博士（薬学）鈴木 厚 学位論文題名
The role of bone morphogenetic proteins 1n early Xenopus embryo
（ 骨形成夕 ンパク質 のアフリ カツメガ エル初期 胚での役割）
学位論文内容の要旨
1．序論
脊椎動物の初期発生では，―つの受精卵から細胞分裂を繰り返して生じた細胞群が 個々に分化し，それぞれ異なった形質を獲得してぃく．このような初期胚の細胞の分 化は胚の部域化を生じ、将来の前後軸や背腹軸の形成へと引き継がれると考えられて いる ．轟近，成体から単離された種々の細胞増殖因子が遺伝子(mRNA)またはタン パク質として初期胚に存在することが明らかにされた．細胞増殖因子は，細胞膜上の 特異的な受容体を介してそのシグナルを細胞内に伝達することにより細胞の増殖や分 化を調節するタンパク質である．したがって．初期胚中に内在する細胞増殖因子も成 体同様，その受容体を介して細胞増殖や分化を調節し，体の形づくり（形態形成）を 行なってぃる可能性がある．現在までに，アフリカツメガエル胚を用いた実験から Tく;F‑pス―パ―ファミリーに属する細胞増殖因子が脊椎動物の初期発生課程で重要な 役 割 を 担 っ て ぃ る こ と が 示 さ れて い る． こ の うち 骨 形成 タ ン パク 質 （Bone MorphogeneUc Protein，BMP）はツメガェル胚の将来背側の組織になる割球にその mRNAを微量注入すると背側組織（神経．筋肉）を欠失して腹側組織（血球）を過剰 に形成した胚（腹側化胚）を生じる．このことから．BMPは腹側組織の形成に役立っ ており，背側組織形成因子とBMPの相互作用によって初期胚の部域化すなわち背腹軸 の形成が行われると考えられてぃる．
本研究ではBMPの初期胚での役割を明らかにするために．BMPに特異的な受容体（
BMP受容体）を単離した．また，遺伝子工学的手法によって作製した改変型BMP受容 体をツメガェル初期胚中で過剰発現させて胚内のBMPシグナルを遮断することを試み，
胚に内在するBMPの機能を明らかにした．
2．BMP受容体cDNAのクロ―ニング
TGF‑pス―パ―ファミリ―に属する細胞増殖因子は．セリン／スレオニンキナ―ゼ 型受容体に結合して細胞内にシグナルを伝達することが知られてぃる．そこで，これ らの受容体間で良く保存されているセリン／スレオニンキナ―ゼドメインを利用した
reve rse transcription―polymerase chain reaction (RrPCR）法によって，BMP受容体 を 高 発 現 し て ぃ る マ ウ ス の骨 芽細 胞か らBMP受容 体cDNAの クロ ーニ ング を 試み た・
FmPCR法 に よ っ て 得 ら れ た 遺伝 子断 片か ら新 奇な セリ ン／ スレ オニ ンキ ナ ―ゼ をコ
― ド す る 遺 伝 子 （mTFR11） を 選 別 し ． こ れ を プ ロ ― ブと して 完全 長cDNAを単 離し た と こ ろmTFR11は シ ス テ イン 残基 に富 んだ 細 胞外 ドメ イン と1つの 膜貫 通 ドメ イン そして細胞 内のセリン／スレオニンキナ―ゼドメインからなる受容体タンバ．ク質をコ
― ド し て ぃ る こ と が 分 か った ．mTFR11受容 体 がBMP受 容体 であ るか どう か を明 らか に す る た め に ． 町nFR11cDNAの 遺 伝 子 導 入 に よ っ てCOS細 胞 上 に 過 剰 発 現 さ せ た mTFR11受容 体と放射性ヨウ素で標識したBMP＿4（【125qBMP‐4）との結合特異性をりガ ン ド結 合法 で複 合体 分 子量 をア フィ ニテ ィ― クロ スリ ンク 法で 調べ た． その 結果，
mTFR11受 容 体 はrあI】BMP4と結 合し ，分 子 量70kDaのク ロス リン ク複 合 体を 生じ た ．こ の結 合は 未標 識 のBMP．2および 眺＾P・4で効率良く置換され．アクティビンや TGF弔 で は 置 換 さ れ な か っ た． した がっ て，mTFR11受 容体 はBMP‐2およ びBMP‐4に 特異的な受 容体であることが明らかになった・
3．改 変型BMP受容 体に よ るBMPシ グナ ルの 遮断
遺伝 子工 学的 手法 によ っ て細 胞内 ドメ イン を欠 失した改変型BMP受容体を作製し，
こ の 受 容 体 がBMPシ グ ナ ル を 遮 断 で き る か ど う か を 調 べ た ．BMP‑4 mRNAを ツ メ ガ エ ル の4細 胞 期 の 胚 の 背 側 割 球 に 微 量 注 入 す る と 胚 は腹 側化 する が． 改変 型BMP受 容 体mRNAを 同 時 に 注 入 す るとBMP‑4に よる 腹側 化 は抑 制さ れた ．し たが って ，改 変 型BMP受 容体 はツ メガ ェル 胚中 にお ぃてBMPシ グナ ルを 遮断 する 能カ を持 つこ とが分 か った ．
4． 改 変 型 BMP受 容 体 に よ る 初 期 胚 に 内 在 す る BMPシ グ ナ ル の 遮 断 初 期発 生に おけ るBMPの機 能を 明ら かに する こと を目 的 とし て． 改変 型BMP受 容体 によ って 初期 胚の 腹側 割球 に 内在 するBMPシグ ナル を遮 断し．背腹軸形成に及ぼす影 奮 を 調 べ た ． ツ メ ガ エ ル の4細 胞 期 の 胚 の 腹 側 割 球 に 改 変 型BMP受 容 体mRNAを 微 量注 入し て尾 芽胚 期ま で発 生 させると神経管の重複が見られ，さらに発生が進むと本 来の 背側 構造 に加 えて 余分 な 背側 軸構 造を 持っ た2次胚 を生じた．この胚から組織切 片を 作製 した とこ ろ，2次軸 側に は1次 軸側 と同 様に 神経 や筋 肉な どの 背側 の組 織構 造が 形成 され てぃ た． また 、2次 軸側 にお ける 神経 と筋 肉の形成は神経特異的マーカ ーのN‑CAMおよ ぴ筋 肉特 異的 マ― カー のa‑actinをプ ロ― ブに した ホー ルマ ウン ト加 餌む ハイ ブリ ダイ ゼー ショ ン 法によっても確認された‐さらに．初期原腸陥入期にお ける 背側 およ び腹 側特 異的 な 発現を示す分子マ―カ―の発現変化をホールマウント加 餌む ハイ ブリ ダイ ゼー ショ ン 法によって解析した．分子マ―カーとして背側中胚葉領 域に 発現 するgoosecoid．腹 側お よび 側面 中胚 葉領 域に 発 現す るXpo． 全て の中 胚葉 領域 で発 現す るXbraを 用い た 結果 ．BMPシ グナ ルを 遮断 された予定腹側中胚葉領域で はXbraの 発現 を変 化さ せる こ とな しにXpoの発 現が 消失 したが，goosecoicfの発現は 検出 でき なか った ．こ のこ と は．BMPシグ ナル を遮 断さ れた予定腹側中胚葉領域は初
期原腸胚の時点で中胚葉形成能を失うことなく腹側組織ヘ分化できなくなったことを 示してぃる‐
5．まとめ
本研究ではBMP‑2およびBMP‑4に特異的な受容体をコ―ドするcDNAを脊椎動物よ り初めてクロ―二ングした．さらに遺伝子工学的手法によって細胞内ドメインを欠失 させた改変型BMP受容体を作製し、この受容体がBMPシグナルを遮断できることを示 した．初期胚に内在するBMPの役割を明らかにするために，改変型BMP受容体をツ メガェル初期胚中で過剰発現させて内在のBMPシグナルを遮断することを試みたとこ ろ．BMPシグナルを遮断された胚は腹側組織の形成能を失い‐腹側組織の代わりに新 たな背側組織を形成した．したがって．脊椎動物の初期発生過程におぃて内在のBMP は腹側組織の形成を促進してぃることが明らかになった‐さらに、BMPシグナルの遮 断によって腹側組織の代わりに背側組織が形成されたことは、腹側組織の形成が背側 形成因子の支配からの逸脱ではなくBMPによる積極的な促進シグナルによるものであ ることを示してぃる．また．BMPシグナルの遮断によって中胚葉の形成が阻害されな かったことから，BMPは中胚葉の誘導に必須ではなく中胚葉の背腹パタ―ンの形成に 働いてぃることが分かった‐
学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 助教授 助教授
上野 横澤 澁谷 澤田
学 位 論 文 題 名
直人 英良 浩司 均
The role of bone morphogenetic proteins 1n early Xenopus embryo
（骨形 成タンパク 質のアフ リカツメ ガエル初 期胚での 役割）
申請 者らは細胞 増殖因子 のひとつ である骨 形成タン パク質の 初期発生 にお ける機能に 関する研 究を行っ てきたが 、今回以 下のよう な結果を得 た。
最 近 、 成 体 か ら 単 離 さ れ た 種 々 の 細 胞 増 殖 因 子 が 遺 伝 子(mRNA)ま たは タンパク質 として初 期胚に存 在するこ とが明ら かにされ ている。細 胞増 殖因子は、 細胞膜上 の特異的 な受容体 を介して そのシグ ナルを細胞 内に 伝達することにより細胞の増殖や分化を調節するタンパク質である。
した がって、初 期胚中に 内在する 細胞増殖 因子も成 体同様、 その受容体 を介 して細胞増 殖や分化 を調節し 、体の形 づくり（ 形態形成 ）のシグナ ル分 子として機 能してい る可能性 がある。 現在まで に、アフ リカツメガ エル 胚を用いた実験から1、GF‑f3スーバーフんミリーに属する細胞増殖因 子が 脊椎動物の 初期発生 過程で重 要な役割 を担って いること が示されて いる 。このうち 骨形成タ ンパク質(Bone Morphogenetic Protein，BMP)は ツ メガ エ ル 胚の 将 来 背側 の 組織 に な る割 球 にそ のmRNAを微量 注入する と背 側組織（神 経、筋肉 ）を欠失 して腹側 組織（血 球）を過 剰に形成し た 胚 （ 腹 側 化 胚） を 生 じる 。 こ のこ と から 、BMPは腹 側 組織 の 形 成に 役 立 っ て お り 、背 側 組 織形 成 因 子とBMPの相 互 作 用に よ って 初 期 胚の 部 域 化 す な わ ち 背 腹 軸 の 形 成 が 行 わ れ る と 考 え ら れ て い る 。 申請 者 はBMPの 初 期胚 で の役 割 を 明ら か にす る ため に、BMPに特 異的
な 受 容体(BMP受 容 体 ） を 単 離 し た 。 ま た 、 遺 伝 子 工 学 的 手 法 によ っ て 作 製 し た 改 変 型BMP受 容 体 を ツ メ ガ エ ル初 期胚 中で 過剰 発現 させ て 胚 内 のBMPシ グ ナ ル を 遮 断 す る こ とを 試 み 、 胚 に 内 在 す るBMPの機 能 を検討した。
そ の た め に ま ず 申 請者 はBMP受 容 体cDNAの クロ ーニ ング を行 った 。 TGF‑pス ーパ ーフん ミリ ーに 属す る細 胞増 殖因 子は 、セリン／スレオニ ンキ ナー ゼ型 受容 体に 結合して細胞内にシグナルを伝達することが知ら れて いる 。そ こで 、こ れらの受容体間で良く保存されているセリン／ス レオニンキナーゼドメインを利用したreverse transcription‑polymerasc ch血戒面0n（R．T‐PCR）法によって、BMP受容体を高発現しているマウス の 骨 芽 細 胞 か らBMP受 容 体dDNAの ク ロ ー ニ ン グ を 試 み た 。RエK汰 法 によ って 得ら れた 遺伝 子断片から新奇なセリン／スレオニンキナーゼを コ ー ド す る 遺 伝 子 （mnR11） を 選 別 し 、 これ をプ ロー プと して 完全 長 dDNAを単 離 し た と こ ろmn琅11は シ ス テ イ ン 残 基 に 富 ん だ 細 胞 外ド メ イン と1つの 膜貫通 ドメ イン そし て細 胞内 のセ リン ／スレオニンキナー ゼドメインからなる受容体タンノヾク質をコードしてい・ることカ汾かった。
mn琅11受 容 体 がBMP受 容 体 で あ る か ど う か を 明 ら か に す る た めに 、 m1FR11dDNAの 遺 伝 子 導 入 に よ っ て COS細 胞 上 に 過 剰 発 現 さ せ た m1FR11受 容 体と 放射 性ヨ ウ素 で標識 したBMP4（r qBMP．4）と の結 合 特異 性を りガ ンド 結合 法で複合体分子量をアフイニテイークロスリンク 法で 調ぺ た。 その 結果 、m矼琅11受容体は［12s司BMP4と結合し、分子量 70kIkの ク ロ ス リ ン ク 複 合 体 を 生 じた 。 こ の 結 合 は 未 標 識 のBMP12お よびBMP一4で効率良く置換され、アクテイピンや1、．GF‐pでは置換されな い こ とを 示 し 、m1Ht11受 容 体 がBMP一2お よ びBMP4に 特 異 的 な 受容 体 であることを明らかにした。
つ ぎ に 申 請者 は初 期胚 で改 変型BMP受 容体 によ るBMPシグ ナル を遮 断 し 遺 伝 子 工 学 的 手 法 によ っ て 細 胞 内 ド メ イ ンを 欠失 した 改変型BMP受 容 体 を 作 製 し 、 こ の 受容 体 がBMPシ グ ナ ルを 遮断 でき るか どう かを 調 べ た 。BMP14mRNAを ッ メ ガ ェ ル の4細 胞 期 の 胚 の 背 側 割 球 に 微 量注 入 す る と 胚 は 腹 側 化 す る が 、 改 変 型BMP受 容 体mRNAを 同 時 に 注 入す る とBMP‐4によ る腹 側化 は抑 制さ れた 。し たがっ て、 改変型BMP受容体は ツ メ ガ エ ル 胚 中 に お いてm沺 シ グ ナ ル を 遮断 する 能カ を持 つこ とを 示 し た 。 次 に 改 変 型BMP受 容 体 に よ っ て 初 期 胚 の 腹 伺 割 球 に 内 在す る BMPシ グ ナ ル を 遮 断 し 、 背 腹 軸 形 成 に 及 ぽす 影響 を調 べた 。ツ メガ エ ル の4細 胞 期 の 胚 の 腹 側 割 球 に 改 変 型BMP受 容 体mRNAを 微 量 注 入 し
て尾芽胚期まで発生させると神経管の重複が見られ、さらに発生が進む と本来の背側構造に加えて余分な背側軸構造を持った2次胚を生じた。
この胚から組織切片を作製したところ、2次軸側には1次軸側と同様に 神経や筋肉などの背側の組織構造が形成されていた。また、2次軸側に おける神経 と筋肉の形成は神経特異的マーカーのN‑CAMおよぴ筋肉特 異的マーカーのa‑actinをプロープにしたホールマウント而situハイプリ ダイゼーション法によっても確認された。さらに、初期原腸陥入期にお ける背側およぴ腹側特異的な発現を示す分子マーカーの発現変化をホー ルマウント面situハイプリダイゼーション法によって解析した。分子マ ーカーとして背側中胚葉領域に発現するgoosecoid.腹側およぴ側面中胚 葉領域に発現する碑め、全ての中胚葉領域で発現するXbraを用いた結果、
BMPシグ ナルを遮断された予定腹側中胚葉領域ではXbraの発現を変化 させることなしにXpoの発現が消失したが、goosecoidの発現は検出でき なかった。 このことは、BMPシグナルを遮断された予定腹側中胚葉領 域は初期原腸胚の時点で中胚葉形成能を失うことなく腹側組織へ分化で きなくなったことを示している。
申請者は本研究においてBMP‑2および:BMP‑4に特異的な受容体をコー ドするcDNAを脊椎動物より初めてクローニングし、さらに遺伝子工学 的手法によ って細胞内ドメインを欠失させた改変型BMP受容体を作製 することに よって、BMPが初期発生制御において重要な機能を担って いることを明らかにした。
よって、以上の研究は博士（薬学）の学位を受けるに充分値するもの と認めた。
