肝 け 細胆管 増 生 細胞増生 神経支配

金 沢大 学 十 全 医 学 会 雑 誌 第^{1 0 5}巻 第2 号 3 6 3 ^‑3 8 1(1 9 9 6)

ラ ッ ト肝^にお け^る細 胆管増生^{お よ びオ バ ー ル} 細 胞増 生^と神経 支 配

一 病^理阻 織 学 的^, 免 疫 阻 織 化 学 的 検討 ^‑

金 沢大 学 医学 部 医 学科 外 科 学 第^一講 座 (主任^:渡辺 洋字 数授) 金 沢大 学 医学 部 医 学 科病 理 学 第^二講座 (主任^: 中沼 安^二教授)

小 泉 博 志

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小 型 胆 管^の増 生は各 種 肝胆道 糸疾 患^で生 ず^{る が}, その発 生機 序^や増 殖機 転^に関して不明な点が多^い･ ま た, これ ら^の小 型 胆管 増 生^に果^たす 局所^の微 小 環軋 掛^こ神 経^の果たす役 割 も 全く 知られ^{て い}な^い･ 今 臥 ^{こ の}小型 胆 管^上皮^の増 殖性 病 変^の 病 的意 義を細 胆 管 増 生と オ^{パ ー ル}細 胞 増 生^{の ラ ット モ}デ^ルを用^い主^に病 理 魁 織 胤 細 胞 動 態^{お よ び}神 経 分 布を中 心^に検 討^し た. 細 胆 管 増 生^モデルは総 胆 管 結 集^{ラッ ト}を作 成^し, オ バ ^ー ル細 胞 増 生^{は 3}‑^{' メ チ ルー4 ジ}メ チ ル ア ミ ノ アゾ^{ベ ン ゼ ソ} (3T^{･ m eth}yl ヰ dir n ethyla min o a z obe n z e n e,3^,‑M D A B) ^の投与^によ り作 成し た^･ 総 胆管 結 染 群^{お よ び 3}‑^{'M D A B} 群^{で ほ･ 7 日 日 よ り}

細胆 管^{お よ び オバ ー ル}細 胞^の増生が門脈 城 辺 鹿 部^に出現^し･ 以後^{これ らの}増 生域は徐^{々 に}拡 大し, 1 4 日目以 降は拡 大^{し た}門脈 域を架 橋 す^{る よ}う^に増 生 域^の拡 大が み られた^･ そ し て, 4 2 日 冒^には, いずれ^{の モ}デ^ルでもこれ らの病変^のた め肝 実質が分 断さ れ 肝 硬変 様^の形 態を示した^. 細 胞 動 態^を好銀 性 核 小 体 形成 体^の凱 5 ブ^{ロ モー}2^,デ オ キ^シウ リ ジ^ン標識 率, 増 殖細胞 核 抗原^ラベ リソ ダ イソデッ ク スを用^いて検 討した^. その結 軋 増 生細 胞 管と オ^{パ ー ル}細 胞^で, いずれ^の指 標 も7 日 目 で最高 値を と り以後 経 過と ともに漸 減^{した が},各 指 標^ほ対 照 群^{よ り}も高 値を示した^･ ま た･3‑^{,M D A B 投与 群の方が総 胆管 結 染 群よ りも 各 指 数は持} 続 的^に高 値を示し た^. 次に, 免 疫 染 色^で神 経 線 推 分布^を検討^{した･ プロテイ ンジ ー ン プロ ダクト 9･5} (pr otein ge n e pr odu ct 9.5,P G P 9.5) 陽性 神 経 線 維^{お よ びニ ュ ー ロペ プタイ ド Y}(^{n e u r o}p^ep tide Y･ N P Y) 陽性 神経 線 維^は･ 対 照 群^では, 門脈 域^の結 合 組織, 門 脈 壁, 肝 動脈 壁^, お よ び胆 管壁 近 傍^{にみ ら}れた が, 総阻管 結 集 群^では･ 経 過と とも^{に こ}れ ら^の陽性 神 経 線維^の減 少 が み ら れ, 42 日目^には肝 内^の大 型 門脈 域^のみに染 色さ れ た^･ し か し, 3^㌧M D A B 投 与 群^では∫P G P 9^･5 お よ び N P Y 陽 性神 経 線 推^の減 少, 消 失な ど^の変化^{は み ら れ}ず, 4 2 日 目 に は オ^{パ ー ル}細 胞 増 生 域^{に, P G P 9■5} 陽 性神 経 線 椎^の分布が み られ た^{･ 一} 九

ニ _ュ ^ー∴ロ こ/ ス ペシ フ_ィ ック^ユ ノ ラ ^ー ゼ(n e u r o n spe cific e n ola s e, N S E) 陽 性神 経 線 維は, 対 照群^では･ 門脈 域^の脈管 周 囲^の結合

織 内^にみ ら れ た が, 総 胆 管 結 架 群^{や 3･一M D A B} 投 与 群^では′ 2 8 日 目以 降^に細 胆 管増 生 域^{やオ バ p ル}細 胞 増 生 域^に N S E 陽 性神 経線 維^の新 生が み ら れ た^. S‑^{1 0 0 陽性 神経 線 維ほ, 対照 群で は, 肝 内大 型 胆 管, 隔壁 阻管レ ベル の門脈 域にみ ら れ た･ 総 胆 管 結} 染 群^{で は}, 経 過^{と と}も^に S‑^{1 0 0 陽性 神 経 線 維は}減 少^し, 消 失^{し た･ 3}‑^{,M D A B 投与 群でを}耳^･ 門脈 域 内で ほ S‑^{1 0 0 陽 性 神経 線 維}

の減 少, 消 失な ど^の変 化ほ み ら れ な か ^った･ サブス タン ス P (s ubsta n c e P,S P) 陽性 神 経線 維^ほ′ 対 照 群で ほ･ 門脈 域^の脈 管 周 囲の結 合織に み ら れ た^. 総胆管 結 染 群^{, 3,‑M D A B} 投 与 群^では, S P 陽性 神経 線 維^の経時 的な変 化は み ら れ な か ^った･ 電 顕的

にほ細 胆 管増 生 巣^{お よ び オバ ーリ レ}細 胞 増 生 巣^の細胞 間^にほ 7 日 目^〜4 2 日 目におい て無髄 神 経線 維が認め られ た^■ 以 上^の結 果^よ り, ラ ット の総胆 管結 梨 群お よ び 3^,‑M D A B 投 与 群^では小 型^〜大 型^の門脈 域^{で の}神 経 線維^の分布^や抗 原性^に変 化 あるいは特異 な抗原 性^を持^つ神 経線 維^に変 動があり, さ らに細 胆 管増 生 域^{お よ び オバ ー ル}細 胞増 生 域^でも, その細 胞 動 態^の変 動^{お よ び}経過

に関 連して支 配 神 経 線 軋 特^にそ^の抗 原 性^の発 現^に変 化が み ら れ た^{･ こ}れ ら^の所 見^は, これ ら小 型胆管 病 変 部^の微 小 環境^の形 成に神経 支 配が何ら か^の関与を し ている^こと を 示す も^のと考^{え ら れ る･} 今回^の研 究^によ り･ 今 後1 胆 管上皮^の病 態^や肝胆道 糸

疾患^の発 生進 展 機 序^の解 明^に, 肝 内局 所^の神 経線 維お よ び神 経 分 布を考 慮す^る必 要^がある と考え ら れ た^･

K ey ^{w o r}ds bile d^uctula r p^rolife ratio n, 0 Val c ell,in n e r vatio n, 3^,‑m eth_yl^‑4‑^{dim eth}yla minoazobe n^‑ z ene, bile du ct li_gatio n

肝 内 小型 胆 管, 特^に細 胆 管^の増 生はl ヒ ト の種^々の肝 胆道 糸 疾患で非特 異 的^に認^{め られ る. その}由 来, 増 殖^の機 序, 細胞 動 態お よ び病理学 的 意 義に関し^て , 従 来 多 く^の研究 報 告^{が な さ れ}

て いる^{l 卜 明.} ヒ トで は, これら^の増 生 細 胞 管ほ そ^の形態と形 質像

か ら既 存^の胆管上皮^の増 生^{によ る}ものと小 葉 辺 綾 部肝 細 胞^{の メ}

タブラジア によ るも^のがあ^{る と}考え ら れ て^いる^{1 0).} ま た Rubiⁿ ば⁾, 胆 管 結 如^こよって起^こる胆管 増 生^は, 胆 管 細 胞^と肝 細 胞 を渡合 する^{ヘ リン}グ管^に由 来するので ほ なくト胆 管上皮^の増生

の結 果 生ずる と報 告し て^いる^. 3^‑‑メ チ ルー^{4 ジ}メ チ ル ア ミ ノ アゾ

ベ ン ゼ ソ (^{3,‑m eth}yl ヰd im ethyla min Q a Z Obe n z e n e, 3^'‑M D A B)･

平 成⁸ 年² 月27 日受付, 平 成⁸ 年³ 月^{1 9 日}受 理

A b br e viatio n s : A B C, a Vidin^‑biotin^‑p^{e r O X}id^{a s e c o m}ple x ; A F P, al_pha^Mfetop^{r o}tein; A_gN O R^s, a rg y^{r O}philic p^{r o}tein s of the n u cle ola r o rg^{a n}iz er r egi^{o n}; Brd U, 5^‑br o m o^‑de o xy^{u r}idine; D A B ･ dia my^{n o}be n zidin e tetrahydr o chlo ride ; 3^,‑M D A B, 3^,‑m eth_yl^p4^‑dim eth_ylami n o a z ob^{e n z}ene ; N P Y, neur Op^ep tide Y _; N S E, n e utOn

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1 サ フ チ ルイソ チオシ アネ ^ー ト な ど^の肝 発 癌 物 質 投 与^によって 出 現 する オ^{パ ー ル}細 胞^ほそ^の細胞 性 状^ほ細 胞管^に塀 似 す^{る と さ}

れてお り^{11 ト 1 3)}, 細 胆 管 増 生と同様に そ^の発 生^の由 来, 増 殖^の幾

序, 細胞 動 態お よ び病 理 学 的 意義^にほ細 胆 管増 生^と同様^不明^な 部 分が多く 残さ れ て^いる^. ま た, 細 胆 管 増 生と オ^{パ ー ル}細 胞 増 生^の病 態^の違^いに関^{し て}も不明^な点^が多 く 残^されて^いる^.

さて最 近, 肝, 胆 道 系^に分 布 する神 経^の生理的役 割^が注 目^さ れ て お り, 肝 内微 小 循 環^の調 節や胆 汁 分 泌な ど^に深 く 関与して

いる1 4 ト 2 5 )

. さ ら に肝 胆 道 糸疾 患^そのも^{の の}病 態^と神 経 支 配^の関 連 性 も 注 目されてお り, 特^に, 神経 線 維や その分泌 物が増 殖 性 変 化^や炎 症^に深 く 関係^{していること か ら2 6 ), これ らの}神 経 支 配 と肝 胆 道 疾患^の発 生と^の関 連 性ま た肝 切 除 後^の肝細 胞^の再 生^に 果 す 役 割 も 最近, 注 目さ れ て^いる^{叩 ).} ま た, 最 近^の免 疫鼠 織化 学 的手 法^の発 達に よ り, 神 経 線 推^の分 布^と抗 原 性^の変 化^が光学 頗 徴 鏡 的, 電 子顕 徽 鏡 的^に認 識できる ようにな り, 各 種肝 疾患 での神 経^の分 布^と病態 形成^との関 連 性が研 究さ れ て^い る^{2 8 )2 g )}

し か し, 現 在まで の研 究で, 細 胞 管や^{オ パ ー ル}細 胞な ど^の肝 内 小型 胆 管上皮^の増 殖 性 病変と神 経 支 配と^の関 連 性^につ いて は,

ほ と ん ど鮮明さ れ ていな^い.

そ^こで今回, 総 胆 管 結 梨^ラッ ト で細 胞 管増 生を作 成し, ま た 3‑^{'M D A B 投 与に よ り オパ ー ル細 胞増 生を作 成し, これ ら 2 つ}

の実験^モデ^ルを用^い病理組 織学 的き 免 疫 魁織 化 学 的^{お よ び}電 子 顕 微鏡 学 的検 討を行^い, 細 胆管 増 生と オ^{パ ー ル}細 胞 増 生^の病理 形 態l 細 胞 動 態, それ^に神 経支 配^との関 連 性^を検 索^{し た.}

対 象 お^よび 方 法

Ⅰ^. 実験 動 物

1 5 0^〜2 0 0g の雄 性Spr agu e‑^{Da wley ラッ ト(日本エ ス エ ル}

シ ^ー , 浜 松) を用^い ト以 下^の全^{て の}実 験^を行^{っ た. な お}, 実 験 開 始ま で は,

一 定^の空 調 室 内で固形 飼 料 C R F^‑1(日本^チ ャ ^ー ルズ リ^{バ ー} , 厚 木) ^を自 由摂 食^{さ せ}, 自 由飲 水 下^に飼 育し た.

Ⅰ^. 肝 内の肝 内胆 管およ び 門 脈 域の分類

肝 内胆 管を Naka n u ma ら^叩の分類を多 少 修 飾し て用^いた^. す な わ ち, ラッ トでは肝外^で総 胆 管^が左 菓, 中間 葉, 右 菓, 尾 状 菓お よ び方 形 菓 枝に分 岐し肝 内に分 布 する^. そこで総 胆 管^の第

一次 分 枝^を肝 内 大型 胆管^{と した.} 肝 内 大型 胆 管^{よ り}末 梢^{の不 明} 瞭な が らも 線 維 性^の胆管 壁^{が み ら れ}肝 実質^{か ら}離れて分 布 する 胆 管を隔 壁 胆 管と し た^. 胆 管 壁はなく 門脈 域 内^で肝 動 脈 枝^に伴 走し肝 実 質か ら離れ て分布 す^る胆 管を小葉 間 胆 管^{と し}, 肝 小 葉 辺 線 部 限 界 板^の肝細 胞と門 脈 域 内を走 行 する 胆管 壁を持た な い, 横 断 面^{で 5},6 個^の立 方 体^の胆 管^上皮^{よ り な る}胆 管^を細 胆 管と した^. ま た, 各^々の太さの胆 管を門脈 域^{のレ ベ ル の}基 準と

し て用^いた.

Ⅲ^. 実 験 方 法 1 ∴実験 群^の設 定 1) 総 胆 管 結 染 群

細 胆管増^{生モデルで}あり, 1 8匹^{の ラッ} ト を用いた^. 腹 部^を剃 毛 後, ジ^ュ チ ル^{コ⊂･‑‑}テ^ル麻 酔 下^{に･, イソジン} ( 明 治 製菓^{, 東} 京) ^で消 毒後 無 菌 的^に開 腹し た^. まず 肝 十^二指 腸 間 膜^に到 達^し そ^こで総 胆 管を同定した^. 間膜を鋭 的^に切 開し ∴総 胆 管^のみ を

約Ic m にわ た り十 分^に露 出し遊 離した^{. つ} いで下 部 総 胆 管を 5m m 以^上の間 隔^をあけ^二重 結 熱^し, その中 間^を切 離^{し た.} そ

の後, 2 層 縫 合で開 腹し手 術を終え た^. 2) 3^'‑M D A B 投与 群

オ^{パ ー} ル細 胞 増 生^{の モ}デ^{ル で}あり, 1 8匹^のラッ トを用^いた^. 固 形飼 料 C R F‑^{1 の代わ りに, 0.0 6 % 3'‑M D A B} 添 加 固 形 飼料^を 自 由摂 食^{さ せ た.}

3) 対 照 群

腹部を剃 毛 後, ジ^ュチ ル ^{エ ー} テ ル麻 酔下^に, イ ソジンで消 毒 後 無 菌 的^に開腹^{し た.} まず 肝 十^二指 腸 間膜^に到 達しそこで総 胆 管を同定し た^. 間 膜を鋭 的^に切 開し, 総 脛管^のみ を約1c m にわ た り十 分^に露 出^し遊 離^{した. その}後 直^ちに2層 縫 合^で閉腹した ものを単 開腹 手 術 群(対 應 群) ^{と し た. 1 8}匹^{の ラッ} ト を用いた^.

2 . 肝敵 織 標 本^の作 成

実 験 開始 後7 日目, 1 4 日 目, 2 1 日目, 28 日臥 35 日臥 4 2 日 目^に各 突抜 群^の 3 匹 を ジ^ュチ^{ル エ ー テ ル}麻酔 下に屠殺した^. そ の後 直ち^に4 ℃の 4 % パ ラ ホ ル ム ア ルデ^ヒド + 0^.2 % グル タ^ー ル ア ルデ^ヒド + 0^.2 % ピ クリ^ン酸 溶 液で環 流 固 定を行^い, 肝を 取^り出し た. 更に4 ℃^の4 % ^パ ラ ホ ル ム ア ルデ^ヒド + 0^.2 % ピ クリ^ン酸 溶 液^で4時 間浸 潰 固定した^. 次^{い で}, これら^の肝^{の 一} 部を型^の如く^{パ ラ}フ ィ ン包嘩し, 各ブ^ロ ック に つき1 0枚以上の 5J^Jm 切 片^を作 成^{し た.} 残^りの肝^ほ,2 0% 薫 糖 加^リン酸 緩衝 生理 食塩 水 (pho sphate^‑buffe r ed s alin e,P B S)(pH 7^.4) ^に2 日間浸透 さ せ, Op tim u m c ut ting t^{e m}p^{e r a}tu f e ^コン パ ウンド(^マイ^ルス

･ 三共,東 京) ^に包 埋 後, 液 体 窒 素^で直ち^に凍 結^{し た.} そ^の後^ク

ライオス タッ ト(^テ ィ シ ュ

ー ･ テ ッ ク_, ^マイルス ^･ 三共, 東

京) ^で各^ブロ ッ クよ り1 0枚 以^{上の 2}恥^m 凍結 切 片^を作 成^し, 使 用時ま で ^‑8 0 ℃ で保 存し た^.

3 . 組 織 学 的 検 討

各 実験 群^のパ ラ フィ ン包 唾 切 片を, 型^の如 く 脱^{パ ラ フ} ィ ン

し, そ^の後 H E 染 色, アザン染 色, 過^ヨ ウ素 酸シ ッフ法 染色 (pe riod ic a cid Sch if f,P A S) 染 色, ゴ_モリの鍍 銀 染 色^を行^い, 光

学 顕 微鏡 下^に観 察した^. 4 . 細 胞 動 態^の検 討

細 胞動 態^の検 討^のた めに_, 好 銀 性 核 小 体形 成 体 (^{a r}g y^{r o}philic p^{r o}tein s ofthe n u cle ola r o rga niz e r r egio n,AgN O Rs) 数, 5 ブ

ロモ 2^'デ^オキ^シウ リ ジン (⁵‑^{br o mo}‑^{de o xyu rid in e, Brd U) 標 識} 率, 増 殖 期 細 胞 核 抗 原 標 識 指 数 (pr oIife r ating c ell n u cl^{e a r}

a ntige nlabelinginde x,P C N A L I) ^を求^{め た. A}gN O Rs は^リボ ゾ ^{ー マ ル} D N A の ル ^ー プ を形 成し ている構 造^で∴細胞^の分裂,

増 殖^に関 与^{して いる と}考え ら れて いる^{3 1 )､3 3 )}. Brd U ほ D N A 合成 中^のS 期^の細 胞 核^に取り込ま れ る^こと が知ら れ て^いる^3佃T) P C N A は増 殖^サイク ル の主^にG l 後 期か ら S 期^にか け て細胞 核 内^に蓄 積^し, D N A ポ リメ ラ ^ー ゼ∂の補 助 因子 と し^て磯 能^して

いること が知ら れて いる^{抑〜41 )} 1) ^A gN O Rs 数

P loto n ら^{3 1)}の方 法に従^って染 色し た^. すな わ ち, 5J^Jm の パ ラ フ ィ ン切 片を塾^の如く 脱^{パ ラ フ} ィ ン後∴蒸 留 水^で十 分^に洗 浄^し た. そ^の乱 ¹g/^{d l の蟻 酸に 2g}/^{dl のゲラ チンを溶 解した溶液}

と5 0% 硝 酸 銀 水 溶 液と を 1 :2 の割 合で混合し た反 応 液 中^に切

sp^{e c}ific e n ola s e; P A S, p^{e r}iodic a cid Schiff; P B S, pho sphate^‑b uff^er ed s alin e; P C N A , P^{r O}life r ating^{c e}ll n uclea r anti_ge n; P C N A LI, P^{r O}life r ating ^cell n uclear a nti_ge n labeling inde x; P G P 9.5, anti^‑hu m a n p^{r o}tein gen e p^{r o}du ct 9^.5; S P , S ubstanc e P