Lactobacillus bifidusレこ関する研究 〔∬〕Rest phase（oval granule）の細胞化学的検索

Lactobacillus bifidusレこ関する研究

〔∬〕Rest phase（oval granule）の細胞化学的検索

金沢大学医学部微生物学講座（主任 西田尚紀教授）

     高  村  保  徳

      （昭和43年8，月22日受付）

 前報1）で著者はLactobaci11us bifidusの生存機 構として，菌が古い培地で長く生存し得るのは，桿状 のvegetative phaseからすみやかに特異な細胞体 制を有するrest phaseを作る為であろうと推定し た．そしてこのrest phaseに相当するものとして，

培養の過程と共に現われ，必ず残存するグラム強陽性 の「ova1『granule」に注目した．この「oval gran・

ule」は生存力の良好な環境では最もよく存続したが，

生存不利な環：境ではいちはやく崩壊した．

 そこで著者は本報で，菌の生存能と密接な関係のあ るこの穎悟構造の細胞化学的研究を試みた．

実 験 方 法

1．使用菌株：前当で用いた諸菌株を使用した．主 として使用した株はL−6株及びL−12株であった．

レ12株は培養の新しい時期ではよく典型的なL．

bifidus形態を呈したが， L−6株は比較的早期より 棍棒状及び球形をとる事が多かった．

皿．使用培地：比較的生存力が強くまた穎粒体存続 の強い培地として，0．5％乾燥ヘモグロビン加brain heart infusion軟寒天培地（以下Hb−BHI軟寒天 培地と省略）を使用した．また菌の発育が良好で典型 的な桿状の菌が得られ易い培地として，1．0％ブドウ 糖・0．3％粉末酵母エキス・0．1％寒天加brain he・

art infusion培地（以下B培地と省略）を使用した．

但し，この培地はよく増殖するが保存には適せず，こ の培地におかれた菌はかなり早く死滅した．尚，両培 地共高層とし，培養の際なるべく培地の中心部を渦巻 型白金耳で穿刺した．

皿．穎粒体の定義：判定を容易にする為，その穎粒 体形成は菌巾より大きく従って菌体を膨隆させるが，

新鮮菌の示すグラム陽性度に劣らぬ染色性を示す構造 のものとした．大きさは種々の形のものが含まれた

が，前報の生存試験の結果より見て，あまり大きな穎 粒は生存能を有するとは思われず，比較的小さなもの の方が生存にあずかる事が予想された．三門の大きさ についてはグラム強陽性の最初の桿菌横径の3倍前後 迄のものを対象としたが，最終的には前述の如くその 穎粒が尚新鮮菌同様のグラム強陽性を三つか否かを判 定の基準とした．

w．染色法：

 1．グラム染色法Hucker氏法2）を行った．

 2．異染小体染色法

 1）Neisser氏法2）並びに2）Wachstein＆Pi・

sano氏法3）を行った．

 3．RNA染色法4）

 同一被検塗沫標本を2個作り純アルコールで20分間

固定後，1つを1N HCIで600C 6〜7分水解処理

し，他の1つを60。Cに保った生理的食塩水に6〜

7分浸し，1．0％pyronin或は1．0％methyl violet 液で染色して明らかに脱色のある場合RNA染色陽

性とした．

 4．塩酸水解後グラム染色法5）

 lNHCI 60。Cで6〜7分水解し，水洗後， Huc・

ker液染色15秒，ルゴール処理10秒，無水アルコー ルにて脱色3〜5秒後直ちに水洗し，Pfeiffer液に て後染色した．

 5．DNA染色法

 Robinow氏変法6）及びD6Lamater氏法7）を行

ったが，後者の方が良好だったので主としてこの成績 について述べる．即ち純アルコールで20分間固定し，

1NHCIで60。C 6〜7分水解後，1．0％forma1・

dehydeで2〜4分処理しで0．3％塩基性fuchsin

液で15〜30秒染色した，

 また塩酸水解の時間をそれぞれ15分，30分，60分と 行った後DNA染色をなし，塩酸に対する抵抗性を  Studies on」Lσo o∂σo〃1〃s∂1ゲゴ4κε．〔皿〕Cytochemical Studies on the Oval Granules

（Rest Phase）． Yasunori Takam皿ra， Department of，Bacteriology（Directo■；Prof． S．

Nishida）， School of Medicine， Kanazawa University．

336 高

検査した．

 6・neotetrazolium塩による生存細胞の同定  近時neotetrazolium chlorideを還元する菌は酵 素活性があり，従って生菌と見なされている8）．次の 如き組成の培地を使用した．

ブドウ糖

Na2HPO4・12H20 KH2 PO4

寒  天

蒸溜水

Neotetrazolium chloride    pH＝6．8

   0．59    0．19    0．0019    1．59

  100m1

0．01〜0．005g

この平板培地に種々の期間培養した菌を塗沫し，ピロ ガロール炭酸法で嫌気性とし37。Cに保存した．そ して12時間及び24時間後に菌を取り出し塗沫標本を作 り顕微鏡下でneotetrazolium塩還元の様子を観察 した．尚後染色としてZiehlのcarbol fuchsin 30 倍稀釈液を使用した，

 7．細胞壁染色法

 純アルコールで20分固定し，5％tannin酸液で室 温30分間処置後，2．0％crystal violet液で10秒染色

した．

 8．抗酸性染色法Zieh1−Neelse蝕海法2）を行っ

た．

 9．胞子染色法M611er図法2）及びWirtz氏法

9）を行った，

 10，光学顕微鏡写真：前報1）と同様の装置を使

用した．

実 験 成 績 1．新鮮菌の細胞化学的検討

 耐久型としての穎粒体について検討する前に新鮮菌 についてまず実験を行った，主としてB培地に37。C 48時間培養後の菌を検索の対象とした．

 1．グラム染色法

 L−12株では図1に見られる如く典型的なBifidus 菌の形態を呈した．即ち菌全体が一様にグラム陽性に 染まり，碁立或は菌側より分岐が生じY字状に発育し ているのが見られた，時には核様体だけが濃染し，菌 体内に穎粒状に認められる事があったが，所謂異染小 体だけが特に濃染する事はなかった（図2）．

 またレ6株では24時間培養後はグラム陽性の桿菌 状を呈したが，48時間後ではいちはやく棍棒状の形態 となるのが観察された（図3）・更に37。Cに保存し ておくと，この菌端切大部は益々大きくなり始めはグ ラム強陽性に由るが，最初の桿菌横径の3倍以上にも

村

ふくれ上るとグラム染色性は弱まり図4に見られる如 くついに細胞壁の一部が崩れ内容が外界に放出された

ような様相を示すものが出現した．結局B培地で

37。Cに保存すると，3〜7日目迄はclub−shape及 び「oval granule」を豊富に作り出すが，その後は そのままの形態を保持できず更に膨隆を続けて20日目 迄にはすべて崩壊してしまうのが認められた．

 2，異染小体染色法

 1）Neisser染色すると図5の如く菌豪猛粒部時

には菌体内に明瞭な陽性内取が見られた．

 2）Wachstein−Pisano染色でも同様の所見が認 められ，新鮮菌穎底部に燐酸イオンの存在する事が確 かめられた（図6）．

 3．RNA染色法

 1．0％methyl violetで染色すると主として菌端部 に陽性前々が見られた．その存在は所謂異染小体の部 位と一致しているようであった（図7）．塩酸水解に

よりRNA除去したものは全く染まらなかった（図

8）．

 4．塩酸水解後グラム染色

 菌体はグラム陰性に染まり菌体内の核様体だけが穎 粒状に染まるのが認められた（図9）． しかし脱色が 過ぎると陰性化した．

 5．DNA染色法

 D6Lamater法では図10に見られる如く核物質は明 瞭に菌体内に1〜3個染め出された．その存在部位は 菌端やや内側もしくは菌体中央部であった．この核物

質はNeisser染色及びWachstein−Pisano染色陽

性穎粒とは明かに異なる位置に存在した．これらの異 染小体染色陽性頼粒は塩酸水解後行うと全く陰性化す るのに対し，核染色陽性穎粒は塩酸水解後に明瞭に染 め出される事からも両者は明らかに区別された．

 6．neotetrazolium塩による生存細胞の同定  12時間培養の菌ですでに色素還元陽性の穎粒が見ら れたが，24時間後では更に明瞭に図11の如く主として 菌端部に認められた．その部位は異染小体染色陽性穎 粒と一致するものもありまた一致しないものも認めら れた．いち早くclub−shapeをとるものでは，図12 の如くその白虹膨大部に限局して著明な色素還元陽性 穎粒が見られた．この穎粒は異染小体染色陽性穎粒よ り大きく両者の位置は重なり合うが，後者は前者の中 に含まれて存在するように思われた．

 7．細胞壁染色法

 1一体に1〜3本の隔壁を認あ，その位置は一定し なかったが桿状菌では大体中央に1本であった （図 13）．またすでにclub−shapeを呈する菌ではその膨

隆部のくびれた部位に明らかに隔壁が認められた（図

14）．

 8．抗酸性染色法

 異染小体染色陽性穎粒の部位に一致して陽性穎粒が 見られた（図15）．

 9．胞子染色法

 Wirtz法では多数の菌が陽性に染色されたが，異 染小体染色陽性穎粒部のみが特に濃染する事はなかっ た． しかしすでにclub−shapeを呈する菌ではその 門端膨隆部は著明に染色された（図16）．

丑．二二体の細胞化学的検討

 前回の生存試験の結果，H：b−BHI軟寒天培地は比 較的生存力が強く且つ穎粒体形成も良好だったので，

この培地に37。C 20日間培養の陳旧菌について検討 を加えた．

 1．グラム染色法

 図17に見られる如くvegetative phaseの菌体の穎 三部より大で最初の桿菌横径の3倍前後迄の大きさの 大小様 々のグラム強陽性に染まる「oval granule」即 ち穎粒体が認められた．

 2．異染小体染色法

 Neisser法並びにWachstein−Pisano旧いつれに おいても陽性下平は見られなかった．特に後者におい て燐酸イオンの蓄積を認める事はできなかった （図

18）．

 3．RNA染色法

 methyl violet染色では頼粒体は図19に示した如 く二曲に染め出され，殆んどグラム染色の様相と門致 していた．

 4．塩酸水解後グラム染色法

 塩酸水解をしないものにやや劣るが依然としてグラ ム陽性に染め出され，核染色と大体同様の所見を示し た（図20）．

 5．DNA染色法

 図21に示した如くD6Lamater法では二二体は菌

端膨隆部に明瞭に染色された．更に塩酸水解の時間を 15分，30分，60こ口延長しても穎粒体染色は陰性化せ ず，この事より二三培地に残存する上記体は1規定塩 酸に強い抵抗性を有する事が判明した（図22）．

 6．neotetrazolium塩による生存細胞の同定  図23に見られる如く二二体は著明に色素二元性を示

した．その時陳旧培地に同時に見られるvegetative phaseに似た桿状菌（グラム染色陰性）は決して還 元性を示さなかった．

 7． 糸田月胃壁染色

 37。C 48時間培養卜すでにclub−shapeをとる菌で

表1 L．bifidus新鮮菌の頼粒部と耐久型頬粒   （穎粒体）の細胞化学的諸性質の比較

培養法

糸田月包イヒ学白勺

性質

グラム染色

燐酸染色 RNA染 色

DNA染色 酵素活性

塩酸水解に対 する抵抗性

新鮮菌穎粒部 B培地i）37。C 48時聞培養の 菌

十十十

？

耐久型穎粒 左記の菌を

HbLBHI軟

寒天培地ii）

に37。C20日 間培養の菌

十

十十十十

i）1．0％ブドウ糖・0．3％粉末酵母エキス・

 0．1％寒天加brain heart infusion培地 ii）0．5％ 乾燥ヘモグロビン加brain heart

 infusion培地

は前述の如く上端膨隆部と二二との間に明瞭な隔壁が 認められたが，培地が二丁化すると共にしだいに膨隆 部は二二から遊離して典型的な「oval granule」を 作ると思われた，即ち37。C 20日間培養の菌を壁染色 すると二巴体は完全に細胞壁により隔離されているの が認められた．尚反対側の菌端（この時；期では多くは グラム染色陰性）は普通萎縮して尾部のように認めら れた（図24）．

 8．抗酸性染色

 Zieh1−Neelsen法では全く陰性であった （図省

略），

 9．胞子染色法

 Wirtz及びConklin法によって370C 2〜7日

培養迄の菌では極めて多数の陽性穎粒が認められた が，その類しだいに染まらなくなり20目目では大部分 陰性化した． またM611er法では始めより全く陰性 であった（図省略），

 以上著者はL．bifidusの陳旧培地に見られる耐久 型穎粒即ち頬粒体（oval granule）が，新鮮菌穎粒 部即ち異染小体と細胞化学的に性質を異にするもので ある事を証明したが，各所見を要約すると表1の如く

になる．．

        考     察

：L．bifidusの崩壊過程として次の2つが考えられ る．その一つは桿状菌の両端が次第に細まりグラム染

338 高

色で陰性化した菌体の中に核様体だけが塩基性色素に 濃染して穎粒状に残り，ついには所謂microcysteと なり増殖能力を失う過程である．また他のrつは桿状 菌の一端が棍棒状に膨隆し次第に球状体を形成する が，膨隆は間断なく進み大きさを益すにつれグラム染 色性は悪くなり，ついに細胞壁の一部より崩壊する過 程である．以上はいつれもdegenerationへの過程と 見なされるが，著者は後者の過程において本四が長く 生存能を有する時，次の如き体制をとるのでないかと 考える．即ち桿状菌の一端が膨隆するも膨化崩壊の過 程をとらず，最初の桿菌横径の3倍前後の大きさの club−shape或はその先端より遊離した「oval gran・

ule」を形成してとどまり，そこに強力な耐久型二二 を作るのでないかと考えるのである．従ってかくの如 きclub−shape或は「oval granule」を膨隆から止 めて，一定の形に保持できる環境に置けば，長く生存 能を持ち続けるであろう事は当然予想される．故にこ の耐久型一粒（穎粒体）が，著者の成績の如く新鮮菌 浮心部と異なる特異な細胞化学的所見を有していても 不思議ではない．

 所でこの耐久型頼粒はDNAとRNAが密接に結

合しているようである．一般に細菌のグラム陽性物質 はRNAが関係しているといわれるが1。）11），著者の 実験で塩酸水解後行ったグラム染色所見が核染色の所 見と大体一致していた事は，水解処理によっても尚充 分除かれ難いRNAを染め出したものと考えられる．

本菌とよく似た形態変化をするCorynebacterium diphtheriaeの耐久型穎粒について検討した寺本4）は

ζの穎粒はDNAとRNAを含むと報告している

し，中田5）はDNA， RNAの他に蛋白質等が晶晶

・して形成されたcondensed plasmaであると報告し ているが，本菌の耐久型穎粒もそれに類似したものと 思われる． これはむしろCoryneba￠teriumや，

Mycobacterium， Lactobacillusが面するStrep・

 ロ

tomycesのconidiosporeや， Arthrobacterium

・のarthrosporeに似ているといえる． 元来一部の菌 では環境条件が悪くなると，生存能を保持する為の休 止状態を更に一歩進めて，核酸，炭水化物，脂質，脂 肪よりなるより強力な胞子を形成して外界の変化に対 抗する12）。 これら細菌胞子が殆んど完全にbioche・

mical dormancyを保つのに対し， L， bifidusの耐 久型西面はconidiosporeや， arthrosporeの如く．

必ずしもdormancyを保っていない．この事が細菌 胞子ほど生残力が強くない理由と考えられる．

 以上L．bifidusの耐久型門下についてその形成過

村

程及び細胞化学的見地より検討を加えたが，本菌が培 養の過程で形成する「oval granule」は胞子の前段階 たるrest phaseとしての機能を有するものと考えら

れた．

結

論

 1．L． bifidusが培養の過程で形成する穎粒体

（グラム強陽性のclub−shape或は「oval granule」）

は1規定塩酸水解60。C 60分間行うもの依然として

DNA染色（D6Lalnater染色）陽性に染まった．ま たここにはRNAは共存するが燐酸は証明されなか

った．

 2．陳旧培地（37。C 20日培養）において菌が生存 能を有する塀合認められる穎粒体は，neotetrazolium 塩に対する環元能を保持していた．その際同時に認め

られる桿状の菌は二元能を有しなかった．

 3．新鮮菌穎粒部（所謂異染小体）はDNA染色

陰性であったが，RNA染色及び燐酸染色は陽性であ

った．

 4．かくしてL．bifidusにおいて培養の過程と

共に出現する穎粒体はrest phaseとしての機能を有

し，新鮮菌穎粒部とは細胞化学的に異なる事が判明し

た．

稿を終るにあたり，御指導と御校閲下さいました西田尚紀教授 に衷心より感謝申し上げます．

文 献

1）高村保徳：十全医会誌，印刷中．     2）

東大伝研学友会編：細菌学実習提要，第4版，11 9頁，東京，丸善k．k．（1959）．       3）

Wachstein，剛：．＆Pisano， M．＝J． Bact．，59，

357（1950）．    4）寺本友一；十全医会誌，

69，61（1963）．   5）中田嘉則：米子医誌，

7，93（1956）．     6）Smith， A． G．： J．

Bact．，59，575（1950）．     7）D飢lamater，

E．P．： Staintechnology，26，199（1951）、

8）：Davis，」． C．＆ Mudd， S．＝ J． Bact．，69，

372（1955）．   9）Wirtz， K：．3Zb1． Bkt．，

Abt．1，0rig．，46，727（1908）．       10）

黒屋政彦＝医学のあゆみ，4，178（1947）．

11）Henry， H．＆Stacey， M．：Nature，151，

671（1943）．    12）三橋 進：病原微生物 学（細菌編一福見秀雄編），第1版，32頁，東京，

医学書院（1959）．

       Abstract

 Oval granules formed in the old cultures of Lαo o∂αo〃1彿s∂加．伽εwere analyzed cytocbemically． Results obtained were as follows：

 1．The oval granules subjected to a hydrolysis in 1 N HCI at 600C for 60 min．

still stained positive for DNA by the method of D6Lamater． RNA was detected in．

the same site but no phosphate was demonstrated．         ．

 2． The oval granules which appeared in cultures incubated for 20 days at 37。C could reduce lleoterazolium salt， whilst rod forms in the same cultures never red・

uced the salt．

 3． Small granules appearing ill vegetative cells stained positive for RNA and phosphate but not for DNA．

 The above−mentioned filldings indicate that the oval grallules are the composite organelles responsible for survival and cytochemically different from the small

彗ranUleS in VegetatiVe CellS．

写 真 説 明

拡大率：以下いつれも2500倍

B培地：1．0％ブドウ糖・0．3％粉末酵母エキス

・0．1％寒天加brain heart infusion培地．

 Hb−BHI軟寒天培地：0．5％乾燥ヘモグロビン 加brain heart infusion培地．

 図1：

時間培養．

 図2：

時間培養．

 図3：

時間培養．

 図4：

日培養．

 図5：

グラム染色，L−12株， B培地，37。C，48

グラム染色，L−12株， B培地，37。C，48

グラム染色，L−6株， B培地，37。C，48

グラム染色，L−6株， B培地，37。C，7

Neisser染色， L−12株， B培地，37。C，

48時間培養．

 図6：Wachstein−Pisano染色L−12株， B

培地．37。C，48時間培養．

 図7：RNA染色（methyl violet染色）L−12

株，B培地，37。C，48時間培養．

 図8：塩酸水解6分後RNA染色， L−12株，

B培地．37。C，48時間培養．

 図9：塩酸水解6分後グラム染色，L−12株， B 培地．37。C，48時間培養．

 図10：DNA染色（D6Lamater染色）， L−12

株，B培地，37。C，48時間培養．

 図11：neotetrazolium塩による生菌同定（培地 本文参照，37。C，24時間保存），1，一12株， B培地，

370C，48時間培養．       『  一  図12：neotetrazolium塩による生菌同定（培地 本文参照，37。C，24時間保存）， L−6株， B培地，

37。C，48時聞培養．

 図13：細胞壁染色，L−12株， B培地，370C，48 時間培養，  一 

 図14：細胞壁染色，L−6株， B培地，37。C，48 時間培養．     ．

 図15：Zieh1−Neelsen染色L−12株， B培地，

37。C，48時間培養．

 図16：Wirtz染色， L−6株， B培地，37。C，48 時間培養．      一   図17：グラム染色，L−6株， Hb−BHI軟寒天培 地，37。C，20日培養．

 図18：Wachstein−Pisano染色， L−6株， Hb−

BHI軟寒天培地，37。C，20日培養．    一  図19：RNA染色（methyl violet染色）， L−6 株，Hb−BHI軟寒天培地，一37。c，20培養．

 図20：塩酸水解6分後グラム染色，L−6株， Hb−

BHI軟寒天培地，37。C，20日培養．

 図21：DNA染色（D6Lamater染色）， L−6株．

Hb−BHI軟寒天培地，370C，20日培養．

 図22：塩酸水解60分後DNA染色， L−6株，

Hb−BHI軟寒天培地，37。C，20日培養．

 図23：neotetrazolium塩による生菌同定（培地 本文参照，37。C，24時間保存）， L−6株， Hb−BHI軟 寒天培地，37。C，20日培養．      ．

 図24：細胞壁染色，L−6株， Hb−BHI軟寒天培 地，37。C，20日培養．

340 高 村

、図1

図2

亀

宮

じ箏

       ドア    ド    ト

ノーゴ∵羨二穴眠

      ド㌧ドの

    デ摩戸族

     帆     8     、／島     窺    畷         ＿ 曽

         ぜ    弛  ノ 中  宜  ^撫 突   ノ覧  帆     

㌔ ノ   飯  嘱   雪 、      ノ

轟寸

図3 図4 図5

轟

 勧私雑

輩麟 燕譲

国農．﹃壕

細鍵創ゆ暢 縛

   甜    酵    跡

  面為硝

螺

響 _撚

紬葦

        錨

灘 饗

暴騰

灘描

^騰繍・

騰 ^貴饗・

︑軍獺郷欄講鰐

欄磯罵

図6 図7

図8

鞍懸

謬賜

難灘

図9

図12

ヒ議議

幾趨

鎌蟻 繍

     図15

        図10

灘

離羅講

働醤剛、脇も

図13

図16

  ・讐

麟鑛

 鎌槍、

図11

図14

村 高342

図18

図21 図20

図19

三三盤黙ド賠膨紅州

図23 図22

．騨一．蹴．雛臨餅馨轄．無．︐