ヒ Na 十，
抗癌剤
博士（歯学）金田泰幸 学位論文題名
ト 培 養 歯 肉 癌 細 胞 株 (Ca9 ― 22 細 胞 ） の K+ ― ATPase の部 分精製と その性質 および cis‑diamminedichloroplatinum （H ）による その活性阻害と回復
学位論文内容の要旨
抗癌剤であるcis−diamminedichloroplatinum（H）（シスプラチン）とNa+，K+‑
ATPaseに関してはすでに多くの報告があり、それらをまとめると、シスプラチン によるNa+，K+―ATPase活性の阻害は、大きく3つの点から抗癌作用に関連して いる。1っはシスプラチンの細胞内への輸送にNa+，K+ーATPaseが関与している ということである。2つ目はパイオケミカルモジュレーションであり、シスプラ チンによるNa+，K+‑ATPase活性の阻害は癌細胞内のヌチオニン量を減少させ、
結果として5ーフルオロウラシルの効果を増強するというものである。3つ目は Na+．K+―ATPaseは腎臓においてナトリウムと水の再吸収に関与していることか ら、シスプラチンによる腎毒性にNa+，K+‑ATPaseの阻害が関与している可能性 である。このようにシスプラチンとNa+，K+―AI丶Paseの関連は重要であり、また 多くの研究にもかかわらずシスプラチンによるNa+，K+―AI丶Pase活性阻害機構を 初めとして、不明な点は多い。
そこで、本研究では癌細胞のNa+，K+―ATPaseに対するシスプラチンの作用を 詳細に検討し、癌細胞のNa+，K+一ATPaseと正常細胞のNa十，K十‑ATPaseを比較 する目的のために、まずヒト口腔扁平上皮癌細胞株(Ca9ー22細胞）より簡便でかつ 精製度の 高いNa+，K+一ATPaseの部分精製法を確立し、ついでこのNa+，K+― ATPase標品の性質を調べ、さらにこの標品を用いてシスプラチンのNa+，K+― ATPase活 性 阻 害 機 構 と 、 活 性 阻 害 を 軽 減 す る 薬 物 に つ い て 検 討 し た 。
材料と方法
ヒト培養歯肉癌細胞株(Ca9―22細胞）を通法に従い、40ディッシュ（直径10セン チメートル）で培養した。細胞は培養開始約4日後にコンフルエントになり、4デ イッシュを継代培養に用い、残り36ディッシュはコンフルエント後4日目に細胞を 回収した。これを順次6〜8回繰り返し、216〜288ディッシュ分の細胞を一回の部 分精製に用いた。回収したCa9―22細胞を氷中にて超音波破砕処理を行いホモジネ ートを得て、ホモジネートを遠心し膜分画として回収した。Ca9―22細胞の膜分画
の 最 適 な ド デ シ ル 硫 酸 ナ ト リ ウ ム(SDS)に よ る 可 溶 化 の 条 件 を 決 定 す る た め に、種々の濃度のSDSが膜分画のNa＋，K十一ATPase活性に与える影響を調べた。l mgのタ ンパ ク質 あたり0．25mgのSDSで処 理し て得 られ た酵 素が 、活 性の 回収率 も 高く 、最 大の 比活性 を示 した 。SDS処 理し た膜分画を、J￠rgensenの方法の変 法であるPostらの方法に従って蔗糖密度勾配遠心を行い、Na十，K十一ATPase活性 の ある 白濁 した バンドと沈渣を得た。酵素活性測定は、酵素反応の結果生じた無 機リン酸をC1ifnetらの方法に従って定量した。
結果
上記 の方 法に よっ てCa9−22細胞 の膜 分画 から80％以上の回収率で比活性5倍の Naj‑，K+ーATPaseを 部分精 製し た。 得ら れた 標品 の酵素化学的性質を調べたとこ ろ 、Na+に 対す る 親 和 性 が 変 化 し てい る可 能性 が示 され た。 そこ でNa十．K十一 ATPaseのり ン酸 化中 間体形 成のNa十 濃度 依存 性を 調べたところヒト口腔扁平上皮 癌 細 胞 株(Ca9ー22，HSCー3細 胞 ） お よ び ヒ 卜 類上 皮 癌 細 胞 株KB細 胞 と 腎 臓 の Na ‑，K+一ATPaseと の間にNa+に対する親和性の差はなく、腎臓や脳などの精製度 が高いNa+，K+ーATPaseと同様の性質を示した。
得 ら れ た 標 品 を 用 い て 、 シ ス プラ チン によ るNa+，K+‑ATPase活 性の 阻害 機構 と、活性阻害を軽減する薬物について検討した。その結果、シスプラチンは濃度の み なら ず時 間に も依 存してNa+，K+―ATPase活性を阻害した。活性の阻害はチオー ル化合物である2―メルカプトエタノール（2―ME)，ダイチオスレイトール(DTT)，グ ル タチ オン を添 加す ると経 時的 に回 復し 、2―MEとグルタチオンでは添加後2時間 で20％、DTTでは完全に回復した。
次にNa+，K+一ATPaseの 分子 構造 変化 がシ スプ ラチンによるNa+，K+―ATPase活 性の阻害に影響するか否かを確かめる目的で、シスプラチンによる活性阻害に対す るNa+、K+、ATPの 影 響 を 調 べ た 。Na+、K+、ATP非 存 在 下 で は 、 酵 素 活 性 は4 時 間 後 に は 完 全 に 阻 害 さ れ た が 、ATP単独 添加 によ り20％、Na+、K+の 単独 、あ る い は 両 者 を 同 時 に 添 加 す る こ と に よ り 約40％ の 活 性 が 残 存 し た 。 考察
精製 に用 いた 方法 は、 基本的にはJorgensenが犬の腎臓からNa十，K+―ATPaseを 精 製す るの に用 いて 成功 した 、ATP存在 下で 酵素 の活 性中心を保護しながらSDSで 酵素を可溶化して精製する方法である。この方法のポイントは酵素のタンパク質量 に 対 す るSDSの 比率で あり 、Ca9―22細 胞の 場合は 腎臓 と比 べて 半分 のSDS濃度 に お いて 最適 な精 製標 品が 得られた。この結果はCa9―22細胞以外にも培養細胞を用 い てNa+，K+―ATPaseを簡 便でかつ高い精製度で精製を行う上で、有用な結果であ る。
歯肉 癌細 胞か ら得 られ たNa+，K+‑ATPaseが正 常な臓 器から得られた酵素とその 性質に違いがあるか否かを調べることを目的として、酵素の基本的な性質を調べた 今 回の 結果 から は、 癌細 胞と正常細胞のNa+，K+ーATPaseの性質の違いは観察され なかった。
チオ ール 化合 物が シス プラ チンによるNa+，K+ーATPase活性の阻害を直接保護し う ることを示し、シスプラチンによる腎毒性を軽減する方法とその機構を考える上 で興味深い結果を得た。
Na十 ．K十一ATPaseの コン フオ ーメ ーシ ョン が存 在す るNa+、K+、ATPなど のり ガ ン ド に よっ て異 なる こと はよく 知ら れて いる 。シ スプ ラチ ンに よるNa+，K+一 ATPase阻害 の時 間経 過は 存在 する りガン ドに よっ て異 なっ たことより、シスプラ チ ン がNa+，K+ーATPaseの 活 性 中 心 付 近 の チ オ ー ル 残 基 に 結 合 す る の な ら 、 そのチオール残基近傍の構造がNa十、K十、バT丶Pなどの存在によってシスプラチン が 結合 しに くい 構造 に変 化す る可能性があり、シスプラチンのNa+，K+―ATPaseへ の結合モデルを考える上で興味深い結果が得られた。
結論
1．ヒト培養歯肉癌細胞株(Ca9ー22細胞）からシスプラチシの阻害作用を詳細に解析す る の に 十分 な精 製度 のNa+，K+―ATPaseを簡 便に 部分 精製 する 方法 を確 立し た。
2．得られた標品の性質を調べた結果からは、癌細胞株と腎臓のNa+，K+ーATPaseに は性質の違いはみられなかった。
3．精製した標品を用いて、2−ME，グルタチオン，DTTなどのチオール化合物はシス プ ラ チ ンに よるNa+，K+‑ATPase活 性阻 害を 可逆 的に 回復 しうる こと と、Na+，K+
‑ATPaseの コン フオ ーメ ーシ ョンの 変化 がシ スプ ラチ ンに よる 活性 の阻 害に 影響 することを明らかにした。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
ヒ ト 培 養 歯 肉 癌 細 胞 株 (Ca9 ― 22 細 胞 ） の Na ＋， K+ ― ATPase の部 分精 製と その 性質 およ び 抗癌剤 cis‑diamminedichloroplatinum （ H ）による その活性阻害と回復
審査 は、審査 担当者全 員が一堂 に会し、口頭にて行った。まず、論文提出者に研究 の概 要の説明 を求めた 。論文の 概要は以下 の通りで ある。
抗癌 剤 シ スプ ラ チン とNa+，K+‑ATPaseに 関し て多くの 報告があ り、シス プラチン によ るNa+，K+ーATPase活 性阻害は 、シスプラチンの細胞内への輸送やノヾイオケミカ ル モ ジュ レ ーシ ョンお よびシス プラチン による腎 毒性と、 大きく3つの 点から抗 癌作 用 に 関連 す る。 シスプ ラチンとNa+，K+―ATPaseの関 連は重要 であり、 多くの研究 が な さ れて い るが 不明な 点が多い 。本研究 では癌細 胞のNa+，K+―ATPaseに対するシ ス プラ チンの作 用を詳細 に検討す るために、 まずヒト 口腔扁平 上皮癌細 胞株(Ca9ー22細 胞） より簡便 でかつ精 製度の高 いNa+，K+‑ATPaseの部分 精製法を 確立し、標品の性質 を調ぺ、シスプラチンのNa+，K‑r‑̲」6汀Pase活性阻害機構と、活性阻害を軽減する薬物 について検討した。
方法および結果
ヒト 培養歯肉 癌細胞株（Ca9―22細胞）を通法に従い培養し、膜分画を得た。Ca9←22細 胞 の 膜分 画 の最 適なド デシル硫 酸ナトリ ウム（SDS） による可 溶化条件を 決定した 。 SDS処理した膜分画から高回収率でNa＋，K十一ATPaseを部分精製し、比活性は5倍増加 した。酵素化学的性質を調べた結果、他の癌細胞も含めて腎臓のNa十，K十ーパI丶Paseと の差 はみられ なかった 。シスプ ラチンによ るNa十，K十―ATPase活性の阻害機構と、活 性阻 害を軽減 する薬物 について 検討した。 シスプラ チンは濃 度のみな らず時間にも依 存 し て活 性 を阻 害した 。活性阻 害はチオ ール化合 物である2―メルカプ トエタノ ール
（2―ME），ダイチオスレイトール（D′IT），グルタチオンを添加すると経時的に回復した。
次にNa十，K十一ATPaseの分子構 造変化が シスプラチンによる活性阻害に影響するか否 かを 確かめる ため、シ スプラチ ンによる活 性阻害に 対するNa十 、K十、A1、Pの影響を
博 男
章
隆
田 後
本
福 向
松
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
調 べ た 。Na+、K+、ATP非 存 在下 で は 、酵 素活 性は4時間 後に は完 全に 阻害 され た が 、ATP単 独添 加に より20％ 、Na+、K+の単 独、 ある いは 両者 を同 時に 添加 する こ と に よ っ て 約40％ の 活 性 が 残存 し た 。
考察および結論
精製 に用 いた 方法 は、ATP存 在下 で酵 素の 活性 中心 を保 護しながら、SDSで酵素を可 溶化 して 精製 する 方法 であ る。この方法のポイントはSDSの濃度である。細胞の場合 には低濃度のSDS処理でよいことが分かり、培養細胞のNa＋，K十―ATPaseの精製を行 う上で、有用な結果が得られた。今回の結果からは、癌細胞と正常細胞のNa…，K十一 バI｀Paseの性質の違いはないと考えられる。．チオール化合物がシスプラチンによる活 性阻害を直接保護しうることを示し、シスプラチンによる腎毒性を軽減する方法とそ の機構を考える上で興味深い結果を得た。シスプラチンによる活性阻害の時間経過は 存在するりガンドによって異なり、Na十，K十―ATPaseの活性中心付近のシステイン残 基近傍の構造がシスプラチンが結合しにくい構造に変化する可能性があり、シスプラ チ ン のNa十，K十ぞ 汀Paseへ の結 合モ デル を考 える 上で 興味 深い 結果 が得ら れた 。 1．ヒト培養歯肉癌細胞株からシスプラチンの阻害作用を詳細に解析するのに十分な精 製 度 の Na十 ， K十 ― ATPaseを 簡 便 に 部 分 精 製 す る 方 法 を 確 立 し た 。 2． 癌 細 胞 株 と 腎 臓 のNa十 ，K十 一ATPaseに は 性 質 の 違 い は み ら れ な か っ た 。 3．DTT、2―ME、グ ルタ チオ ンな どの チオ ール 化合 物は シス プラ チン によるNa十 ， K十一バrPase活性阻害を可逆的に回復しうることと、Na十，K十―ATPaseの分子構造の 変 化 が シ ス プ ラ チ ン に よ る 活 性 阻 害 に 影 響 す る と 考 え ら れ た 。
続いて、審査担当者から本研究およびその関連事項について、以下のような種々の 質問がされた。
1）実験方法に関して、
（1）本 研究で 使用 したNa+，K+‑ATPase標品と従来の研究に使用されていた標品 とはどんな点で違うのか？
(2)工夫した点
2）実験結果に関して、
（1）図表などに関する詳細
(2)腎で、Naのみに差があることについて
3） 本 研 究 の 独 創 性 、 本 研 究 の 今 後 の 発 展 性 お よ び 臨 床 応 用 に つ い て 4）その他ATPaseの分子構造の変化についてなど
こ れ ら の 質 問 に 対 し て 、 論 文 提 出 者 は そ れ ぞ れ 明 快 に 回 答 し た 。 以上より、本論文提出者が、本論文を中心に広い知識を有することが確認された。
また、本論文は、研究の方向性および臨床との関連性がはっきりしており、さらに、
現 時 点 で の 問 題 点 、 今 後 の 発 展 性 が 明 確 で あ る こ と も 高 く 評 価 さ れ た 。 したがって、本論文の提出者が博士（歯学）を授与するに値するものと判定された。
