早稲田大学大学院 先進理工学研究科
博 士 論 文 概 要
経 鼻 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン に よ り 誘 導 さ れ る 分 泌 型 I g A 抗 体
の 解 析
Analysis of Secretory IgA Antibody Induced by Intranasal Influenza Vaccine
申 請 者
齊藤 慎二 Shinji SAITO
生命医科学専攻 生命分子工学研究
2015 年 12 月
No.1
本 研 究 で は 、 次 世 代 ワ ク チ ン と し て 期 待 さ れ て い る 経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 実 用 化 を 目 指 し 、 経 鼻 ワ ク チ ン の 開 発 上 問 題 と な り う る 安 全 性 に 関 し て 検 討 を す る た め に ワ ク チ ン 抗 原 の 動 態 解 析 を 行 っ た 。 ま た 、 経 鼻 ワ ク チ ン に よ り 誘 導 さ れ る 免 疫 応 答 を 詳 細 に 理 解 す る た め に 分 泌 型 I g A（s - I g A） 抗 体 の 解 析 を 行 っ た 。
ヒ ト へ の イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス 感 染 は 、 伝 染 性 の 急 性 呼 吸 器 疾 患 （ イ ン フ ル エ ン ザ ） を 引 き 起 こ す 。 現 在 、 世 界 的 に 季 節 性 イ ン フ ル エ ン ザ の 流 行 阻 止 を 目 的 に 、 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン （ ヘ マ グ ル チ ニ ン （H A） 又 は サ ブ ユ ニ ッ ト ） が 皮 下 又 は 筋 肉 内 へ 接 種 さ れ て い る 。 こ の ワ ク チ ン は 主 に 血 清 中 に H A 特 異 的 な
I g G 抗 体 を 誘 導 で き 、 ワ ク チ ン 株 と 流 行 株 の 抗 原 性 が 一 致 又 は 非 常 に 近 い 時 は 死
亡 率 と 罹 患 率 を 低 下 さ せ 予 防 効 果 を 示 す 。 し か し 、 ワ ク チ ン 株 と 流 行 株 の 抗 原 性 が 乖 離 し て し ま っ た 場 合 、 予 防 効 果 が 著 し く 減 少 す る 。 一 方 、 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス の 上 気 道 粘 膜 上 皮 細 胞 へ の 感 染 は 、 血 清 中 の I g G 抗 体 の み な ら ず 、 上 気 道 粘 膜 上 へ s - I g A 抗 体 も 誘 導 す る 。 こ の 誘 導 さ れ た s - I g A 抗 体 は 、 上 気 道 粘 膜 上 に お い て 、 相 同 ウ イ ル ス の 感 染 を 防 ぐ だ け で な く 、 抗 原 連 続 変 異 に よ り 抗 原 性 が 乖 離 し た 非 相 同 ウ イ ル ス に も 交 叉 防 御 能 を 持 つ 。 こ の こ と か ら 、 現 行 の 接 種 法 に 変 わ る 、 よ り 効 果 的 な 予 防 接 種 法 は 、 自 然 感 染 を 模 倣 す る こ と が 重 要 で あ る と 考 え ら れ る 。 実 際 に 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 上 気 道 粘 膜 へ の 接 種 は 、 ウ イ ル ス の 感 染 と 同 様 に 上 気 道 粘 膜 上 へ s - I g A 抗 体 を 誘 導 す る こ と が 可 能 で あ る 。
経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 実 用 化 研 究 の 歴 史 は 古 く 、1 9 6 0 年 代 か ら 開 発 が 始 ま っ て い る 。 し か し な が ら 、 現 行 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 抗 原 と し て 用 い ら れ て い る 不 活 化 H A 抗 原 単 独 の 経 鼻 接 種 で は 、 十 分 な 抗 体 応 答 を 誘 導 で き な い こ と が 大 き な 課 題 で あ っ た 。1 9 8 0 年 代 以 降 ア ジ ュ バ ン ト 併 用 不 活 化 ワ ク チ ン の 研 究 が 進 み 、 大 腸 菌 易 熱 性 毒 素 を ア ジ ュ バ ン ト と し た 経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン が 2 0 0 0 年 に は 認 可 さ れ た 。し か し な が ら 、本 ワ ク チ ン の 被 接 種 者 の 一 部 が ワ ク チ ン 接 種 と の 関 連 が 疑 わ れ る ベ ル 麻 痺 （ 顔 面 神 経 麻 痺 ） を 発 症 し た こ と が 報 告 さ れ 、 こ の ワ ク チ ン の 使 用 は 中 止 さ れ た 。 そ し て 、 現 在 ま で に 使 用 可 能 な 経 鼻 不 活 化 ワ ク チ ン は イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン に 限 ら ず 一 つ も 存 在 し な い 。 こ の よ う な 社 会 的 背 景 か ら 、 ヒ ト 用 の 経 鼻 不 活 化 ワ ク チ ン の 実 用 化 に は 、 抗 原 や ア ジ ュ バ ン ト 、 製 剤 の 工 夫 に よ り 有 効 か つ 安 全 性 の 高 い ワ ク チ ン の 開 発 が 求 め ら れ て お り 、 特 に 現 行 の ワ ク チ ン で は 詳 細 に 検 討 さ れ て い な い 、 ワ ク チ ン の 中 枢 神 経 移 行 性 と い う 観 点 で 安 全 性 を 担 保 す る こ と が 重 要 と 考 え ら れ て い る 。
上 気 道 粘 膜 で の 免 疫 応 答 や ワ ク チ ン 効 果 の 検 討 等 は マ ウ ス や 非 ヒ ト 霊 長 類 な ど 動 物 実 験 モ デ ル で 検 証 さ れ て い る が 、 ヒ ト に お い て 経 鼻 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 有 効 性 と 現 行 の 皮 下 接 種 ワ ク チ ン に 対 す る 優 位 性 を 科 学 的 に 証 明 す る た め に は 、 ヒ ト 気 道 粘 膜 上 に 誘 導 さ れ る 抗 体 に 関 す る 詳 細 な 解 析 が 必 須 で あ る 。 更 に ヒ ト に お い て 、 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス の 感 染 防 御 に 働 く s - I g A 抗 体 は 二 量 体 だ け で な
く 三 量 体 、 四 量 体 も 存 在 す る こ と が 示 さ れ 、 多 量 体 化 す る こ と に よ り 中 和 活 性 が 上 昇 す る こ と 等 、 新 た な 知 見 が 明 ら か と な っ て い る 。I g A 抗 体 は 生 体 内 で I g G に 次 ぎ 豊 富 に 存 在 す る ア イ ソ タ イ プ で あ り 、s - I g A 抗 体 は 病 原 体 や 毒 素 か ら 上 皮 を 保 護 す る 第 一 の 防 衛 線 で あ る こ と が 知 ら れ て い る が 、 未 だ 不 明 な 点 が 多 い 。 そ の た め 、s - I g A 抗 体 の 研 究 の 推 進 や 更 な る 詳 細 な 解 析 の た め に も 、研 究 手 法 の 開 発 、 評 価 系 の 整 備 は 急 務 で あ る 。
本 論 文 の 第 一 章 で は 、緒 言 と し て 本 研 究 の 背 景 や 未 だ 解 決 さ れ て い な い 問 題 点 、 今 後 の 展 望 に 関 わ る 知 見 等 を 纏 め 、 本 研 究 の 重 要 性 に 関 し て 簡 潔 に 記 述 し た 。 第 二 章 で は 、 経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 接 種 部 位 と な る 鼻 腔 領 域 内 及 び 全 身 で の 動 態 を 明 ら か に し 、 そ の 安 全 性 と 効 果 の 検 討 を 行 っ た 。 経 鼻 ワ ク チ ン で は 接 種 法 に 関 連 し て 、 抗 原 の 中 枢 神 経 系 へ の 輸 送 ・ 蓄 積 や 肺 へ の 移 行 等 が 懸 念 さ れ て い る 。 し か し な が ら 、 ワ ク チ ン 製 剤 の 安 全 性 評 価 と し て 一 般 的 に 行 わ れ て い る 方 法 で は 、 そ の よ う な 抗 原 の 動 態 を 明 ら か に す る こ と は 難 し い 。 そ こ で 、 非 ヒ ト 霊 長 類 と マ ウ ス を 用 い て 、 放 射 性 同 位 体[1 8F ]で 標 識 し た ワ ク チ ン 抗 原 を 経 鼻 接 種 し 、そ の 動 態 に 関 し て ポ ジ ト ロ ン 放 出 断 層 撮 影 法 を 用 い て 解 析 し た 。ま た 、 点 鼻 薬 に お い て 薬 剤 の 粘 膜 へ の 付 着 性 を 向 上 さ せ る 粘 稠 剤 と し て 既 に 日 本 で 承 認 さ れ て い る カ ル ボ キ シ ビ ニ ル ポ リ マ ー （c a r b o x y - v i n y l p o l y m e r, C V P） を ワ ク チ ン に 添 加 し た 場 合 、 鼻 腔 領 域 に お け る ワ ク チ ン 抗 原 の 滞 留 性 が 向 上 す る こ と を 示 し た 。 次 に 、C V P の 添 加 に よ る ワ ク チ ン の 免 疫 原 性 へ の 影 響 を 評 価 す る た め に 、 高 病 原 性 鳥 イ ン フ ル エ ン ザ A ( H 5 N 1 )ウ イ ル ス に 対 す る C V P 添 加 経 鼻 ワ ク チ ン を 、非 ヒ ト 霊 長 類 を 用 い て 検 討 し た 。 粘 膜 ア ジ ュ バ ン ト で あ る A m p l i g e n（ 合 成 二 本 鎖 R N A：p o l y I : p o l y C1 2U） を 添 加 す る こ と で 誘 導 さ れ た 血 清 I g A 抗 体 応 答 は 、C V P の 添 加 に よ り A m p l i g e n の 量 を 半 分 に し て も 同 等 の 抗 体 応 答 を 誘 導 可 能 で あ っ た 。
C V P の 添 加 に よ り 、 粘 膜 ア ジ ュ バ ン ト 量 を 低 減 す る こ と が 可 能 で あ る と 考 え ら れ
た 。 ま た 、 初 回 の ワ ク チ ン 接 種 か ら 約 1 年 後 に ワ ク チ ン 株 と 相 同 な A ( H 5 N 1 )ウ イ ル ス の 感 染 実 験 を 実 施 し た 所 、 ワ ク チ ン 接 種 個 体 で は 上 気 道 で の ウ イ ル ス 増 殖 が 抑 制 さ れ る こ と が 示 さ れ た 。 こ れ ら の 非 ヒ ト 霊 長 類 を 用 い た 実 験 か ら 、 適 切 な 粘 膜 ア ジ ュ バ ン ト と C V P を 組 み 合 わ せ た 経 鼻 全 粒 子 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン は 、新 型 イ ン フ ル エ ン ザ に 対 す る 新 た な ワ ク チ ン 候 補 に な り う る と 考 え ら れ た 。
第 三 章 で は 、 経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン に よ り 誘 導 さ れ る 抗 体 産 生 形 質 細 胞 か ら 組 換 え モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 作 製 し 、 そ の 特 性 解 析 を 実 施 し た 。 経 鼻 A ( H 5 N 1 )イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 臨 床 研 究 に お い て 、 誘 導 さ れ る 抗 体 の 特 徴 を 明 ら か に す べ く 、 ワ ク チ ン 接 種 に よ り 誘 導 さ れ た 形 質 細 胞 が 産 生 す る 抗 体 に 関 し て ア イ ソ タ イ プ の 解 析 を 行 い 、 経 鼻 ワ ク チ ン 接 種 は I g A 抗 体 産 生 形 質 細 胞 を 多 く 誘 導 す る こ と を 明 ら か に し た 。 抗 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス H A 抗 体 と し て 、 広 域 中 和（b r o a d l y n e u t r a l i z i n g , b N）抗 体 の 存 在 が 注 目 さ れ て い る 。b N 抗 体 の 多 く は 、
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す る こ と が 知 ら れ て い る 。 そ の 知 見 に 基 づ き 、 異 な る 亜 型 で あ る A ( H 1 N 1 )と A ( H 5 N 1 )ウ イ ル ス に 対 し て 中 和 活 性 を 示 す 2 つ の b N 抗 体 の 単 離 に 成 功 し た 。経 鼻 ワ ク チ ン 接 種 に お い て も ウ イ ル ス 感 染 や 注 射 型 ワ ク チ ン 接 種 と 同 様 に b N 抗 体 が 誘 導 さ れ る と 考 え ら れ た 。
第 四 章 で は 、s - I g A 抗 体 の 大 き な 特 徴 で あ る 四 量 体 を i n v i t ro で 作 製 す る 系 の 確 立 を 行 っ た 。 ま た そ の 系 を 利 用 し て 、I g A 抗 体 の 多 量 体 化 に よ る 中 和 活 性 へ の 影 響 を 検 討 し 、更 に 多 量 体 化 に 関 わ る モ チ ー フ の 同 定 を 行 っ た 。s - I g A 抗 体 は H 鎖 、 L 鎖 及 び J 鎖 、 分 泌 因 子 （S C） の 4 つ か ら 構 成 さ れ て い る と 考 え ら れ て い る が 、 そ の 4 因 子 を 細 胞 へ 共 導 入 す る こ と に よ り 、 四 量 体 I g A 抗 体 を 作 製 で き る こ と を 示 し た 。今 回 確 立 し た 方 法 で 作 製 し た 四 量 体 I g A 抗 体 は 、質 量 分 析 か ら 約 7 2 0 k D a の 分 子 量 を 有 し 、H 鎖 ：L 鎖 ：J 鎖 ：S C＝8：8：1：1 の 比 率 で 構 成 さ れ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ヒ ト の I g A 抗 体 は 2 つ の I g A サ ブ ク ラ ス （I g A 1 及 び I g A 2） に 分 け ら れ 、 更 に I g A 2 は 3 つ の ア ロ タ イ プ （I g A 2 m 1、I g A 2 m 2 及 び I g A 2 ( n )） に 分 類 さ れ る 。 そ れ ら I g A 抗 体 の 種 類 に 応 じ て 四 量 体 化 の 程 度 に 差 が 認 め ら れ る こ と を 見 出 し た た め 、I g A 抗 体 の 四 量 体 化 に 関 連 す る モ チ ー フ の 探 索 を 行 っ た 。I gA 抗 体 の C 末 領 域 に 存 在 す る 4 5 8 番 目 の ア ミ ノ 酸 に 決 定 的 な 役 割 が 認 め ら れ 、そ の 部 位 が I g A 1 タ イ プ の バ リ ン で は な く I g A 2 m 2 タ イ プ の イ ソ ロ イ シ ン で あ る 場 合 に 四 量 体 化 が 促 進 さ れ た 。 そ の た め 、 こ の １ 残 基 が 多 量 体 形 成 に 重 要 で あ る と 結 論 付 け た 。 作 製 し た モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を ゲ ル 濾 過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 分 子 量 依 存 的 に 分 画 し 、イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス に 対 す る 中 和 活 性 を 評 価 し た と こ ろ 、
I g A 抗 体 の 四 量 体 化 に と も な い 中 和 活 性 が 増 強 さ れ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 こ
れ は 、 ヒ ト 由 来 の ポ リ ク ロ ー ナ ル I g A 抗 体 で 多 量 体 分 画 （ 主 に 四 量 体 以 上 ） の 中 和 活 性 が 高 い と い う 報 告 と 一 致 す る 。 以 上 か ら 、 四 量 体 化 自 体 に 中 和 活 性 を 増 強 す る メ カ ニ ズ ム が 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。
最 後 に 第 五 章 で は 、 本 研 究 の 総 括 を 行 っ た 。 本 研 究 で は 、 経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 実 用 化 を 目 指 し 、 開 発 の 障 壁 と な り う る （ １ ） ワ ク チ ン 中 枢 神 経 移 行 性 の 評 価 系 と （ ２ ） ワ ク チ ン 有 効 性 の 最 重 要 因 子 で あ る ヒ ト s - I g A 抗 体 性 状 の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 レ ベ ル で の 評 価 系 を 確 立 し 、 現 在 、 最 も 実 用 化 に 近 い と 考 え ら れ て い る 不 活 化 全 粒 子 抗 原 を 用 い た ワ ク チ ン の 安 全 性 と 有 効 性 を 評 価 し た 。 本 研 究 に よ り 、 不 活 化 全 粒 子 抗 原 を 用 い た 経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 開 発 が 一 層 促 進 さ れ る こ と が 期 待 さ れ る だ け で な く 、 さ ら に 、 抗 原 量 の 減 量 や ア ジ ュ バ ン ト を 追 加 ／ 改 変 す る こ と に よ り 、 よ り 有 効 性 と 安 全 性 が 高 い ワ ク チ ン を 目 指 し た 開 発 研 究 が 促 進 す る と 考 え ら れ る 。 経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 実 用 化 研 究 は 、2 0 0 0 年 以 来 1 0 年 以 上“死 の 谷”に あ っ た が 、 本 研 究 成 果 を 基 礎 と し て 、 更 に 研 究 が 発 展 し 、 毎 年 の よ う に 世 界 中 で 発 生 す る イ ン フ ル エ ン ザ の 流 行 を 安 全 に コ ン ト ロ ー ル で き る イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン が 開 発 さ れ る こ と が 望 ま れ る 。
Ｎｏ.1
早稲田大学 博士（工学） 学位申請 研究業績書
氏 名 齊藤 慎二 印
（2016 年 1 月 現在）
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
論文
講演
1. ○Shinji Saito, Akira Ainai, Tadaki Suzuki, Norihiro Harada, Yasushi Ami, Yoshikazu Yuki, Haruko Takeyama, Hiroshi Kiyono, Hideo Tsukada and Hideki Hasegawa. The effect of mucoadhesive excipient on the nasal retention time of and the antibody responses induced by an intranasal influenza vaccine. Vaccine, ELSEVIER, in press
1. 齊藤慎二、鈴木忠樹、相内章、Elly van Riet、大原有樹、高橋宜聖、田村愼一、竹山 春子、長谷川秀樹「分泌型多量体IgA抗体の作製法の開発」第63回日本ウイルス学 会学術集会、福岡、11月 2015
2. Shinji Saito, Akira Ainai, Tadaki Suzuki, Norihiro Harada, Shin-ichi Tamura,Yoshikazu Yuki, Takato Odagiri, Makito Tashiro, Haruko Takeyama, Hideo Tsukada, Hiroshi Kiyono and Hideki Hasegawa. Impact of a nasal mucoadhesive excipient, carboxy-vinyl polymer, on enhancement of immune responses induced by intranasal administration of an inactivated influenza vaccine. 9th Vaccine & ISV Congress, Seoul, Korea, October 2015
3. 齊藤慎二、相内 章、鈴木忠樹、原田典弘、田村愼一、幸 義和、小田切孝人、田 代眞人、竹山春子、塚田秀夫、清野 宏、長谷川秀樹「経鼻インフルエンザワクチ ンの動態と抗体応答」第29回インフルエンザ研究者交流の会シンポジウム、東京、
5月 2015
4. 齊藤慎二、Elly van Riet、相内章、鈴木忠樹、大原有樹、池田千将、伊藤良、泉地恭 輔、高橋宜聖、浅沼秀樹、小田切孝人、田代眞人、田村愼一、竹山春子、長谷川秀 樹「経鼻インフルエンザワクチンにより誘導されたヒトモノクローナル抗体の特性 解析」第18回日本ワクチン学会学術集会、福岡、12月 2014
5. 齊藤慎二、Elly van Riet、相内章、鈴木忠樹、池田千将、伊藤良、泉地恭輔、高橋宜 聖、浅沼秀樹、小田切孝人、田代眞人、田村愼一、竹山春子、長谷川秀樹「高病原 性鳥インフルエンザ A(H5N1)ウイルスの経鼻不活化全粒子ワクチンにより誘導され たヒトモノクローナル抗体の特性解析」第62回日本ウイルス学会学術集会、横浜、
11月 2014
6. Shinji Saito, Elly van Riet, Akira Ainai, Tadaki Suzuki, Kazuyuki Ikeda, Ryo Ito, Kyousuke Senchi, Hideki Asanuma, Takato Odagiri, Yoshimasa Takahashi, Masato Tashiro, Shin-ichi Tamura, Haruko Takeyama and Hideki Hasegawa. Characterization of monoclonal antibodies induced by the intranasal administration with a whole-virion inactivated H5N1 Influenza vaccine in healthy human adults. International Symposium on Integration of Chemistry and Bioscience, Tokyo, Japan, January 2014
Ｎｏ.2
早稲田大学 博士（工学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
その他
（特許）
（論文）
1. 齊藤慎二、鈴木忠樹、長谷川秀樹、相内章、後藤希代子、上野智規「抗インフルエ ンザウイルス抗体及びその利用」PCT/JP2015/70719、7月 2015
2. 齊藤慎二、鈴木忠樹、長谷川秀樹、相内章、後藤希代子、上野智規「多量体 IgA 型 遺伝子組換え抗体及びその利用」PCT/JP2015/70742、7月 2015
3. 齊藤慎二、鈴木忠樹、長谷川秀樹、相内章、後藤希代子、上野智規「抗インフルエ ンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント、インフルエンザウイルスによる 感染症の治療又は予防剤、及び抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フ ラグメントをコードする核酸及びベクター」特願2014-148329、7月 2014
4. 齊藤慎二、鈴木忠樹、長谷川秀樹、相内章、後藤希代子、上野智規「多量体 IgA 型 遺伝子組換え抗体、医薬、多量体 IgA 型抗体の製造方法及び抗体の抗原結合活性又 は中和活性を向上させる方法」特願2014-148328、7月 2014
1. Alam Khan, Andrew Nakamoto, Miyako Tai, Shinji Saito, Yukiko Nakayama, Akinori Kawamura, Hiroyuki Takeda, Kyo Yamasu. Mesendoderm specification depends on the function of Pou2, the class V POU-type transcription factor, during zebrafish embryogenesis.
Development, Growth & Differentiation, Japanese Society of Developmental Biologists, Volume 54, Issue 7, pages 686-701, September 2012
