博 士 論 文 概 要
論 文 題 目
RIG-I-like receptor による 抗ウイルス自然免疫機構の解析
Analysis of antiviral innate immunity regulated by RIG-I-like receptor
申 請 者
小野口 和英
Kazuhide Onoguchi
生命理工学専攻・生体制御研究
2010 年 9 月
Ｎｏ.1
ウ イ ル ス 感 染 に 対 し て 、 我 々 の 体 は 自 然 免 疫 と 獲 得 免 疫 と い う ２ つ の 免 疫 機 構 を 駆 使 し て 命 を 守 っ て い る 。 そ の 中 で 自 然 免 疫 は サ イ ト カ イ ン と 呼 ば れ る 多 数 の 液 性 タ ン パ ク 因 子 を 分 泌 し 、 こ れ ら サ イ ト カ イ ン が 協 調 し て 機 能 す る こ と で ウ イ ル ス が 駆 除 さ れ る 。2 0 0 4 年 に 本 研 究 を 行 う に あ た り ご 指 導 頂 い た 東 京 都 臨 床 医 学 総 合 研 究 所 の 藤 田 尚 志 教 授 （ 現 京 都 大 学 ウ イ ル ス 研 究 所 ） ら の グ ル ー プ は 、 細 胞 内 で ウ イ ル ス 感 染 を 認 識 す る セ ン サ ー 分 子 R e t i n o i c A c i d I n d u c i b l e G e n e I ( R I G - I ) - L i k e R e c e p t o r ( R L R )フ ァ ミ リ ー を 報 告 し た 。R L R は ウ イ ル ス 由 来 の R N A を 特 異 的 に 検 知 す る こ と で イ ン タ ー フ ェ ロ ン( I n t e r f e r o n : I F N )や 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン と 呼 ば れ る 免 疫 遺 伝 子 を 活 性 化 し 、 抗 ウ イ ル ス 自 然 免 疫 機 構 を 誘 導 す る 。R L R に よ る ウ イ ル ス 感 染 の 認 識 機 構 か ら I F N 等 の 免 疫 遺 伝 子 が 誘 導 さ れ る ま で の シ グ ナ ル 経 路 に つ い て は 近 年 多 数 の 報 告 が な さ れ て い る 。 し か し 、R L R に よ っ て 誘 導 さ れ る 遺 伝 子 に は ど の よ う な も の が あ る の か 、ま た R L R か ら の シ グ ナ ル は ど の よ う に 制 御 さ れ て い る の か 等 不 明 な 点 も 多 い 。特 に R L R の ア ダ プ タ ー 分 子 で あ る I n t e r f e r o n P r o m o t e r S t i m u l a t o r 1 ( I P S - 1 : 別 名 M AV S , V I S A , C a r d i f ) が ど の よ う に し て 制 御 さ れ て い る の か に つ い て は 十 分 に 検 討 さ れ て い な い 。 I P S - 1 は ミ ト コ ン ド リ ア の 外 膜 に 発 現 す る 膜 タ ン パ ク 質 で あ り 、 ミ ト コ ン ド リ ア に 局 在 す る 事 が I P S - 1 の 機 能 に 必 須 で あ る 事 が わ か っ て い る 。 ど の よ う に し て ミ ト コ ン ド リ ア が R L R 及 び I P S - 1 の シ グ ナ ル に 関 与 し て い る の か 、 こ れ は ミ ト コ ン ド リ ア の 新 し い 機 能 を 検 討 す る 重 要 な テ ー マ で あ る 。本 研 究 で は R L R に よ り 誘 導 さ れ る 新 規 遺 伝 子 の 解 析 と 、I P S - 1 及 び ミ ト コ ン ド リ ア に よ る R L R シ グ ナ ル の 制 御 機 構 に つ い て 解 析 を 行 っ た 。
第 一 章 で は こ れ ま で に 明 ら か と さ れ た R L R の 活 性 化 機 構 と シ グ ナ ル 伝 達 経 路 、 及 び I F N 作 用 機 構 に つ い て 概 説 す る 。R L R は R I G - I、M D A 5 , そ し て L G P 2 の ３ つ の フ ァ ミ リ ー 分 子 か ら な る が 、R I G - I 及 び M D A 5 は そ れ ぞ れ 異 な る ウ イ ル ス 種 の 感 染 を 認 識 し て 活 性 化 す る 事 が 報 告 さ れ て い る 。 一 方 で L G P 2 は R I G - I / M D A 5 が ウ イ ル ス R N A と 結 合 す る 際 に 補 助 的 な 役 割 を 果 た し て い る と 考 え ら れ て い る 。 活 性 化 し た R I G - I / M D A 5 は 一 連 の シ グ ナ ル 分 子 を 介 し て I F N 遺 伝 子 を 活 性 化 し 、 そ の 後 I F N は 細 胞 外 へ と 分 泌 さ れ る 。 分 泌 し た I F N は 細 胞 表 面 に 発 現 す る I F N 受 容 体 に 結 合 し 、J A K - S TAT と 呼 ば れ る シ グ ナ ル 経 路 を 介 し て 抗 ウ イ ル ス 活 性 等 を も つ 数 百 も の 遺 伝 子 の 発 現 誘 導 を 行 う 。 こ れ に よ り 細 胞 は 抗 ウ イ ル ス 活 性 を 持 つ よ う に な り 、 ウ イ ル ス を 速 や か に 駆 除 で き る よ う に な る 。
第 二 章 で は R L R に よ る I I I 型 I F N 誘 導 機 構 に つ い て の 本 研 究 成 果 を 報 告 す る 。 I F N は 遺 伝 子 の 相 同 性 及 び 作 用 す る 受 容 体 の 違 い に よ り 、 I 型 ( I F N - a l p h a , - b e t a )及 び I I 型 I F N ( I F N - g a m m a )の ２ つ に 大 別 さ れ る が 、2 0 0 2 年 に ２ つ の グ ル ー プ が 抗 ウ イ ル ス 活 性 を も つ サ イ ト カ イ ン と し て I F N - l a m b d a を 報 告 し 、 作 用 す る 受 容 体 が I 型 I F N 及 び I I 型 I F N と は 異 な る こ と か ら I I I 型 I F N と 分 類 さ れ る よ う に な っ た 。I I I 型 I F N に は I F N - l a m b d a 1（ 別 名 I L - 2 9）、- l a m b d a 2（ 同 I L - 2 8 a）、
及 び l a m b d a 3（ 同 I L - 2 8 b） が 含 ま れ 、 遺 伝 子 の 配 列 は 他 の I F N よ り I L - 1 0 遺 伝 子 に 近 く 、I 型 I F N や I I 型 I F N と の 遺 伝 子 間 の 相 同 性 は 低 い 。I I I 型 I F N も I 型 I F N と 同 様 に ウ イ ル ス 感 染 に よ っ て 誘 導 さ れ る 事 が 示 唆 さ れ て い た が 、そ の 詳 細 な 発 現 機 構 に つ い て は 不 明 で あ っ た 。 そ れ ま で R L R は I 型 I F N を 誘 導 す る 事 が 知 ら れ て い た が 、R L R か ら の シ グ ナ ル が 他 の 免 疫 遺 伝 子 の 誘 導 に も 重 要 で あ る 事 を 検 討 す る 為 に 、R L R に よ る I I I 型 I F N 誘 導 機 構 に に つ い て 解 析 を 行 っ た 。ま ず I 型 I F N 誘 導 シ グ ナ ル の 解 析 に よ り 樹 立 さ れ て い た ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス 由 来 の 胎 児 繊 維 芽 細 胞 ( M o u s e E m b r y o n i c F i b r o b l a s t : M E F )を 用 い て 、ウ イ ル ス 感 染 時 に お け る I I I 型 I F N の 誘 導 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、I 型 I F N の 転 写 因 子 で あ る I n t e r f e r o n R e g u l a t o r y F a c t o r 3 ( I R F - 3 )が I I I 型 I F N の 誘 導 に も 必 須 で あ る 事 が わ か っ た 。 ま た R I G - I ノ ッ ク ア ウ ト M E F も ウ イ ル ス 感 染 時 に お け る I I I 型 I F N の 誘 導 を 抑 制 し て い た こ と か ら 、R L Rか ら の シ グ ナ ル が I R F - 3を 介 し て I I I 型 I F N を 誘 導 す る 事 が 示 唆 さ れ た 。 反 対 に 、R I G - I や I R F - 3 の 活 性 化 型 変 異 体 を 強 制 発 現 さ せ る と 、I 型 I F N 同 様 に I I I 型 I F N も 誘 導 さ れ る 事 が わ か っ た 。 以 上 の 結 果 か ら I 型 I F N と I I I 型 I F N が 共 通 の シ グ ナ ル 経 路 を 介 し て 誘 導 さ れ る と 考 え ら れ た 。 シ グ ナ ル 経 路 の 解 析 に 加 え 、 本 研 究 で は I I I 型 I F N 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の 解 析 も 行 っ た 。 ヒ ト I F N - l a m b d a 1 遺 伝 子 の 転 写 開 始 部 位 を R a p i d A m p l i f i c a t i o n o f c D N A E n d s ( R A C E ) 法 を 用 い て 検 討 し た 結 果 、 ヒ ト I F N - l a m b d a 1 遺 伝 子 の 転 写 開 始 部 位 は 翻 訳 開 始 コ ド ン の 1 5 塩 基 上 流 で あ る 事 が 推 定 さ れ た 。続 け て 転 写 開 始 点 近 傍 の ゲ ノ ム 配 列 の 解 析 を 行 い 、ヒ ト I F N - l a m b d a 1 遺 伝 子 の エ ン ハ ン サ ー エ レ メ ン ト の 同 定 を 試 み た 。 コ ン ピ ュ ー タ 解 析 及 び 変 異 体 を 用 い た レ ポ ー タ ー ア ッ セ イ の 結 果 か ら 、複 数 の I R F 結 合 部 位（- 2 1 4 -か ら- 1 7 2 塩 基 ） 及 び 単 独 の N F -κB 結 合 部 位 （- 9 8 か ら- 8 9 塩 基 ） が 転 写 開 始 点 の 上 流 に 存 在 す る 事 が わ か っ た 。 こ の 複 数 の I R F 結 合 部 位 及 び 単 独 の N F -κB 結 合 部 位 の 組 み 合 わ せ か ら な る エ ン ハ ン サ ー 様 式 は 、I 型 I F N 遺 伝 子 で あ る I F N - b e t a 遺 伝 子 の エ ン ハ ン サ ー 領 域 に 見 ら れ る 特 徴 で あ り 、I 型 I F N 及 び I I I 型 I F N が 同 一 の シ グ ナ ル 経 路 に よ っ て 制 御 さ れ る 結 果 を 反 映 し て い た 。ま た ヒ ト I F N - l a m b d a 1 遺 伝 子 に 限 ら ず 、ヒ ト I F N - l a m b d a 2 遺 伝 子 に も 同 様 な 傾 向 が あ る 事 が コ ン ピ ュ ー タ 解 析 の 結 果 か ら 得 ら れ た 。 以 上 の こ と か ら 、R L R は I 型 I F N 及 び I I I 型 I F N を 共 通 の シ グ ナ ル 経 路 に よ り 誘 導 し て い る 事 が 明 ら か と な り 、 ウ イ ル ス 感 染 時 に お け る 自 然 免 疫 の 中 心 的 な 役 割 を R L R が 果 た し て い る と 考 え ら れ た 。
第 三 章 で は R L R の ア ダ プ タ ー 分 子 で あ る I P S - 1 の 活 性 化 機 構 に つ い て 報 告 す る 。R L R シ グ ナ ル の 制 御 機 構 を 明 ら か と す る 為 、I P S - 1 の 局 在 に つ い て 解 析 を 進 め た と こ ろ 、 通 常 全 て の ミ ト コ ン ド リ ア に 均 等 に 分 布 し て い る I P S - 1 が 、 ウ イ ル ス 感 染 時 に 一 部 の ミ ト コ ン ド リ ア に 集 積 し て い る 事 が わ か っ た 。 こ の I P S - 1 の 集 積 は 非 活 性 化 型 の R I G - I 変 異 体 を 発 現 さ せ た 細 胞 で は 誘 導 さ れ な い 事 か ら 、R L R の 活 性 化 に 依 存 し て 起 こ る と 考 え ら れ る 。 次 に I P S - 1 が 集 積 し て い る 場 所 に つ い
Ｎｏ.3
て 検 討 し た と こ ろ 、I P S - 1 は ウ イ ル ス 複 製 部 位 の 近 傍 に 集 ま っ て い る 事 が 示 唆 さ れ た 。 電 子 顕 微 鏡 を 用 い た よ り 詳 細 な 解 析 結 果 で も 同 様 の 結 果 を 確 認 す る 事 が で き 、I P S - 1 及 び ミ ト コ ン ド リ ア が ウ イ ル ス 複 製 部 位 の 周 囲 に 集 ま る 事 が わ か っ た 。 こ れ は R L R が ウ イ ル ス 複 製 部 位 で 活 性 化 し た 後 、I P S - 1 及 び ミ ト コ ン ド リ ア を R L R が 引 き つ け て い る と 推 察 さ れ る 。
I P S - 1 の 局 在 変 化 に 加 え 、本 研 究 で は R L R シ グ ナ ル を 制 御 す る 新 規 分 子 と し て M i t o f u s i n 1（M F N 1） を ス ク リ ー ニ ン グ に よ り 同 定 し た 。M F N 1 は ミ ト コ ン ド リ ア の 外 膜 に 局 在 し 、 ミ ト コ ン ド リ ア の 融 合 を 制 御 す る 分 子 で あ る 。M F N 1 ノ ッ ク ア ウ ト M E F を 用 い た 実 験 や 、R N A i 法 に よ り M F N 1 を ノ ッ ク ダ ウ ン し た 細 胞 を 用 い た 実 験 の 結 果 、M F N 1 非 存 在 下 で は ウ イ ル ス 感 染 時 に お け る I 型 I F N の 産 生 量 が 著 し く 低 下 す る 事 が わ か っ た 。 反 対 に 、M F N 1 を 強 制 発 現 さ せ る と ウ イ ル ス 感 染 に よ る I F N 産 生 能 が 増 加 し て い た 。ま た 、M F N 1 が ミ ト コ ン ド リ ア の 融 合 を 制 御 す る 事 か ら 、 他 の 融 合 及 び 分 裂 を 制 御 す る 分 子 に つ い て も 検 討 を 行 っ た 。 ミ ト コ ン ド リ ア 内 膜 の 融 合 を 制 御 す る O p t i c A t r o p h y P r o t e i n 1 ( O PA 1 )も I 型 I F N の 発 現 に 必 要 で あ る 事 が 示 唆 さ れ た が 、 ミ ト コ ン ド リ ア の 分 裂 を 制 御 す る 分 子 D y n a m i n R e l a t e d P r o t e i n 1 ( D R P 1 )を ノ ッ ク ダ ウ ン し て も I 型 I F N の 発 現 量 に 変 化 は 見 ら れ な か っ た 。 よ っ て 、 ミ ト コ ン ド リ ア の 融 合 機 構 が ウ イ ル ス 感 染 時 に お け る I F N 産 生 に 重 要 で あ る と 考 え ら れ た 。さ ら に 、ミ ト コ ン ド リ ア 融 合 機 構 が I P S - 1 の 集 積 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た の で 、I P S - 1 と M F N 1 の 関 係 に つ い て 解 析 を 行 っ た 。M F N 1 を R N A i 法 に よ り ノ ッ ク ダ ウ ン し た 細 胞 に ウ イ ル ス を 感 染 さ せ I P S - 1 の 局 在 を 調 べ た と こ ろ 、M F N 1 を ノ ッ ク ダ ウ ン し た 細 胞 で は I P S - 1 の 集 積 が 起 き な い 事 が わ か っ た 。 よ っ て 、M F N 1 は ウ イ ル ス 感 染 時 に お け る I P S - 1 の 集 積 を 制 御 し て お り 、そ の 集 積 が I F N 遺 伝 子 の 活 性 化 に 重 要 で あ る 事 が 示 唆 さ れ た 。 以 上 の 結 果 を ま と め る と 、M F N 1 及 び O PA 1 を 介 し た ミ ト コ ン ド リ ア の 融 合 が I P S - 1 の ミ ト コ ン ド リ ア 間 移 動 を 可 能 と し 、こ れ に よ り I P S - 1 が 集 積 し て い る と 考 え ら れ る 。I P S - 1 は 多 量 体 を 形 成 す る 事 で 活 性 化 す る 事 が 報 告 さ れ て お り 、I P S - 1 の 多 量 形 成 に ミ ト コ ン ド リ ア 融 合 を 介 し た I P S - 1 の 集 積 が 関 係 し て い る と 推 察 さ れ る 。
第 四 章 で は 本 研 究 の 成 果 を 総 括 し 、 今 後 の 展 望 に つ い て 述 べ る 。 本 研 究 に よ り R L R か ら の シ グ ナ ル が I 型 I F N だ け で な く 、 進 化 的 に も 異 な る I I I 型 I F N 遺 伝 子 の 誘 導 も 制 御 し て い た こ と か ら 、R L R か ら の シ グ ナ ル が 多 様 な 抗 ウ イ ル ス 自 然 免 疫 遺 伝 子 に 重 要 で あ る 事 が わ か っ た 。 ま た R L R か ら の シ グ ナ ル を 受 け 取 る I P S - 1 は 、 ミ ト コ ン ド リ ア の 融 合 機 構 に よ り 活 性 化 が 制 御 さ れ て い る 事 が 示 唆 さ れ た 。 こ れ は ミ ト コ ン ド リ ア が 抗 ウ イ ル ス 自 然 免 疫 機 能 を 調 整 す る と い う 新 し い 発 見 で あ り 、更 な る 解 析 が 望 ま れ る 。今 後 の 展 望 と し て は R L R に よ る 免 疫 活 性 を 標 的 と し た 新 規 治 療 法 や 免 疫 力 強 化 の 薬 剤 開 発 等 の 応 用 研 究 を 進 め る 事 で 、 新 興 ウ イ ル ス 感 染 症 に 対 抗 で き る 治 療 法 の 確 立 を 目 指 し た い 。
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
氏 名 小野口和英 印
（２０１０ 年 9 月 現在）
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
学術 ○ 論文
○
学会発表
1. Viral Infections Activate Type I and III Interferon Genes through a Common Mechanism. The Journal of Biological Chemistry, vol.282, No.10, pp.7576-7581, March 9, 2007.
Kazuhide Onoguchi, Mitsutoshi Yoneyama, Azumi Takemura, Shizuo Akira, Tadatsugu Taniguchi, Hideo Namiki, and Takashi Fujita.
2. Virus-infection or 5’ppp-RNA activates antiviral signal through Redistribution of IPS-1 mediated by MFN1. PLoS Pathogens, 6(7), e1001012, July 22,2010.
Kazuhide Onoguchi, Koji Onomoto, Shiori Takamatsu, Michihiko Jogi, Azumi Takemura, Shiho Morimoto, Ilkka Julkunen, Hideo Namiki, Mitsutoshi Yoneyama, and Takashi Fujita.
1. III型インターフェロンはI型インターフェロンと同じ転写制御を受ける.
ポスター発表, 日本分子生物学会2006フォーラム, 2006年.
小 野 口 和 英, 米山光俊, 竹村明澄, 審良静男, 谷口維紹, 藤田尚志.
2. III型インターフェロンはI型インターフェロンと同じ転写制御を受ける.
ポスター発表, 日本インターフェロン・サイトカイン学会学術集会, 2007年.
小 野 口 和 英, 米山光俊, 竹村明澄, 審良静男, 谷口維紹, 藤田尚志.
3. ウイルス感染時におけるIPS-1およびミトコンドリアの局在と機能解析.
ポスター発表, 日本インターフェロン・サイトカイン学会学術集会, 2009年.
小 野 口 和 英, 米山光俊, 藤田尚志.
4. Mitochondrial dynamics and innate antiviral responses regulated by RIG-I-like receptor.
ポスター発表, The 9th Awaji international forum on infection and immunity, 2009.
Kazuhide Onoguchi, Mitsutoshi Yoneyama, and Takashi Fujita.
5. Mitochondrial dynamics and innate antiviral responses regulated by RIG-I-like receptor.
ポスター発表, Tri-Society Annual Conference, 2009.
Kazuhide Onoguchi, Mitsutoshi Yoneyama, and Takashi Fujita.
6. Regulation of innate antiviral signaling mediated by mitochondria.
口 頭 発 表 ・ ポ ス タ ー 発 表, The 17th East Asia Joint and 9th Cross-Strait Symposium on Biomedical Research, 2010.
Kazuhide Onoguchi and Takashi Fujita.
Ｎｏ.2
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
学会発表
総説
7. The local condensation of IPS-1 mediated by mitochondrial dynamics.
ポスター発表, The 14th International Congress of Immunology, 2010.
Kazuhide Onoguchi, Mitsutoshi Yoneyama, and Takashi Fujita.
1. 細胞内受容体によるウイルス感染の認識機構.
実験医学増刊「解明が進むウイルス・細菌感染と免疫応答」, Vol.23, No.17, pp.2673-2680, 2005 年.
小 野 口 和 英 , 藤田尚志.
2. インターフェロンレセプター.
臨床免疫, Vol.45, No.4, pp.381 -385, 2006 年.
小 野 口 和 英 , 藤田尚志.
3. 細胞内ウイルスセンサーによるインターフェロン誘導機構.
炎症と免疫, Vol.15, No.2, pp.167 -172, 2007 年.
小 野 口 和 英 , 米山光俊, 藤田尚志.
4. 自然免疫によるウイルス感染防御機構.
細胞工学, Vol.27, No.12, pp. 1256 -1260, 2008 年.
小 野 口 和 英 , 米山光俊, 藤田尚志.
5. ウイルス核酸の認識と抗ウイルス自然免疫反応.
医学のあゆみ, Vol.229, No.11, pp.1047 -1050, 2009 年.
小 野 口 和 英 , 米山光俊, 藤田尚志.
6. 自己・非自己 RNA の識別を基盤とした抗ウイルス免疫機構.
蛋白質核酸酵素増刊「mRNA プログラム 多様性と非対称性の獲得戦略」, Vol.54, No.16, pp. 2226-2232, 2009 年.
小 野 口 和 英 , 米山光俊.
7. Triggering antiviral response by RIG-I-related RNA helicases.
Biochimie, vol.89, No. 6-7, pp.754-760, Feburary 9, 2007.
Takashi Fujita, Kazuhide Onoguchi, Koji Onomoto, Reiko Hirai, and Mitsutoshi Yoneyama.
