博 士 （ 医 学 ） 窪 田 満
学位論文題名
Oral Immunization with Simian Immunodeficiency Virus p55gag and Cholera Toxin Elicits Both Mucosal IgA and SystemiCIgGImnluneReSponSeSinN ・ onhumanPrimateS ・ （サル免疫不全ウイルスp5 瓲磐蛋白とコレラ毒素による経口免疫 は サ ル に 粘 膜 型 IgA と 全 身 型IgG の 免 疫反 応を 誘 導す る）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
現在、全世界で600〜800万人がヒト免疫不全ウィルス(HIV)に罹患しており治療薬 の開発が進んでいるが、多くの後天性免疫不全(AIDS)患者が未感染者への感染源に なっているのもまた事実である。さらにHIVの感染は主に同性・異性間の性交渉で経 粘膜的に生じることを考えても、これ以上感染を広げなぃためにHIVに対する経粘膜 ワクチンの開発が急務であるといえる。AIDSの研究・ワクチン開発のために、アカゲ ザル／サル 免疫不全ウ ィルス(SIV)感染系がAIDS動物モデルとして広く用いられて いる。これまでに、SIV不活化ワクチンをアカゲザルに筋肉内投与・経口投与そして 経気管内投与をすることでSIV感染を予防できたという報告や、SIV関連蛋白である gp120とp27をアカゲザルの鼠径リンパ節に直接投与するterget lymph node (TLN)免疫法 で粘膜に有効な抗原特異的S‑IgAを誘導でき、かつ感染を予防できたという報告がある。
し か し 、 細 胞 生 物 学 的 ・ 分 子 生物 学 的検 討 が十 分 で はな ぃ のが 現 状で あ る。
さて、ワクチン抗原を単独で経口免疫しても、高レベルの抗原特異的免疫グロブリン を誘導することは期待できなぃ。そこで、抗原と共に投与すると宿主の免疫応答を 非特異的に高める物質（アジュバント）が必要になってくる。コレラ毒素(CT)は、
コレラ菌によって産生される毒素であり、ヒトの腸管に作用すると重症の下痢を引き 起こす反面、有効な粘膜アジュバントとして現在最も期待されている。我々は以前に 破傷風類毒素(rr)をCTと共にマウスに経口投与し、TT特異的血清IgGと分泌型IgAが 誘導され、さらにTT特異的なIL‑4、IL‑5、IL‑6を産生するTh2型CD4+T細胞応答が誘導 されることを証明した。現在、遺伝子工学により作製された無毒性の変異型CTを用いて ヒトへの応用を検討しているところである。
今回、我々はSIV関連抗原としてp55gag (p55)を、粘膜アジュバン卜としてCTを選択 し、この混合ワクチンをアカゲザルに経口投与した。そして、抗原特異的な粘膜及び 全身免疫系の反応、即ち抗原特異的IgG及びIgA反応、さらに抗体反応を誘導するのに 重要なへルパ一T細胞反応について詳細に検討した。
実験には5匹のアカゲザルのメスが用いられ、3群に分けて1ケ月毎に3回経口ワクチン が投与され た。No.25754とNo.26040の2匹は250vgのp55と50vgのCTが経口投与され
（少量p55．CT併用群）、No.26208とNo.26898の2匹は1mgのp55と50vgのCTが経口投与 された （大 量p55．CT併用群）。残りのアカゲザル(No.25785)にはImgのp55のみが 経口投与され、CTは投与されなかった(p55単独投与群）。
血清中のp55特異的IgGに関しては、p55単独投与群に比べてCT併用群ではp55の投与 量に関係なく高値を示した。一方、血清中のp55特異的IgAは、大量p55．CT併用群に おいて初回免疫の7日後から高値でかっその後持続したが、少量p55．CT併用群及びp55 単独投与群では低値を示した（Pく0.05)。当然のことながら、血清中のCT特異的免疫 グロブリンはCT併用群において高値を示した。興味深いことに、アカゲザルでは50vgの CTは下痢などの消化器症状を引き起こざなかった。さらにp55投与量に関わらず、CT 併用群において直腸洗浄液、膣洗浄液及び唾液などの外分泌液中にも高レベルのp55特異 的免疫グロブリンが認められた。特に直腸洗浄液と唾液中にp55特異的IgAが誘導され、
膣洗浄液中にはp55特異的IgAの代わりにp55特異的IgGが認められた。HIV感染患者の腔 洗浄液中にはHIV特異的IgGがIgAよりも優位に存在しているという報告や、アカゲザル に有効なワクチン投与が行われた際に、膣洗浄液中に抗原特異的IgGが産生されたと いう報告があり、ヒトやアカゲザルの子宮頸管における粘膜免疫の主体はIgGである 可能性がある。また、p55単独投与群では、いずれの外分泌液中にもp55特異的免疫 グロブリンは誘導されなかった。っまりこの結果は、粘膜アジュバントとしてCTを用い 的確な抗原量で経口免疫をすることで、粘膜系と全身系両方の免疫機構に抗原特異的な 免疫反応を誘導できることを強く示唆している。
次にp55・CT併用群の血液から分離した末梢血単核球(PBMC)をp55によって4日間 刺激培養し、p55特異的なT細胞に関して検討した。[3H]サイミジンを用いたT細胞増殖 試験で、p55刺激群のPBMCは、無刺激群に比して約10倍の[3H]サイミジンの取り込みを みた。これは、大量p55．CT併用群において、少量p55．CT併用群及びp55単独投与群 よりも顕著であった（Pく0.01)。
最後に、このT細胞から産生されるp55特異的なThl及びTh2型サイトカインに関して 検討し た。CT併 用群 のPBMCをp55で 刺激 した とこ ろ、培 養上 清中 にIFN‑Y (Thl型 サイト カイ ン） とIL‑10（レ ベル2Th2型 サイ トカ イン） を産 生し てい たが、IL‑4
（レベル1Th2型サイトカイン）の産生は認められなかった。さらに細胞レベルで検討す るために、CT併用群のPBMCをp55で刺激した後、FACSにてCD4+T細胞に分離し、それ らの細胞からのThl及びTh2型サイトカイン産生パターンを解析した。サイトカイン特異 的ELISPOTに て、IFN‑Y産生CD4+T細 胞が 多数 認められたが、IL‑4産生CD4+T細胞は 少なかった。また、同じCD4+T細胞からRNAを抽出し、サイ卜カイン特異的RT‑PCRを 用いてmRNAレベルで解析した。p55特異的CD4+T細胞から産生されるサイトカインの mRNAは、IFN‑YとIL‑6 ‑ IL‑10（レベル2Th2型サイトカイン）であり、やはりIL‑4は 認められなかった。尚、少量p55．CT併用群では初回免疫後7日でIFN‑Yが誘導され、
28日後にTh2型サイトカインの産生が増強していたが、一方、大量p55．CT併用群では 早期からTh2型サイトカインが産生される傾向があった。これは血清中のp55特異的IgA の出現と相関しており、大量p55・CT併用群における抗原量がワクチン投与後早期から 有 効 な 細 胞 性 免 疫 と 体 液 性 免 疫 を 誘 導 す る 至 適 量 と 考 え ら れ た 。 CTを併用したSIV抗原経口免疫で、分泌型IgAの誘導に不可欠なTh2細胞だけでなく、
ウィルス排除に欠かせない細胞性免疫を主導するThl型細胞が誘導されるという事実 は、AIDSに対する経口ワクチンの開発を考える際に非常に重要なポイントである。
IFN‑YがIL‑4を抑制することは良く知られており、このことはアカゲザルにCTをアジュ
バントとしてSIV抗原を経口免疫した際に、細胞性免疫を誘導するThl型サイトカインが まず産生され、そのThl優位の環境下で有効に粘膜にIgAを誘導するために、選択的な レベル2Th2型サイトカインの産生が行われていることを示唆している。AIDSの予防に は粘膜局所における免疫反応と全身の免疫反応の誘導が、そして細胞性免疫と体液性 免疫の両方の賦活が重要であり、まさしく二段構えのAIDSに対する防御バリアーが、
CTを 粘 膜 ア ジ ュ バ ン ト と し た 経 口 ワ ク チ ン に 期 待 さ れ て い る 。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
Oral ImmunizadonWithSimianImmunO（ le丘 CienCyViruS p5弧andCh01eraTO五nElicitSBOthMuCOS甜IgAand
SyStemiCIgGImmuneReSponSeSinNOnhumanPrimateS・ （ サ ル 免 疫 不 全 ウイ ル スp5鷺鱈 蛋 白と コ レラ 毒 素 によ る 経口 免 疫 は サ ル に 粘 膜 型 IgAと 全 身 型 IgGの 免 疫 反 応 を 誘 導 す る ）
現在、全世界で600〜800万人のヒト免疫不全ウィルス(HIV)感染症があり、治療薬の 開発も進んでいるが、未だ多くの後天性免疫不全(AJDS)患者が未感染者への感染源に なっている。HIVの感染は主に同性・異性間の性交渉で経粘膜的に生じることを考える と、感染の防止にはHIVに対する粘膜防御反応を惹起するワクチンの開発が急務であ る。AIDSの研究やワクチン開発のために、アカゲザルノサル免疫不全ウィルス(SIV)感 染系がAIDS動物モデルとして広く用いられている。これまで、SIV不活化ワクチンをア カゲザルに筋肉内投与や経口投与、または経気管内投与などでSIV感染を予防できたと いう報告や、SIV関連蛋白であるgp120とp27をアカゲザルの鼠径リンバ節に直接投与す るterget lymph node (TLN)免疫法で粘膜に有効な抗原特異的S−IgAを誘導でき、かつ 感染を予防できたという報告があるが、細胞生物学的・分子生物学的検討が十分ではな い。申請者は経□ワクチンの開発の基礎的検討のため、アカゲザルにサル免疫不全症ウ イルスp55gag蛋白とアジュバントとしてコレラ毒素(CT)を経口免疫し、抗原特異的な粘 膜及び全身免疫系の反応、さらに抗体反応に関わるへルバーT細胞反応について詳細に 検討した。
5匹のアカゲザルのメスを用い、3群に分けて1ケ月毎に3回経口ワクチンを投与した。
No.25754とNo.26040の2匹は250vgのp55と50vgのCTの経口投与 （少量p55・CT併用 群） 、No.26208とNo.26898の2匹はImgのp55と50vgのCTが経口投与（大量p55．CT併 用 群 ） 、 残 り のNo.25785はImgのp55の み を 経 口 投 与(p55単 独 投 群 ） し た 。 血清のp55特異的IgGは、p55単独投与群に比べてCT併用群ではp55の投与量に関係な く高値を示した。一方、血清のp55特異的IgAは、大量p55 ‑ CT併用群で初回免疫7日後 から高値でかつ持続したが、少量p55・CT併用群及びp55単独投与群では低値を示した
（Pく0.05)。なお、50vgのCTは下痢などの消化器症状を引き起こさなかった。p55投与量 に関わらず、CT併用群において直腸洗浄液、膣洗浄液及び唾液などの外分泌液中にも高 レベルのp55特異的免疫グロブリンが認められた。特に直腸洗浄液と唾液中にp05特異的
彦 敬夫 邦 隆 林木 池 小吉 小 授授 授 教教 教 査査 査 主副 副
IgAが誘 導さ れ、膣 洗浄 液中 にはp55特異 的IgAの代 わり にpDD特異 的IgGが認められた。
HIV感 染 患 者 の 腔洗 浄液 中に はHIV特異 的lgGがIgAよ りも 優位 に存 在し てい ると いう 報 告や 、ア カゲ ザル に有 効な ワク チン 投与 が行わ れた 際に 、膣 洗浄 液中 に抗原特異的IgG を 認 め る と い う報 告が あり 、ヒ卜 やア カゲ ザル の子 宮頸 管に おけ る粘 膜免 疫の 主体 は IgGであ る可 能性が ある 。ま た、p55単独 投与群 では 、い ずれ の外 分泌 液中にもp55特異 的免 疫グ 口ブ リン は誘 導さ れな かっ た。 以上から、粘膜アジュバントとしてCTを用い、
的確 な抗 原量 で経 口免 疫を する こと で粘 膜系と全身系両方の免疫機構に抗原特異的な免 疫 反 応 を 誘 導 で き る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た 。 次 に 、p55/CT併 用 群 の 末 梢 血 単 核 (PBMC)をp55で4日 間刺 激培 養した とこ ろ、 無刺 激群 に比 して 約10倍の[3H]サイ ミジ ン の 取 り 込 み を み た 。 これ は 、 大 量p55・CT併 用 群 にお い て 、 少 量p55．CT併用 群及 び p55単独 投与 群よりも顕著であった（Pく0.01)。さらに、このT細胞から産生されるThl及 びTh2型 サ イ ト カ イ ン に 関 し て 検 討 し た と こ ろ 、CT併 用 群 のPBMCはp55刺 激に より 培 養上清中にIFN−Y(Thl型サイトカイン）とIL―10（レベル2Th2型サイトカイン）を産生した が 、IL−4（ レ ベ ルlTh2型 サ イ ト カ イ ン ） の産 生は 認め なか った 。次 に、CT併 用群 の PBMCをp55刺 激 後 、FACSに てCD4+T細 胞 に 分 離 し 、 そ れ ら の 細 胞 か ら のThl及 び Th2型 サ イ ト カ イ ン 産 生 バ タ ー ン を 解 析 し た 。 サ イ ト カ イ ン 特 異 的ELISPOTに て 、 IFN−Y産 生CD4r脚 胞が 多数 認めら れた が、ILー4産 生CD4+T細 胞は 少な かっ た。 また 、 同 じCD4‑vF細 胞 か らRNAを 抽 出 し 、 サ イ ト カ イ ン 特 異 的RTーPCRを 用 い てmRT¥Aレ ベ ル で 解 析 し た 。p55特 異 的CD4+T細 胞 か ら 産 生 さ れ る サ イ ト カ イ ン のmRNAは、IFN−Y とILー6、IL‑10(レベル2Th2型サイトカイン）であり、IL‑4は認められなかった。尚、少 量p55．CT併 用 群 で は 初 回 免 疫 後7日 でIFN‑Yが 誘 導さ れ 、28日 後 にTh2型 サイ トカ イ ン の 産 生 が 増 強し てい たが 、大量p55・CT併用 群で は早 期からTh2型サ イト カイ ンが 産 生 さ れ る 傾 向 が あ っ た。 こ れ は 血 清 中 のp55特 異 的IgAの 出 現 と 相 関 し て おり 、大 量 p55・CT併用 群にお ける 抗原 量が ワク チン 投与 後早 期か ら有 効な 細胞 性免疫と体液性免 疫を誘導する至適量と考えられた。
CTを 併 用 し たSIV抗 原 の 経 口 免 疫 で 、 分 泌型IgAの誘 導に不 可欠 なTh2細 胞だ けで な く、 ウィ ルス 排除 に欠 かせ ない 細胞 性免 疫を主 導す るThl型 細胞 が誘 導されるという事 実 は 、AIDSに 対す る経 口ワ クチン の開 発を 考え る際 に非 常に 重要 なポ イン トで ある 。 IFN−YがILー4を抑 制す るこ とは 良く 知ら れて いる 。こ のこ とか らア カゲザルにCTをア ジ ュ パ ン ト と してSIV抗 原を 経口 免疫 した 際は 、細 胞性 免疫を 誘導 するThl型サ イト カ イン がま ず産 生さ れ、 そのThl優 位の 環境 下で有効に粘膜にIgAを誘導するために、選択 的 な レ ベ ル2Th2型 サイ トカ インの 産生 が行 われ るこ とが 示唆 され る。AIDSの予 防に は 粘 膜 局 所 に お け る 免 疫反 応 と 全 身 の 免 疫 反 応 の 誘 導 が 、 さ ら に 細 胞 性 免 疫と 体液 性 免疫 の両 方の 賦活 が重 要で あり 、ま さし く二段構えのAIDSに対する防御バリアー発現作 用 が 、CTを 粘 膜 ア ジ ュ バ ン ト と し た 経 口 ワ ク チ ン に 存 在 す る と 考 え ら れ る 。 公 開 発 表 に 際し 、副 査の 吉木教 授か ら、 他の ワク チン 法で のデ 一夕 との 違い につ い て、 直腸 と膣 に於 ける 免疫 反応 の差 の理 由、使用した抗原の選択理由、感染防御の効果 の有 無な どに つい て、 副査 の小 池教 授か ら、免 疫経 路の 違い にお ける 血清型IgG抗体産 生の 差、 粘膜 の抗 体量 と感 染防 御の 関係 、レベル2Th2細胞の粘膜特異性、ヌモリーの有 無、 経□ 卜レ ラン スと の関 係、 安全 なア ジュパント開発などについて、主査の小林教授 から 粘膜 免疫 の持 続期 間、 膣粘 膜の 免疫 反応とホルモンの関係などについて質問があっ た が 、 申 請 者 は 何 れ に 対 し て も 豊 富 な 知 識 と 実 験 結 果 か ら 妥 当 な 回答 を 行 っ た 。 審 査員 一同 は、 これ らの 成果 を高 く評 価し、博士（医学）の学位を受けるのに十分な 資格を有すると判定した。
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