2，3，6−テトラヒドロピリジン(MPTP)は 血 液 ー 脳 関 門(BBB)を通 過 後 ， 脳 内の モ ノ ア ミ ンオ キ シ ダ ー ゼB(MAO−B） に よ り代謝 中間体 であ る MPDP十 を経 由 し てMPP+へ と 活性 化 され たの ち神経 細胞死 を引き 起こ す． MPTPの解 毒経路 とし ては，
FMOに よ るハ ト酸 化，CYPによ るヘ ト脱メ チル化 が知ら れて いる． そこで ，MPTPの 作用部 位であ る脳 で のMPTP代謝 に つ い て ，ス ン ク ス と ラッ ト を 比 較 し，MPTPの解 毒 に 対 す る脳 内FMOの寄 与を調 ぺた ． スンクスとラットの脳ホモジネートによるMPP十生成活性は同程度であった．また，ラット脳ホモジネート に よ るMPTP N‑酸 化 酵 素 活 性 のVmax値 はMPP'生 成 活 性 の 約1/100で あ っ た が ，Km値 は 約2pMと 高 い親 和性を 示した ．一方 ，ス ンクス ではMPTPハト酸 化酵素 活性は 定量限界以下であった．また，ラッ ト 脳毛 細血管 ホモジ ネート のMPTPN『ー 酸化酵 素活性 は脳 ホモジ ネート のll倍 以上で あった ことより，
FMOは脳毛細血管内皮細胞，すなわち，BBBに局在することが示唆された．
さ ら に ，MPTPを腹腔 内投与 した 場合， スンク スはラ ット に比べ て高い 脳内MPP+濃度を 示し，Cmaxお よ びTl/2は そ れ ぞ れ2倍 お よ び13倍 で あ っ た ．す な わ ち ，BBBに お けるFMO活 性が 低いス ンク スでは N‑酸 化 が 行 な わ れ に く く ， そ の 結 果MPP十 が 脳 内 に 蓄 積 す る も の と 考 え ら れ た ．
まと め
1） スン ク ス で はCYP3Aおよ びFM01〜5のmRNAの 発 現 量が 低 レ ベ ル であ っ た ． ま た，ス ンクス 肺に お いてCYP2Aの 高発 現が見 られた ．
2） スン ク ス 肺S−9を酵素 源とし てAmes試 験を行 ったと ころ ，NNK濃度依 存的に 復帰変 異コ ロニー 数の 増加 が認め られた ．
3） FMOの代 表 的 な 基 質のTMAのN‑酸 化 酵 素活 性 に お い て， ス ン ク ス はPM型 の フ ェノ タ イ プ を 示 し た，
4） MPTPを ス ン ク ス に 投 与 し た と こ ろ ， 毒 性 本 体 で あ るMPP゛ の 著 し い 脳 内 蓄 積 が 見ら れ た ． これ らの 知見か ら，ス ンクス は肺CYP2Aで 活性化されるニトロソアミン類の発がん性について，あるい は 魚 臭 症 候 群 の モ デ ル 動 物 に 代表 さ れ る ，FMO活 性 に おけ るPM型 の表 現 型 の 細vivo実 験モ デ ル と なる ことが 示され た．
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学位論文審査の要旨 主 査 教授 鎌滝哲也 副 査 教授 野村靖幸 副 査 教授 井関 健 副査 助教授 有吉範高
学 位 論 文 題 名
スンクスにおける薬物代謝酵素に関する研究
申 請者 は， ス ンク スの 実験 動 物と して の有 用性 評 価の一環として，主要組織 における薬物 代謝 酵素 の発 現 量及 び活 性を 調 べる こと を目 的と し ，世界的な研究成果を得た ．すなわち，
本研 究で は， ス ンク スは 肺チ トクロームP450 2A (CYP2A)で活性化されるニトロ ソアミン類の 発が ん性 につ い て， ある いは 魚 臭症 候群 のモ デル 動 物に代表される，フラビン 含有モノオキ シ ゲ ナ ー ゼ(FMO)活 性 に お け るpoor metabolizer (PM)型 の 表 現 型 を 示 す 細WVO実 験 モ デル とな るこ と が示 され た． 本 研究 は， スン クス を 用いた薬物動態試験や安全 性試験に有用 な 概 念 を 提 供 す る も の で あ り ， 以 下 に 詳 述 す る よ う に 極 め て 優 れ た 研 究 成 果 で あ る ．
1．スンク スの主要組織における種々の 薬物代謝酵素の発現
既に スン ク スはN‑ア セチ ル転 移 酵素(NAT)を 欠損 する こと が 明ら かに され てい る．本研究 で はNAT以 外 の薬 物 代謝 酵素 がス ンク ス で発 現し てい る か否 かを 調べ る目 的 で，7週 齢の ス ン ク ス の 主 要 組 織 よ り 総RNAを 調 製 し ，8種 類 のCYP，5種 類 のFMO，UDP−グ ルク ロ ン酸 転 移 酵 素(UGT)1．6， アリ ル硫 酸転 移酵 素 ，グ ルタ チオ ンS一転 移酵 素(GST)i， カル ポ キシ エ ステラーゼ およびエポキシドヒドロラ ーゼのcDNAをプローブとしてノーザンブロット分析を行っ た ． そ の 結 果 ， ス ン ク ス で はCYP3Aお よ びFM01‑‑‑5のmRNA発 現 レ ベ ル が 極 め て 低 い こ と が 判 明 し た ． さ ら に ， ス ン ク ス 肺 に お い て CYP2Aの 高 発 現 が 見 ら れ た ．
2．スンクスにおけ るCYPの発現量および酵素活 性
CYP3A誘 導 薬 デ キ サ メ タ ゾ ン を 投 与 し た ス ン ク ス 肝 で はCYP3AのmRNAの シ グ ナ ル が 検 出さ れ たこ とよ り， スン ク スで はCYP3A遺伝 子自 身は 存 在す るこ とが 示 され たが ，常在的な CYP3Aの 発現 量 は低 いこ とが 確認 さ れた ．ま た， スン ク ス肝ミクロゾームに おいて，CYP3Aに 特異的なミダゾラ ム水酸化酵素活性がラットの1/6であることが判明した．これらの結果より，ス ン ク ス はCYP3Aが 関 与 す る 代 謝 反 応 の PM型 の 表 現 型 を 示 す こ と が 示 唆 さ れ た ． ス ン クス肺のCYP2Aの発現量はラット，マウス の100倍以上であった．そこ で，スンクスおよ びラ ッ トの 肺ミ クロ ゾー ム を用 いて ，CYP2Aに特 異的 なSM―12502s一 酸 化酵 素活 性の速度論 的解 析 を行 った とこ ろ， ス ンク スにおけるVmax/Kmはラットに比べて99倍大 きい値であった．
さら に ，NNKを 被験 物質 とし て用 い たAmes試 験に おい て ，ス ンク ス肺S―9を 酵素 源として用 いた 場 合，NNK濃度 依存 的に 復帰 変 異コ ロニ ー数 の増 加 が認 めら れた ． 一方 ，ラ ット肺S−9 で は ，NNK濃 度 が増 加し ても コ ロニ ー数 は増 大し な かっ た， すな わ ち， 肺CYP2Aが代 謝的 活 性 化 に 関 与 す る 変 異 原 物 質 に 対 し て ， ス ン ク ス は 高 感 受 性 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た ．
3．スンクスにおけるトリ メチルアミンハド酸化酵素の 低発現：魚臭症候群の実験モデルとして 魚 臭症 候群 はFMOの 遺伝 的 欠損 が原 因と な る疾 患で ある ．こ の 疾患 の患 者は トリ メチルア ミ ン(TMA)を 」N一酸 化体(TMAO)に代 謝す るこ とが で きな いた め， 尿 ，汗 ，唾 液， 呼気 中 に 大 量 のTMAを 排 泄 す る 結 果 ， 魚 の よ う な ア ミ ン 臭 を 発 す る こ と が 知 ら れ て い る ， 肝 ミク ロゾームによるTMA N‑酸化酵素活性において， スンクスのlo'Xr‑Km酵素のパ ラメータ ーを ラッ トと比較したところ ，スンクスのKm値は2倍高く ，Vmax値は1/4であった．ス ンクス肝 ミク ロゾ ーム に よるTMAハ 冖 酸化 酵素 活性 はFMO阻 害薬 メ チマゾール，チオウレア， チオベン ズア ミド によ っ て活 性が96〜100％減 少し た が，CYP阻 害 薬の影響は見られなかった ．すなわ ち， スン クス に おけ るTMAハ 卜酸 化反 応に 関 与す る酵 素はCYPでは なく ，FMOで ある ことが示 された．スンクスとラット におけるTMAハ冖酸化酵素活 性の差はスンクスのVmaxが低いこと，す なわち，FMO酵素量が少な ぃことが原因と考えられた．
TMAを10 mg/kgの 用 量 で 腹 腔 内 投 与 し た と き ， 投 与 後24時 間 ま で の ス ン ク ス の 尿 中 TMA/TMAO比は1.42で あり ，こ の値 は 健常 人(0.05〜0.11)およ びラ ット （0．11）よ り13倍高 か っ た ． す な わ ち， スン クス はTMA N‑酸 化酵 素活 性 にお いてPM型 の 表現 型を 示し ，魚 臭 症 候群の実験モデルとなるこ とが示された，
4．パーキンソン病様症状誘発物質MPP゛のスンクス脳内への蓄積
パーキンソン病様症状誘発物質である1―メチル−4ーフェニル―1，2，3，6−テトラヒドロピリジン (MPTP)は 血 液 一 脳 関 門(BBB)を 通 過 後 ， 脳 内 の モ ノ ア ミ ン オ キ シ ダ ー ゼB(MAOーB） に よ り 代謝 中間 体で あ るMPDP十 を経 由し てMPP十へと活性化さ れたのち神経細胞死を引き起 こす．
MPTPの 解 毒 経 路 と し て は ，FMOに よ るN― 酸 化，CYPによ るN‑脱メ チル 化 が知 られ てい る・
そ こ で ，MPTPの 作 用 部 位 で あ る 脳 で のMPTP代 謝 に つ い て ， ス ン ク ス と ラッ トを 比較 し，
MPTPの解毒に対する脳内FMOの寄与を調べた，
スンクスと ラットの脳ホモジネートによるMPP十生成活性は同程度であった．また，ラット脳ホ モ ジ ネ ー ト に よ るMPTP N‑酸 化 酵 素 活 性 のVmax値 はMPP十 生 成 活 性 の 約1/100で あ っ た が ，Km値 は 約2pMと 高 い 親 和 性 を 示 し た ． 一 方， ス ンク スで はMPTPハ ド 酸化 酵素 活性 は定 量 限界 以下 であ っ た． また ，ラ ット 脳 毛細 血管 ホモ ジネ ー トのMPTP N‑酸化 酵素 活性 は脳ホ モ ジ ネ ー ト の11倍 以 上で あっ たこ と より ，FMOは 脳毛 細血 管内 皮 細胞 ，す なわ ち ，BBBに局 在することが示唆された．
さら に，MPTPを 腹腔 内投 与し た場 合 ，ス ンク スは ラッ ト に比 べて 高い 脳 内MPP十濃 度を示 し ，Cmaxお よ びTl/2は そ れ ぞ れ2倍 お よ び13倍 で あ っ た ． す な わ ち ，BBBに お け るFMO活 性 が低 いス ンク ス ではN‑酸 化が 行な われにくく，その結果MPP゛が脳内に蓄積するもの と考え られた，
以上 ，本 研究 では ， スン クスは肺CYP2Aで活性化されるニトロソ アミン類の発がん性につい て 高感受性 を示すことが示唆された， さらに，スンクスは魚臭症候 群のモデル動物に代表され る ，FMO活 性に お けるPM型 の表 現型 を 示す 而VI VO実験 モデ ルと な るこ とが 示さ れ ，世 界的 に もユ ニー クな 研究 を 展開 した ．本 論文 「 スン クス における薬物 代謝酵素に関する研究」に 含 まれ る研 究成 果は 薬 学に おけ る基 礎お よ び応 用の いずれにおい ても優れており，博士（薬 学 ）の 学位 を受 ける に 充分 値す るも のと 認 めら れた ，
