博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院理工学研究科

博  士  論  文  概  要

論   文   題   目

Extended HAUP 法によるコバルト錯体及びヘモグロビン単結晶の

光学活性 ( 旋光性および円二色性 ) 測定の遂行

Achievement to measurement of optical activity

(circular birefringence and circular dichroism) for single crystals of cobalt complex and hemoglobin by the Extended HAUP method

申  請  者

松木  亮 Ryo Matsuki

生命理工学専攻  脳活動ハイテク測定技術研究

2003年10月

1

タ ン パ ク 質 、D N Aの よ う な 生 物 を 構 成 し て い る 生 体 高 分 子 は 、 二 次 、 三 次 構 造 な ど の 高 次 構 造 を も ち 、 そ れ に よ り 機 能 性 を 発 現 す る と い わ れ て い る 。 し た が っ て 、 生 体 高 分 子 の 構 造 を 解 析 す る こ と は 生 物 の 生 命 活 動 全 般 の 研 究 に お い て 非 常 に 重 要 な 位 置 を し め る 。 こ れ ま で の 構 造 研 究 の 代 表 的 な 例 を あ げ る と 古 く は ミ オ グ ロ ビ ン を は じ め 、 リ ゾ チ ー ム 、 ヘ モ グ ロ ビ ン 等 のX線 結 晶 解 析 や 近 年 で は

N M Rと い う 手 法 に よ り 様 々 な タ ン パ ク 質 の 溶 液 中 で の 一 部 構 造 が 明 ら か に さ れ

て き て い る 。

ヘ モ グ ロ ビ ン は 酸 素 を 吸 着 、 放 出 す る こ と に よ り 体 内 に 酸 素 を 運 搬 す る 役 割 を 持 つ 。 ヘ モ グ ロ ビ ン の 酸 素 飽 和 曲 線 はS字 型 を 描 く が こ れ は 最 初 に 結 合 し た 酸 素 に よ り 誘 起 さ れ た 他 の サ ブ ユ ニ ッ ト の 構 造 変 化 に 由 来 す る と い わ れ て い る 。 こ の こ と は オ キ シ ヘ モ グ ロ ビ ン お よ び デ オ キ シ ヘ モ グ ロ ビ ン の そ れ ぞ れ の 二 状 態 に お け るX線 結 晶 構 造 解 析 よ り 推 測 さ れ る 。 し か し こ の 二 状 態 間 の 電 子 状 態 の 遷 移 ダ イ ナ ミ ク ス を 推 測 す る 域 に は い ま だ に な い 。 ま た 、 生 物 の 運 動 機 能 を つ か さ ど る 筋 肉 は 、 ア ク チ ン 、 ミ オ シ ン の 筋 繊 維 で 構 成 さ れ て い る 。 そ し て こ の 筋 肉 に よ る 生 物 の ダ イ ナ ミ ッ ク な 運 動 は 実 は そ れ を 構 成 し て い る タ ン パ ク 質 で あ る ア ク チ ン 、 ミ オ シ ン の 構 造 変 化 、 す な わ ち 両 者 の 互 い の 滑 り 運 動 を 引 き 起 こ す 原 因 と な る タ ン パ ク 質 構 造 変 化 と さ れ て い る の で あ る 。

こ の 様 に 生 体 高 分 子 の 構 造 と そ の 機 能 と は 密 接 に 関 連 し て い る 。 し か し な が ら 、 現 在 の と こ ろ 現 象 論 的 な 解 析 に と ど ま り 、 二 状 態 間 に お け る 電 子 状 態 な ら び に 電 子 状 態 遷 移 を 記 述 す る ダ イ ナ ミ ク ス は 未 解 明 の ま ま で あ る 。

生 体 高 分 子 は 分 子 量 が 非 常 に 巨 大 で あ る と い う 特 徴 の ほ か に キ ラ リ テ ィ を 持 つ も の が 大 部 分 で あ り 、 光 学 活 性 を も つ と い う 大 き な 特 徴 が あ る 。 本 研 究 は こ の 光 学 活 性 に 着 目 し 、 生 物 の 様 々 な 機 能 を つ か さ ど る タ ン パ ク 質 の 二 次 構 造 、 特 に キ ラ リ テ ィ の あ る α- h e l i xと そ の 電 子 状 態 と の 関 連 を 光 学 活 性 で 調 べ る こ と を 将 来 の 究 極 的 な 目 的 と し て い る 。 こ れ はX線 構 造 解 析 やNMR、 そ の 他 従 来 の 構 造 解 析 と は 別 な 観 点 か ら の 分 子 構 造 に 由 来 す る 電 子 の 摂 動 的 知 見 が 得 ら れ る 可 能 性 が あ る か ら で あ り 、 機 能 と の 相 関 を 推 測 す る こ と が で き る 可 能 性 を 秘 め て い る 。

従 来 の 光 学 活 性 の 測 定 法 で は 異 方 性 の あ る 場 合 に は 光 学 活 性 に 比 べ て1 0^２〜 1 0³ほ ど 大 き い 複 屈 折 が 存 在 す る た め 測 定 は 不 可 能 と さ れ 、 従 っ て 通 常 は 溶 液 状 態 に お い て 測 定 さ れ て き た 。 し か し な が ら 、1 9 8 3年 に 単 結 晶 の 旋 光 性 の 測 定 を 可 能 に す る 装 置H A U P ( H i g h A c c u r a c y U n i v e r s a l P o l a r i m e t e r )が 開 発 さ れ た 。 こ れ ま で に も 、 様 々 な 無 機 結 晶 の 測 定 に 成 功 し て い る 実 績 が あ る 。 し か し な が ら 、1 9 8 3年 に 開 発 さ れ たH A U Pは 吸 収 を 考 慮 し て お ら ず 、 円 二 色 性 や 線 二 色 性 を 示 す 領 域 、 あ る い は 試 料 に は 適 用 さ せ る こ と が で き な か っ た 。 そ こ で 、1 9 9 6年 に 、 吸 収 の あ る 領 域 を 含 め て 旋 光 性 お よ び 円 二 色 性 の 測 定 を 可 能 と す るE x t e n d e d H A U P法 が 開 発 さ れ た 。E x t e n d e d H A U P法 に 対 し て 、 初 期 に 開 発 さ れ た 方 法 をO r i g i n a l H A U P 法 と 呼 ぶ 。

2

本 研 究 は 、E x t e n d e d H A U P法 を 用 い て 前 述 の よ う に タ ン パ ク 質 単 結 晶 の 円 二 色 性 測 定 を 最 終 的 な 目 標 と し て 、 そ の 遂 行 の た め の 予 備 的 研 究 段 階 に 位 置 づ け ら れ る 。 そ の た め に 本 研 究 で は 光 学 活 性 測 定 の 試 料 と し て ト リ ス エ チ レ ン ジ ア ミ ン コ バ ル ト 錯 体 お よ び ヘ モ グ ロ ビ ン 単 結 晶 を 使 用 し た 。 両 者 と も 可 視 領 域 に 円 二 色 性 を 示 す 。

第 一 章 で は 上 述 し た よ う な 研 究 背 景 お よ び 研 究 目 的 が 述 べ ら れ て い る 。

  第 二 章 で は 研 究 を 行 う 上 で 必 要 な 基 礎 的 な 電 磁 光 学 的 現 象 に つ い て 述 べ て あ る 。 さ ら に 光 学 活 性 と い う 現 象 が 実 際 ど の よ う な 現 象 で あ る か を 説 明 し て い る 。 さ ら に 偏 光 状 態 を 、 ポ ア ン カ レ 球 を 用 い た 視 覚 的 な 偏 光 表 示 お よ び ジ ョ ー ン ズ ベ ク ト ル 表 示 を 用 い た 解 析 的 な 偏 光 表 示 の 二 例 を 示 し 、H A U P法 の 理 論 を 理 解 す る 上 で 参 考 に で き る よ う に し て あ る 。

  第 三 章 で はH A U P法 の 概 略 を 説 明 し て あ り 、 吸 収 を 含 め な いO r i g i n a l H A U P法 と 吸 収 を 考 慮 し たE x t e n d e d H A U P法 の 両 方 の 説 明 が し て あ る 。 本 研 究 に お い て 、 旋 光 性 お よ び 円 二 色 性 の 測 定 に は 後 者 のE x t e n d e d H A U P法 を 用 い て い る 。H A U P法 の 特 徴 は 装 置 の 光 学 系(偏 光 子 お よ び 検 光 子)の 系 統 誤 差 を 考 慮 す る こ と に よ り 初 め て 単 結 晶 の 光 学 活 性 の 測 定 を 可 能 に し て い る と い う 点 が 最 大 の 特 徴 で あ る 。 O r i g i n a l H A U P法 とE x t e n d e d H A U P法 で は 実 験 系 は 全 く 同 じ で あ る が 吸 収 を 含 め る か 否 か に よ る 原 理 式 の 違 い が あ る だ け で あ る 。 そ し て 両 者 と も 実 験 系 の 系 統 誤 差 を 考 慮 し て 初 め て 異 方 性 単 結 晶 の 光 学 活 性 測 定 を 可 能 に し て お り 、 そ の 理 由 を 含 め て 説 明 し て い る 。

  第 四 章 で はE x t e n d e d H A U P法 に よ る 系 統 誤 差 お よ び 光 学 活 性(旋 光 性 お よ び 円 二 色 性)を 決 定 す る た め の 実 験 デ ー タ 解 析 法 を 提 案 し て い る 。E x t e n d e d H A U P法 で は 測 定 原 理 式 中 に 試 料 の 吸 収 の 効 果 も 含 ま れ る た め 、 吸 収 の 効 果 を 含 め な い O r i g i n a l H A U P法 に 比 べ て 測 定 原 理 式 が 複 雑 に な り 、E x t e n d e d H A U P法 で は

O r i g i n a l H A U P法 で 用 い ら れ て い た 従 来 の 解 析 法 を 使 用 す る 事 が で き な い と い う

問 題 点 が あ る 。 そ こ で 、 こ こ で はE x t e n d e d H A U P法 の 測 定 原 理 式 に 最 小 二 乗 法 を 適 用 さ せ て 系 統 誤 差 お よ び 光 学 活 性 の 未 知 パ ラ メ ー タ を 決 定 す る と い う 方 法 を 提 案 し て い る 。

  第 五 章 で は 第 四 章 で 新 た に 提 案 さ れ た 解 析 法 を 用 い てE x t e n d e d H A U P法 に よ る 実 際 の 試 料 を 用 い た 光 学 活 性 測 定 の 実 験 結 果 と そ の 解 析 結 果 が 述 べ ら れ て い る 。 こ こ で は 、 ま ず 最 初 に 光 学 不 活 性 な 物 質 で あ る リ チ ウ ム ナ イ オ ベ イ ト( L i N b O3)の 実 験 デ ー タ お よ び 解 析 結 果 を 示 し て い る 。 リ チ ウ ム ナ イ オ ベ イ ト を 用 い た 測 定 に よ り 光 学 系 の 一 つ で あ る 偏 光 子 の 系 統 誤 差pを 決 定 し た 。 後 に 続 く 光 学 活 性 物 質 の 測 定 に は リ チ ウ ム ナ イ オ ベ イ ト を 用 い て 決 定 さ れ た 偏 光 子 の 系 統 誤 差pは 不 変 で あ る と い う 仮 定 の 下 に 実 験 を し て い る 。 実 際 にE x t e n d e d H A U P法 で 光 学 活 性 を 測 定 す る た め ト リ ス エ チ レ ン ジ ア ミ ン コ バ ル ト 錯 体 ヨ ウ 化 物 を 試 料 と し て 用 い 、

E x t e n d e d H A U P法 に よ り 旋 光 性 お よ び 円 二 色 性 の 測 定 を 試 み た 。 こ の 錯 体 は 過 去

3

に 可 視 領 域 で 単 結 晶 の 光 軸 方 向 で 円 二 色 性 の 測 定 が な さ れ て お り 、E x t e n d e d

H A U P法 で 得 ら れ た 測 定 結 果 と 比 較 し や す い と い う 利 点 が あ る 。 さ ら に 、 後 に 続

く ヘ モ グ ロ ビ ン と 同 様 に 可 視 領 域 に 円 二 色 性 を 示 す た め こ の 実 験 結 果 が ヘ モ グ ロ ビ ン 単 結 晶 の 光 学 活 性 測 定 へ 応 用 す る た め の 実 験 の 予 備 的 準 備 と い う 位 置 づ け に も な る と い う 利 点 が あ る 。 コ バ ル ト 錯 体 単 結 晶 の 独 立 し た 三 方 向 か ら の 測 定 に 成 功 し 、 波 長5 1 4 . 5 n mに お け る 旋 光 性 と 円 二 色 性 の 測 定 に 成 功 し た 。 ま た 、 そ の う ち の 一 方 向 に 関 し て は キ ラ リ テ ィ が 反 対 で あ る 物 質 に 関 し て も 測 定 に 成 功 し 、 旋 光 性 と 円 二 色 性 の 符 号 が そ の キ ラ リ テ ィ を 反 映 し て 逆 と な り 、 そ の 大 き さ も ほ ぼ 一 致 す る 事 が 確 か め ら れ た 。 単 結 晶 で の 光 学 活 性 の 測 定 で キ ラ リ テ ィ を 反 映 し た 結 果 が 得 ら れ た の は こ の 物 質 の み な ら ず 初 め て の 事 で あ る 。 ま た 、 過 去 に 、 同 様 な コ バ ル ト 錯 体 で 、 塩 が 異 な る 物 質 の 単 結 晶 光 軸 方 向 円 二 色 性 測 定 の 報 告 が あ る が 、 本 研 究 で 測 定 さ れ た コ バ ル ト 錯 体 ヨ ウ 化 物 の 円 二 色 性 と 大 き さ の オ ー ダ ー お よ び 符 号 が 一 致 し て い る こ と も 確 認 で き た 。

  第 六 章 で はE x t e n d e d H A U P法 を 用 い た 、 ヘ モ グ ロ ビ ン 単 結 晶 の 光 学 活 性 測 定 の 実 験 結 果 を 示 し て い る 。 タ ン パ ク 質 の α- helixに 関 す る 光 学 活 性 は2 0 0 n m付 近 の 紫 外 領 域 に 現 れ る が 、 現 在 の と こ ろ そ の 波 長 領 域 の 連 続 光 の レ ー ザ ー が な い た め 可 視 光 領 域 で 連 続 光 を 出 す レ ー ザ ー を 用 い て 実 験 し た 。 ヘ モ グ ロ ビ ン は コ バ ル ト 錯 体 と 同 様 に 可 視 領 域 で も 円 二 色 性 を 示 し 、 こ の 実 験 を 通 し てE x t e n d e d H A U P法 を タ ン パ ク 質 単 結 晶 で 測 定 す る 際 の 問 題 点 を 検 証 し 、 解 決 方 法 を 提 案 す る 。 こ こ で 蓄 え ら れ た 知 見 を 、 測 定 波 長 を 紫 外 領 域 に す る こ と で タ ン パ ク 質 の α- h e l i xと 光 学 活 性 と の 関 連 を 研 究 す る 上 で の 礎 に す る 。

  第 七 章 で は 本 研 究 で 得 ら れ たE x t e n d e d H A U P法 に よ る 光 学 活 性(旋 光 性 お よ び 円 二 色 性)測 定 の 成 果 を ま と め 、 さ ら に 、 こ の 研 究 に よ り 明 ら か に さ れ た

E x t e n d e d H A U P法 を 用 い て タ ン パ ク 質 単 結 晶 の α- h e l i xに 関 連 す る 光 学 活 性 を 測 定 す る た め の 問 題 点 と 課 題 を ま と め て い る 。