急 性 白 病 細 胞周期 関す 研 究 血 細胞

金 沢 大 学 十 全 医 学 会 雑 誌 第1 0 6巻 第1 号 1 3 ^‑2 4 (1 9 9 7)

急性白血病細胞 ^の細胞周期^に関す^る研究

金 沢 大 学 医 学 部 医 学科 内科 学 第^三講 座 ( 主 任: 於 田 保)

望 月 康 弘

急 性 白^血 病 細 胞^の細 胞 周 期 を 解 析 する た め に, ビ リ ミ ジン の 同 族 体^である プ^{ロ モ} デ オ キ シ ウ リ ジ^ン (^{br o m ode o x}y^{u r}i din e, Brd U) ^{と その モ ノクロ ー ナル}抗 体 (^{m o n o clo n ala ntibod}y, M oA b) を 用^いて! フ ロ ^ー サイト^メト¹) ^‑ (no w cy to m etry, F C M) 法に より検討 を 行^っ た^. 細 胞 増 殖 動 態^の指 標と し て_, 白 血 病 細 胞^の S 期 比 率 を表^{すBrd U 標 織 率} (^{Brd U‑1abelin}ginde x, Brd U^‑LI), D N A 合 成 時 間 (^{du r atio n ofs}yⁿthetic pha s e, Ts) ^{お よ び}理 論 的倍 加 時 間 b^{ote ntial do ub lin}g tim e, T pot) を 選ん だ^. 対 象は, 本 研 究^の趣 旨に同 意^の得ら れ た急性 白血病患 者2 5例^であ^る. 患 者^の末 梢血 お よ び骨 髄 液^より

直ちに白 血 病 細 胞 を 分 離し, 1 0/^{Jm O}l/1^の Brd U を 含 む培 養 液 内で 3 0分 間お よ び1 8 0分 間培 善し Brd U を 取り 込 ませ, そ れぞれ を^{Brd U‑LI ･1} とBrd U^NLI ^･2 と し た^. そ^の衡 蛍 光^{イソナ オ シ ア}ネ^ー ト標 識^{マ ウス}抗^{Brd U I}gG 抗 体^{と プロビ デ イ ウムア}イオ ダイド に て染 色し, フ ロ ^ー サ イ トメ ^ー タ ^ー を 用^{いて Brd U} 標 識 細 胞と, そ^の D N A 量^の分布を 同 時^に測 定し た^. さ ら に,

B^rd U^‑L l ^･1 と Brd U^‑LI ^･2 を プ^ロ ッ ト し, 回帰 直 線 を 求^め, Ts お よびTpot を 算 出^{し た.} 末 樹^血と 骨 髄 液^の両 者^で同 時^に Brd U^‑L Iを 測 定^できた1 5例につ いて, 各細 胞 周 期^パラメ ^ー タ ^ーを 比 較 す^{る と}, Brd U^‑I.I ^･1, Brd U^‑LI ^･2 お よ び Tpot に統計 学 的に有意 な差 を 認^め, 骨 髄 中^の細 胞^の方^が末梢^血中^の細 胞^に比^べて増 殖 能^が商^{い こと が}明^{ら か に なっ た.} 末梢 血^と骨 髄 液^での 各細 胞 周 期^パラ メ ^ー タ ^ー の相 関 を 検 討し た ところ, Brd U‑^{L I･1 につ いて は両 者に相 関 を 認め た が, Brd U‑LI ･2, Ts お よ び}

T D^otにつ いて は相 関は み ら れ な かった. 末 治療 急 性 非^{リン パ}性 白 血 病 (^{a c tlte n O n‑1}ymp h^{o c}y^ticle uke mia, A N L I) ^{フラン ス ー ア}

メリ カ ^ー イ ギ リ^ス分類M 2 ^の患 者でJapa n A dult Le ukemi aStudy Gr o up O■_{A I.S G) に よ る}成 人急 性 骨 髄 性 白 血 病 治 療 プ^{ロ トコ ー}

ル U^{A 1 5 G A M IJ9 2 プロトコ ー ル}) ^に従^って初 回 寛 解 導^入療 法 を 受 け^{た 9} 例について, 治 療効 果と各^{種細 胞 周期パラメー タ ー}

に^ついて検討し た^. 完 全寛 解 (^{c o m}plete r emi s sio n, C R) を 得た症 例は, Ts お よ び T pot が^マイ ナ^ス値を 示す 例^と, Ts お よ び Tpot が中 央 値より 小 さ な値を示 す 例であ^った. C R 群と非 寛 解 群^の間に は, Ts お よ び Tpot に有 意 な 差 を 認め た^. し か し B^rd U^‑u ^･1, B^rd U^‑I^,I ^･2 に は有 意 な 差 を 認^めなか ^った. 末 治療A N L L でJA L S G A M し9 2 プ^ロト^{コ ー ル}に従^{っ て}寛 解 導^入療法

と地 固め療 法 を 受 けた1 2例 をT_pot の中 央 値で 2 群に分 けて, カ プ ラン ^ー マイヤ ^ー (Kapla n^‑M eie r) 法で無 病 生 存 率 (dis e a s e

f

re e s u rviv al, D F S) ^{お よ び}全^生存 率 (^{o v e r all s u rvival , O A S}) ^の解 析 を 行 う^と, Tb^{ot の}中 央 値^より 短^い群^{で D F S}, O A S ともに 長^い傾 向 を 認め た^. 今 回^の研 究に より, 急 性 白血病に おける細 胞 増 殖 動態^の解 析に は, 骨 髄 液か ら得ら れ た検 体 を 使 用 す^べき と考 え^{ら れ た.} また白^血病細 胞^の増 殖 動 態^{は S} 期細 胞^の割 合^{のみ で は}判 断^できず, Ts およ び Tpot を算 出^{す ること が}必 要^であ ること が明ら か となった^. さ ら にこれ らの パラメ^ー タ ^ー を 用^{いること に よ}り, 疾 患^の予 後を より 正 確^に予 想し得る 可能 性が示 唆さ れ た.

K ey ^{w o r}d s br o m ode o xy^{u r}idin e_,C ell cy^cle_,nO W Cy t^{O m e}try,S pha s e_,p^Ote ntial do ub ling tim e

近年^血液悪 性 疾 患^の治 療 成 績^は新^しい抗 腫 瘍 剤 を 組^み込^{ん だ} 多 剤併 用 化学 療 法^の発 展に より 飛 躍 的^に向上 し, 艮期生存ひ^い て は治癒 も期 待^できる よう^{に な った.} 抗 腫 瘍 剤^の多^くは増 殖 相 にある細 胞に作 用し て効 果を発 揮 す^{る た め1)}, 腫 瘍 細 胞^の増 殖 動 態 を 知る^こと は治 療 計 画 を 立て る 上 で極め て重 要である. オ

ー ト ラ ジ オ グ ラフ イ ^ー の普 及に より, ト リ チ ウ^ムチ ミ ジ^ン (^tritiat_edthymi din e,

:一H T d R) を利 用^{し て}, 白血病 細 胞に おける 細 胞 動 態^の解 析が行わ れ る ようにな^{っ た2).} し か し^{こ の}方 法^で は解 析に長 時 間を要 する 上 に放 射 性 同 位 元 素 を 用^い る た め,

様^々な制 約^があり, 臨床^に応 用 す^{る こ}とは困 牡^であ^{っ た.}

1 3

ブロ モデ オ キ シ ウ^.) ジン(^{br o m ode o x}y^{u r}id in e, Brd U) ^{は ビ} リミヂン の同族 体で, チ ミ ジン の メチ^ル基 を 臭 素^に置換し た物 質^である. Brd U を 含^む溶 液^で細 胞を培 養 す^{る と D N A} 合成^の た め に チ ミ ジ^ンに替わりBrd U が核 内に取^F) 込 まれ る^.1 9 8 1年,

Gr atz n e r ら^{: 刷} に より Brd U に対 する^{モ ノ}クロ ^ー ナル抗 体

(m o n o clo n al a ntibody, M oA b) が開発さ れ た た め, S 期に存 在 する細 胞 を 容 易に同 定^できる ようにな^っ た.

近 年細 胞 周期お よ び増 殖^に関 す^る研 究^が進^み, 新^しく 増殖 細 胞 膜 抗 原 (p^{r o}life r ating ^{c e}ll n u cle a r a nti_ge n, P C N A)^{5 卜 7}や, Ki^‑

6 7 抗 原^{8卜1 2 )}な^どの内 因性 細 胞 増 殖^{マ ー カ ー に}対 す^{る M oA b が}開

平 成8 年11月2 8日受付, 平 成9 年1 月9 日受理

A b br eviatio n s: A C R_, a Cla rub icin;A L L,a C utel _{ym P}ho cy ticle uke mia;A N L L_, a C ute n O n^‑け^m ph o cydcle uk e mia;Ar a^‑C,

Cy t^{O S}in e ar ab in o side; 肌

, ad ul t^′rc ell le uke mia;A T R A_, all^‑tr^,a n S r etin oic a cid_;B H A C_,behe n oyl cy t^{o s}in e ar ab in o $ide; B M _,bo n e m a r r o w;Brd U, br o m ode o xy^uri din e;Brd U^‑u , Brd U^‑1Abel in g in d^{e x};C R, C O m plete r emi s sio n;C V, C O e飽cie nt Of v ariatio n;D F S,d is e a s e血^･e e S u rvival_;D N R,da u n o rubicin;F A B_, Fr e n ch A m eric a n^pB ritish;F B S,鎚tal bo vin e s e ru m;

発 さ^れ, 臨床 応 用が行^{わ れ ている. しか し, これ らの}内 因 性 増 殖^{マ ー} カ ^ー と D N A 合 成と^の間に は, 関 連 性^はあ^るも^{の の}, 基 本 的^{に は}両 者^は興る現 象であり, 前 者は増 殖 能と は無 関 係 な 条 件^{下 で}も 発 現^が左 右 され る可 能 性^があ^{る. 一} 方, Brd U を取 り 込^{ん だ}細 胞は D N A 合 成 を 行^っている細 胞 そ^のものである と考 えて さ し^つかえなく, し た が^ってこれを 観 察 す^{る こ と に よ}り,

より 詳 細 な 解 析が 可能となる と考 えら れ る^.

Brd U と その M oA b を用^いて行 う 細 胞 増 殖 動 態^の解 析 方 法^と し^ては, 免 疫 組 織 学 的 方法^{1 3)と}蛍 光 抗 体 法に よ るフ ロ ^ーサ イ ト メト¹) ^‑ (^{flo w c}yto metry^, F C M) 法^{1 4)と が}ある. 後^{者は 一 度に} 大 量^の細 胞に^ついて迅 速に処 理, 解 析が 可能であ り, 白血病 細 胞^のよう^に血 液 中^に遊 離^{し た}状 態^で充 分 な 細 胞 数^が得ら れ る場 合に は極め て有用 な 方 法と考^{えら れ る. さら に}, 検 体と し て末 梢 血 中^の白血 病 細 胞 を 周^{いる こ}とに より 解 析が可 能であれば,

より 容 易に, 患 者^の負担 も 少なく 検 討^でき^る. そ こ で本 研 究^で は, 末 梢^血中^{お よ び}骨髄 液 中^の白 血 病細 胞^の増殖動 態^の遠^いを 比 較検討 する目 的で, 急 性 白 血 病 患 者^の末梢 血^{お よ び}骨 髄^{か ら} 採 取^{し た}細 胞 を, 生体 外で Brd U を 用^いて標 識し た後, D N A

に 入り 込ん だ Brd U を^これ と特 異 的に結 合 す^る蛍 光 イ^{ソテ オ シ}

Tab lel. Patie ntcha ra cte ri_stic s

アネ ^ー ト標 識 ^マ ウ ^ス 抗 Brd U IgG 抗 体 〔flu o r e s c ei_n is oth io cy an ate(^{F r r C})^{‑C O n}j^ugated a nti^‑Brd U m o u s eI_gG〕を 用^い て染 色し, F C M を 利 用^{し て}細 胞 動 態 を 解 析し た^. また適 当^な Brd U 標 識 時 間 を2 点 選 択 するこ と に より, D N A 合 成 時 間 (du r atio n of synth etic pha s e, Ts) ^{お よ び}理 論 的 倍 加 時 間 b ^{ote ntial do ublin}gti m e_, Tp^ot) を 算 定し た^. さ ら に得ら れ た結 果^と治 療 効 果^との関 連 性^{につ いて}も検 討 を加 え^た.

対 象お よび 方 法

Ⅰ^. 対 象

1 . Brd U に よ る標 識 率^を測 定^{し た}症 例

急 性 白 血 病 患 者2 5例 を 対 象と し て, Brd U ^の標 識率^{を 求め た.} 年 齢^{は1 6}歳^{か ら 7 9}歳^で, 男性^{1 2}例, 女 性1 3例である^. 病 型は急 性リ ン パ性 白 血 病 (a c utely mpho cy ticle uke mi_a

, A LI) ^{フラン ス}

ー アメリ カ ^ー イ ギ リ^ス (^{Fr e n cb‑ Am e ric a n‑British, F A B}) 分 類 L 2 1 例, 成人 丁細 胞 性 白血病 (^{adult′トc ell le uke mia, A T I}) ¹ 例, 急 性 非¹) ^{ン パ}性白血病 (^{a c ute n o n‑1}y^m pho cy ticle uke mia,

A N L I) ^のう ちF A B 分 類M O 2 例, M 1 3 例, M 2 1 0例, M 3 5 例, M 4 1 例, A N L L M 2 再 発 1 例, 多発 性 骨 髄 腫 治療後^の二

P豊^{t se x} (鑑^{, D iagn o sis Mate rial N㍊豊富ic 慧認諾C}

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

‖ 1 2 13 1 4 15 16 1 7 18 19 2 0 2 1 2Z 2 3 2 4 25

F 6 3 AL LL 2^.

M 2 5 A T L

M 18 A N L L M O

F 7 6 A N L L MO

M 60 A N L L M I

M 16 A N LL M I

M 29 AN LL M I

M 5 2 ANL L M 2

M 5 8 A N L L M 2

F 6 1 A^{N L L M 2}

F 3 7 ^{A N L L} M2

F 5^{2 A N L}L M 2

M 4 0 A NL L M 2

F 79 A NLL M 2

F 3 4 A N L L M2

M 63 A N L L M 2

F 5 7 ANL L M 2

F 5 9 A N L L M 3

M 5 8 A N L L M3

F 3 0 A N L L M3

F 68 AN LL M 3

F 5 1 ANL L M 3

M 5 8 A N L L M 4

B M P B B M P B B M P B B M B M P B B M P B B M P B B M B M P B B M B M P B B M B M BM P B B M PB B M P B B M B M B M P B B M

B M B M P B B M F 6 2 ANL L M 2,r elap^{s e} BM P B

M 63 Se c o ndary l^{e u}ke mia B M P B

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 5 8 0 0 0 0 2 7 6 4 0 2 5 4 3 9 1 フ

1 2 0 4 5 3 9 1 2 9 4 2 9 3 29 20 10 54 2 1 鵬 2

4 1 9

3 5 6 40 2

5 0

9 51 1 7 1 1

1

97.0 93.6 8 5.2 9 8^.5 88.0 9 0.0 85.6 8 3.6 7 2.0 2 6.0 5 4.0 34.8 8 7.6 6 0.0 49^.2 84.8 5 2.0 4 8.4 97.6 95.0 8 7.2 89.0 5 2.8

7 (1.0

7 86

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99 4 4 3 6 1 8 0 90 3 2 75 38 3 批 0 95 3 3 5 1 2 0 7 15 8 2 2 0 0 6 3 3 9 3 6 2 2 4 9 4 6 4 3 7 0

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2 5 7 2

L2, MO, Ml, M2, M3a nd M4 a∫eFr e n ch^‑A m eric a n^‑British cla s sific atio n of a c utele uke mia･ A L L,a C utel y^mp h^{o c}y^ticle uke mia; ANL L,a C u t e n O n^‑1 y^mp h^{o c}y ticle uke mia;‑AT L,adultT^‑C e11 1e uke mia; B M,bo n e m a r r ow ; F,fe m ale; L D I l,1a cta t edeh y d^{r o}g^{en as e}

; M ,m ale; P B,P^{e r}i_{p h}e r al b lo od ; ^‑ ,u nko w n^･

F C M , flo w cy t^{o m e}t^ry; F rr C, flu o r e s c ein is oth io cy^{a n a}te; ³H^ノr d R, tritiated th y^midin e;I L lβ^{,inte rle ukin‑1}β^{;JA I･S G,} J^ap^{a n} A dult Le uke m ia Study Gr o up ;I D H, 1a ctat^e deh_ydr og^{e n a s e};M rr, mito x antr O n e; M oA b, m O n O Clo nal a nti bod_y;

6 M P, 6^‑m e r C aP t^OP^urin e;N C R_, n O n C O m plete r e mis sio n; O A S, O V e ral1 s u rvi^val_;P B_{, p}eri_phe r al blo od; P B S,ph o sph ate^‑

b uffe r ed s alin e;P I,p r^Opidi^{u m} iodide;T_pot_,P^Ote ntial do ubling 也m e;Ts, dur atio n of syⁿth eticph^{a s e};■^{V P‑1 6},etOP^{O S}ide