目次 第 1 章序章 諸言 本研究における背景と目的 主な爆薬成分 バイオセンサ 表面プラズモン共鳴 (SPR) センサ 表面プラズモン共鳴 (Surface Plasmon Resona

表面プラズモン共鳴免疫センサによる

爆薬成分の高感度検出

2014

九州大学大学院システム情報科学府

電気電子工学専攻

矢田部 塁

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目次

第 1 章 序章 ... 1

1.1 諸言 ... 1 1.2 本研究における背景と目的 ... 2 1.3 主な爆薬成分 ... 4 1.4 バイオセンサ ... 7 1.5 表面プラズモン共鳴（SPR）センサ ... 8

1.5.1 表面プラズモン共鳴 (Surface Plasmon Resonance ; SPR) ... 8

1.5.2 SPR センサ ... 12 1.5.3 SPR センサの特徴 ... 13 1.5.4 本研究で用いた SPR センサと実験方法 ... 15 1.6 自己組織化単分子膜(SAM) ... 16 1.6.1 SAM の作製方法... 16 1.6.2 SAM の自己組織化メカニズム及び特徴 ... 17 1.7 アミンカップリング反応 ... 19 1.8 抗原抗体反応 ... 21 1.8.1 抗体 ... 21 1.8.2 抗体の作製方法 ... 24 1.9 本論文の構成 ... 26

ii

第 2 章

爆発物の検出方法 ... 27

2.1 諸言 ... 27 2.2 爆発物探知装置に求められる性能 ... 28 2.3 高感度検出についての検討 ... 29 2.3.1 測定方式 ... 29 2.3.2 間接競合法 ... 30 2.3.3 置換法 ... 36 2.3.4 タンパク質の非特異吸着 ... 38 2.3.5 測定に影響を及ぼすその他の要因 ... 40 2.4 ２章のまとめ ... 42

第 3 章

RDX の高感度検出 ... 43

3.1 諸言 ... 43 3.2 RDX 抗体の作製 ... 44 3.3 センサ表面の作製 ... 47 3.4 RDX の高感度検出 ... 49 3.5 3 章のまとめ ... 53

第 4 章 ラジカル重合によるビニル系ポリマーを用いた

TNT の高感度検出 ... 54

4.1 諸言 ... 54

iii 4.2 ポリビニルアミンの作製 ... 55 4.3 ポリビニルアミンを用いたセンサチップの作製 ... 57 4.4 ポリビニルアミン・ポリビニルホルムアミド共重合体の作製 ... 61 4.5 ポリビニルアミン・ポリビニルホルムアミド共重合体を用いた 非特異吸着性抑制 ... 65 4.6 TNT の高感度検出 ... 68 4.7 ４章のまとめ ... 70

第 5 章 表面開始原子移動ラジカル重合を用いた

センサ表面による TNT の高感度検出 ... 71

5.1 諸言 ... 71 5.2 原子移動ラジカル重合 ... 72 5.2.1 諸言 ... 72 5.2.2 特徴と反応メカニズム ... 74 5.2.3 還元剤による触媒の再活性化プロセス ... 77 5.2.4 重合反応に影響を与える要因 ... 81 5.2.5 表面開始原子移動ラジカル重合 ... 84 5.3 センサ表面の作製方法 ... 85 5.4 MES と DEAEM による混合ポリマー表面... 87 5.4.1 混合ポリマーによるセンサ表面の作製 ... 88 5.4.2 モノマー混合比と非特異吸着性評価 ... 89 5.4.3 混合 SAM による親和性制御 ... 91

iv 5.4.4 TNT の高感度検出 ... 95 5.4.5 まとめ ... 98 5.5 MES と HEMA による混合ポリマー表面 ... 99 5.5.1 混合ポリマーによるセンサ表面の作製 ... 101 5.5.2 モノマー混合比と非特異吸着性評価 ... 102 5.5.3 モノマー混合比による親和性制御 ... 103 5.5.4 TNT の高感度検出 ... 105 5.5.5 まとめ ... 110 5.6 ５章のまとめ ... 111

第 6 章

本論文のまとめ ... 113

6.1 本研究の総括 ... 113 6.2 今後の課題と展望 ... 117

謝辞 ... 121

参考文献 ... 122

v

表目次

表 1-1 主な爆薬成分 ... 6 表 2-1 間接競合法の定式化に用いたパラメータ ... 33 表 3-1 各種物質と RDX 抗体との結合能力 ... 46 表 3-2 各センサチップの非特異吸着評価 ... 50 表 3-3 間接競合法の測定条件と検出限界 ... 50 表 5-1 MES:DEAEM モル比最適化 ... 91 表 5-2 混合 SAM による poly-MES-co-DEAEM 表面の抗体結合量... 93 表 5-3 混合 SAM ポリマー表面と抗体の親和性 ... 94 表 5-4 センサ表面毎の検出限界 ... 96 表 5-5 poly-MES-co-HEMA 表面の ATRP 反応条件... 101 表 5-6 混合ポリマーの混合比と親和性 ... 104 表 5-7 混合ポリマー表面の検出限界 ... 108

vi

図目次

図 1-1 RDX および TNT の化学構造 ... 5 図 1-2 空気と金属表面の分散関係 ... 10 図 1-3 クレッチマン配置 ... 11 図 1-4 クレッチマン配置での金属表面の分散関係 ... 11 図 1-5 入射角度と反射光強度 ... 12 図 1-6 SPR センサの光学系とフローセルの断面図 ... 14 図 1-7 GE Healthcare 製 Biacore J の構成... 15 図 1-8 Au 表面へのアルカンチオール SAM の吸着サイトと断面図 ... 17 図 1-9 表面への機能性官能基の導入 ... 18 図 1-10 アミンカップリングのメカニズム ... 20 図 1-11 IgG 抗体の構造 ... 23 図 1-12 抗体の親和性 ... 23 図 2-1 間接競合法のセンサグラムと実験の様子 ... 31 図 2-2 抗体と類似物質の親和性と結合率の関係 ... 35 図 2-3 抗体濃度と結合率の関係 ... 35 図 2-4 置換法のセンサグラム ... 37 図 3-1 RDX およびその類似物質の構造 ... 45 図 3-2 RDX の検出のためのセンサ表面の作製 ... 48 図 3-3 間接競合法による RDX の検出実験のセンサグラム ... 51 図 3-4 RDX 濃度とセンサ出力の検量線 ... 52 図 4-1 ポリビニルアミンの作製ステップ ... 56

vii 図 4-2 VA-044... 56 図 4-3 ポリビニルアミンを用いたポリマー表面の作製工程... 59 図 4-4 poly-VAm 表面と EDA 表面の SPR センサグラム ... 59 図 4-5 poly-VAm 表面への TNT 抗体・ビオチン抗体吸着量 ... 60 図 4-6 poly-VAm 表面の非特異吸着性評価 ... 60 図 4-7 各加水分解条件における FTIR スペクトルデータ ... 63 図 4-8 50℃における加水分解時間と加水分解率 ... 63 図 4-9 加水分解率とゼータ電位の関係 ... 64 図 4-10 TNT 抗体とビオチン抗体の吸着量比較 ... 67 図 4-11 TNT 抗体とビオチン抗体の吸着量の比率 ... 68 図 4-12 間接競合法による TNT 濃度と結合率の検量線 ... 69 図 5-1 ATRP 反応の反応式 ... 75 図 5-2 ATRP 反応状態遷移図 ... 76 図 5-3 AGET-ATRP 反応状態遷移図 ... 79 図 5-4 アスコルビン酸による還元作用 ... 79 図 5-5 触媒と還元剤の比を変化させた時の重合反応 ... 80 図 5-6 有機分子の構造と反応定数 KATRPの大小関係（計算） ... 82 図 5-7 配位子の構造と反応定数 KATRP[ M-1s-1 ] ... 83 図 5-8 SI-(AGET)ATRP を用いた SPR センサチップの作製手順 ... 86 図 5-9 センサ表面の作製に用いたモノマーの構造 ... 87 図 5-10 poly-MES-co-DEAEM 表面の非特異吸着評価 ... 90 図 5-11 DTBU と HEg3UT の構造 ... 93 図 5-12 混合 SAM ポリマー表面と抗体の解離速度定数と検出限界... 96 図 5-13 各 TNT 濃度における抗体結合率の検量線 ... 97

viii 図 5-14 センサ表面の作製に用いたモノマーの構造 ... 100 図 5-15 poly-MES-co-HEMA ポリマー表面の非特異吸着評価 ... 103 図 5-16 poly-MES-co-HEMA センサ表面での間接競合法のセンサグラム例 ... 106 図 5-17 一価結合, 二価結合の模式図（仮説） ... 106 図 5-18 モノマー組成と解離速度定数及び検出限界 ... 109 図 5-19 MES:HEMA=1:100, 1:1000 の検量線 ... 109 図 6-1 抗原応答性ポリマー表面 ... 120

第１章 序章 - 1 -

第

1章 序章

1.1 諸言

近年, 爆発物の脅威が増している. 特に 2001 年 9 月 11 日のアメリカ同時多 発テロ以降, 世界では爆弾を使用したテロ事件が頻発し多くの人々が犠牲にな っている. このような事件では空港や駅, ショッピングモールなどの人が集ま る場所に爆弾が仕掛けられる. この様な事件を防ぐために数多くの監視カメラ 等が設置されている. しかし事件後の真相究明には役立っているが予防には必 ずしも効果的ではない. この様な問題を解決するためには爆発物の匂いを簡単 かつ高精度に検出できる装置が必要となる. そのような装置が監視カメラの様 に多数設置されれば爆発物の運搬を検出できるため爆発物を使用した犯罪行為 を予防できると考えられる. その様な装置を開発する上で本研究では表面プラ ズモン共鳴と抗原抗体反応という二つの原理を組み合わせた表面プラズモン共 鳴免疫センサに注目し, そのセンサ表面の研究開発を行った.

第１章 序章 - 2 -

1.2 本研究における背景と目的

目標とする爆発物検出装置に求められる性能には第一に高感度・高信頼性 がある. 爆発物の様な低分子量有機物質の測定方法として一般的に用いられる のはガスクロマトグラフィ質量分析装置（GC-MS）や高速液体クロマトグラフ ィー（HPLC）などがあげられる. これらの分析は適切な装置と手順を用いて熟 練者が行えば高感度・高信頼性を実現できるが, 測定には時間がかかる. また測 定による得られるデータが複雑なためにその解釈に熟練を要する. その他には ニトロ化合物や硝酸エステルなどの爆薬分子は電子親和力が高いことを利用し てイオン化した上でイオンモビリティ検出器(IMS)や質量分析器(MS)で検出す る方法もある 1)_{. またこの爆発物検出装置は空港や商業施設, イベント会場など} での使用が想定されるため, 求められる性能として低コスト・可搬性・測定の簡 便性などもある. これらを総合して鑑みると爆発物探知犬を用いる方法が現在 では合理的であるといえる. その為, 爆発物探知犬の機能を代替する装置が開 発できれば実用に足りる爆発物検出装置が開発できると考えられる. これらの性能を満たすべく我々は表面プラズモン共鳴という現象を用いた表 面プラズモン共鳴センサ（SPR センサ）と抗原抗体反応に注目した. この SPR センサではセンサ表面の屈折率変化を高感度に検出できる. このためセンサ表 面でなんらかの物質の吸着などの物理的・化学的な変化が起こるとそれに伴う 表面の屈折率変化を SPR センサでは検出できる. 屈折率変化を測定しているに 過ぎないのでセンサ応答としては単純なデータが得られるが, その一方で吸着 している物質の種類やなぜその屈折率変化が起こっているのかをSPR センサ単 体で解明することはできない. そこで生物が持つ異物認識機能である抗原抗体 反応と組み合わせる. 抗原抗体反応を担う抗体は特定の物質を認識する選択性

第１章 序章 - 3 - に優れるため, その原理を用いれば信頼性の高い測定が可能となる. 一般に抗 原抗体反応を利用して特定の物質の検出を行う場合, 抗体に蛍光体などの標識 を行う必要がある. しかし SPR センサと組み合わせることでその様な操作も不 要となる. そしてセンサ表面に抗原抗体反応を起こす様な仕組みを作ることで 抗原抗体反応を屈折率変化として高感度に検出可能なセンサを作ることが出来 る. この SPR 免疫センサを用いれば高感度・高信頼性・測定が簡便・装置が低 コストという特徴をもつセンサを開発できると考えられる. 我々の研究室ではこのSPR 免疫センサを用いて様々な物質の高感度検出を 行っている. 爆発物に関しても TNP, TNT, DNP, RDX などの複数種類の検出を 行っている 2-10)_{. また装置を試作し拭き取りによって TNT を回収し 1 分以内に} 検出可能であることを実証している11)_. 本研究においては主に高感度化を目標にセンサ表面の開発を行った. 高感 度な測定が可能になることでセンサとして高度化するだけでなく, 測定時間の 短縮にもつながる. 本研究ではポリマー表面を用いてセンサの高感度化を目指 した. 我々の従来のセンサでは抗原抗体反応を起こすサイトをセンサ表面上に 二次元的に配置してきた. 一方, SPR センサが利用する表面プラズモン共鳴に よる共鳴電場は表面から指数関数的に減少しながら約100nm の範囲に広がって おり, SPR センサではこの範囲の屈折率変化を検出することが出来る. そのた め抗原抗体反応の反応場を三次元的に配置できれば反応場の増加により信号の 増強が可能となると考えられる. 本研究ではポリマー上に抗原抗体反応の反応 場を固定することでこの三次元化を試みた.

第１章 序章 - 4 -

1.3 主な爆薬成分

爆薬は軍用のほか鉱山や工事現場などでも用いられている. その一覧を表 1-1 に示す 12)_{. この様に爆薬は分子内に硝酸塩, 硝酸エステル結合, ニトロ基,} ニトラミン類などを持つ物が多い. 特に芳香族ニトロ化合物は軍用爆薬として 用いられる. 本研究ではその中で RDX と TNT の検出を行う. 以下にその物性を 示す. ●TNT ; 2,4,6-trinitrotoluene ・分子量：227 ・結晶 ：淡黄色柱状昌 ・融点 ：80.7℃ ・溶解度：130 g/ml (水 20℃) 12.3mg/ml (95% エタノール 20℃) ベンゼン, エーテルに易溶

●RDX ; research department explosive

(1,3,5-trinitroperhydro- 1,3,5-triazine) ・分子量：222

・結晶 ：無色結晶 ・融点 ：205.5℃

第１章 序章

- 5 -

TNT ; 2,4,6-trinitrotoluene

RDX ; research department explosive (1,3,5-trinitroperhydro- 1,3,5-triazine)

第１章 序章 - 6 - 表 1-1 主な爆薬成分12) 化合物の種類 化合物名 略号 含有する主な爆薬名 硝酸エステル ニトログリコール EGDN ダイナマイト 液体爆薬 ニトログリセリン NG ダイナマイト 無煙火薬 液体爆薬 ペンスリット PETN プラスチック爆薬 ニトロセルロース NC ダイナマイト 無煙火薬 硝酸塩 硝酸アンモニウム AN 硝安油剤爆薬 含水爆薬 硝酸カリウム 黒色火薬, 玩具煙火 硝酸ナトリウム 含水爆薬 硝酸尿素 UN 手製爆薬 塩素酸塩 塩素酸カリウム 黒色火薬, 玩具煙火 塩素酸ナトリウム 手製爆薬 過塩素酸塩 過塩素酸カリウム 黒色火薬, 玩具煙火 過塩素酸アンモニウム AP ロケット推進薬 ニトロ化合物 ジニトロトルエン DNT ダイナマイト 2,4-ジニトロフェノール 2,4-DN Ph 爆薬原料 トリニトロトルエン TNT 軍用爆薬 テトリル Tetryl 軍用爆薬 ピクリン酸 PA 軍用爆薬 ニトロメタン NM 液体爆薬 ニトラミン ヘキソーゲン RDX プラスチック爆薬 オクトーゲン HMX プラスチック爆薬 探知剤 2,3-ジメチル-2,3-ジニトロ ブタン DMNB プラスチック爆薬 可燃物 硫黄 S 黒色火薬, 玩具煙火 有機過酸化物 トリアセトントリパーオキ サイド TATP 手製爆薬 ヘキサメチレントリパーオ キサイドジアミン HMTD 手製爆薬

第１章 序章 - 7 -

1.4 バイオセンサ

生物起源の分子認識機構を利用したセンサで酵素や特定の受容体タンパク質 を用いたものや免疫システムや微生物を用いたものもある. これらは特定の分 子や構造に対して選択的な親和性を持っており目的物質と相互作用することで 構造が変化したり化学的なポテンシャルが変化したりする. 良く用いられてい るELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) では蛍光体や酵素または 放射性同位体で標識された抗体を使用して目的物質の定量を行う. 標識された 抗体が目的物質と相互作用を行い, 抗体の標識物質を発色や発光, 放射線を測 定にて定量することで目的物質の定量を行っている. 一方でこの様な抗体の標 識 を 必 要 と し な い 方 法 と し て SPR (Surface Plasmon Resonance) 法 や QCM(Quartz Crystal Microbalance)法がある. SPR 法においてはセンサ表面へ の物質の吸着に伴う表面の屈折率変化を共鳴角変化として出力し, QCM 法にお いては水晶振動子電極表面での質量変化を共振周波数変化として出力している. 本研究においては抗原抗体反応を SPR センサで検出した. この時用いる抗体 は目標物質の構造を認識できるため高い選択性を持っているだけでなく高い親 和性も有しており, これにより高感度測定も可能となる. これらの反応を高感 度な屈折率計であるSPR センサによって検出を行う. SPR センサの詳しい原理 について次に述べる.

第１章 序章

- 8 -

1.5 表面プラズモン共鳴（SPR）センサ

1.5.1 表面プラズモン共鳴 (Surface Plasmon Resonance ; SPR)

13)

プラズマとは荷電粒子が雲のように分布し自由に動き回ることが出来る状態 を指す. 一般的には気体が電離した状態を指し, 太陽の様な恒星や雷の様なも のから蛍光灯の様な放電管の内部もプラズマとなっている. 一方で金属では自 由電子が存在し内部を自由に動くことが出来るため, 金属での自由電子も一種 のプラズマといえる. この自由電子は瞬間的にみると密度が高い部分と低い部 分が存在し, それぞれが負と正に帯電するため疎密波として振動している. こ の様な電子の集団での疎密波を量子化する場合, これをプラズモンと呼ぶ. こ の疎密波は縦波であるため横波である電磁波とは電場の向きが異なり結合しな い. しかし金属の表面では状況が異なる. 真空中に金属の表面がある場合を考 える. この場合, 電子の疎密波によって真空中にそれに応じた電磁波が染み出 ることになる. この様にプラズモンの伝番に付随して表面に電磁波が現れる時, これを表面プラズモン・ポラリトンと呼ぶ. 一般にはポラリトンは省略され表面 プラズモンと呼ぶ. この表面プラズモンは常に電磁波（光）を伴うがこの電磁波 は遠方へは伝番されないため, 目では観察されない. 表面プラズモンは横波であるため外部からの電磁波と結合可能であるが, 通 常の光とは結合しない. 表面プラズモンがフォトンと結合するためにはエネル ギーが一致するだけでなく運動量も一致している必要がある. これは波に置き 換えると振動数と波数で, これらの関係を分散関係と呼ぶ. 真空中での金属表 面におけるフォトンと表面プラズモンの分散関係を図 1-2 に示す. 光の振動数

第１章 序章 - 9 - を, 波長をλ, 角振動数を, 波数を k, 光の速度を c とすると, 真空中の光の 分散関係は次の式になる.

𝑐 = 𝜈𝜆 =

𝜔 𝑘

𝜆 =

𝜔 2𝜋

, 𝜈 =

2𝜋 𝑘 (1.1) この式よりとk の関係は係数が光速 c の比例関係となるので図 1-2 の分散関係 は直線となる. 一方で表面プラズモンの分散関係は次の式になる.

k =

𝜔 𝑐

√

𝜀_𝑚(𝜔)・𝜀_𝑠(𝜔) 𝜀𝑚(𝜔) + 𝜀𝑠(𝜔) (1.2) εmは金属の誘電率でεsは金属の接している物質の誘電率となり, 真空の場合 はεs=1 となる. この様に二つの分散関係は=k=0 以外で交わることはなく, 表 面プラズモンの分散関係は光の分散関係の右側に現れる. その為, 通常の光と 表面プラズモンは共鳴しない. 次に屈折率 n のプリズムを使用して図 1-3 の様な 光学系の場合を考える. その時の分散関係を図 1-4 に示す. 金属に接している物 質の誘電率はプリズムの誘電率になるため光の分散関係は傾きが c/n となり表 面プラズモンの分散関係も右側に傾くが, それでも両者が交わることはない. 一方で臨界角以上の角度でプリズム側から金薄膜に光を入射するとプリズム・ 金薄膜界面で全反射が起きる. この時, 入射側の反対側にエバネッセント場が 形成される. このエバネッセント場による光は図の縦方向には伝搬することな く, その電界強度は距離に対して指数関数的に減衰し, 目では観察することは できない. このエバネッセント場の分散関係は図 1-4 の通りで通常の光の分散 関係に対して右側に位置し, 表面プラズモンの分散関係と交わる点を持つ. よ ってエバネッセント場を利用することで表面プラズモンが励起可能となる. こ の時エバネッセント場に影響を与えるのは p 偏向（TM 波）のみで共鳴が起き

第１章 序章 - 10 - ているときの波数と角振動数をksp, ωspとすると次の式になる.

𝑘

_𝑠𝑝

=

𝜔𝑠𝑝 𝑐

𝑛

・

𝑠𝑖𝑛𝜃

(1.3) このように臨界角以上で入射光の入射角度θを変化させることでエバネッセン ト波の分散関係を表面プラズモンの分散関係と一致させて表面プラズモン共鳴 を起こすことが出来る. 図 1-2 空気と金属表面の分散関係

波数

k



角

振

動

数

光の分散関係

（傾き：c）

表面プラズモンの

分散関係

第１章 序章 - 11 - 図 1-3 クレッチマン配置 青線：空気・金属界面の分散関係 赤線：プリズム・金属界面の分散関係 図 1-4 クレッチマン配置での金属表面の分散関係

入射光

反射光

θ

エバネッセント場

表面プラズモンによる電場

プリズム

金薄膜

(40～50nm）

波数

k



角

振

動

数

表面プラズモンの

分散関係

光の分散関係

（傾き：

c/n）

エバネッセント波の分散関係

k

_sp



_sp

光の分散関係

（傾き：c）

第１章 序章 - 12 -

1.5.2 SPR センサ

高屈折率なプリズムを介して金薄膜上に臨界角以上の角度で光を入射すると 薄膜・プリズム界面で全反射が起きる. そのため反射光を測定すると強い光強度 が得られる. 一方で入射角度を変化させ表面プラズモン共鳴の条件が整うと入 射光のエネルギーは表面プラズモンの励起に使用され, 反射光強度は弱くなる. そのため入射角と反射光強度の関係は図 1-5 のようになる. 表面プラズモンの 分散関係は式(1.2)からわかるように金属とその表面の誘電率に依存している. SPR センサで測定を行う際, 金属自体の誘電率は測定中に変化することはない ため一定と考えると, 表面プラズモンの分散関係を決定づけているのは表面の 誘電率となる. この表面の誘電率変化の影響を受ける表面プラズモンの分散関 係に対して入射光の角度を変化させてエバネッセント波の分散関係を一致させ ると共鳴させることが出来る. この時の角度を共鳴角と呼ぶ. この共鳴角の変 化はすなわちセンサ表面の誘電率の変化と等しくなる. この共鳴角を高精度に 求めることが出来れば表面の誘電率変化を高感度に検出できる. 図 1-5 入射角度と反射光強度

入射角度[ °]

反

射

光

強

度

共鳴角

第１章 序章 - 13 -

1.5.3 SPR センサの特徴

SPR センサでは何らかの方法で共鳴角を測定する必要があるが, 一般的に行 われているのはクレッチマン配置の光学系で, 入射光を楔状にして反射光を映 像素子で検出する方法である. その概略を図 1-6 に示す. 入射光を楔状にするこ とで入射角度が連続的に変化する様々な光線を同時に入射でき, 反射光を映像 素子で観察すると共鳴角にあたる光線は吸収されるため画像の特定の場所に暗 線が現れる. この暗線が現れる場所を画像処理で求める事で共鳴角を測定でき る. この様に共鳴角を画像として測定できるためリアルタイム測定が可能にな る. この表面の誘電率変化を高感度にリアルタイムで測定できる特徴を生かし て物質の表面への吸着などをリアルタイムに測定できる. このためタンパク質 間の相互作用や生物由来物質を用いた測定などにも用いられる. 一般にこれら の物質を測定する場合は蛍光体や放射線マーカーなどを用いて物質に標識を行 い, この標識を手掛かりに測定を行う. しかし SPR センサの場合は相互作用を する物質の一方をセンサ表面に固定することでもう一方との相互作用（吸着） を直接検出可能であるため, 標識が必要とならない. また測定が行われるのは センサ表面の極近傍の領域の誘電率変化であるため, 測定に必要な検体の絶対 量も微量で済む. これは非常に高価で大量に準備できない場合も多い生物由来 物質の測定においては利点であることが多い. これらの特徴から表面プラズモ ン共鳴自体は極めて物理的な現象であるにもかかわらずSPR センサは生化学の 分野で多く用いられる.

第１章 序章 - 14 - 図 1-6 SPR センサの光学系とフローセルの断面図 入射光 反射光 プリズム 金薄膜 (40～50nm） 点光源 SPRの吸収 による暗線 フローセル

第１章 序章 - 15 -

1.5.4 本研究で用いた SPR センサと実験方法

本研究においては GE ヘルスケア製 BiacoreJ を用いた. その構成を図 1-7 に示す. この装置はクレッチマン配置の光学系を持ち測定を行うセンサ表面上 はフローセルになっており, 溶液をその流路に流通させることで測定を行う. フローセルのサイズはL:2.4mm, W:0.5mm, H:0.1mm である. また共鳴角測定 の分解能は 10-4_{°であり, これはタンパク質の吸着量に換算すると 1pg/cm}2_の 吸着量にあたる14)_. フローセルでの実験にはランニングバッファとして HBS-T 溶液を用いた. HBS-T 溶液は 10 mM HEPES(2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethane sulfonic acid), 150 mM NaCl, 0.005vol% Tween 20 の混合溶液で pH=7.4 であ った. 測定は 25℃で行われた. 流速は 10l/min または 30l/min が用いられた.

第１章 序章

- 16 -

1.6 自己組織化単分子膜(SAM)

15,16)

自己組織化単分子膜(self-assembled monolayer; SAM)とは金属基板やシリ

コン基板などを溶液に浸漬することでその表面上に形成される単分子膜である. 本研究においては金属（金）基板をチオールまたはジスルフィド化合物の溶液 に浸漬することで金属・チオール結合を用いて自動的に表面に形成されるもの を指す. この単分子膜は配向性が高く, また金属・チオール結合の強さも静電相 互作用と共有結合の中間程度と比較的安定であるため, バイオセンサの表面修 飾技術として良く用いられる.

1.6.1 SAM の作製方法

SAM を作製するには基板となる金属またはその薄膜が付いた基板を洗浄し 表面の有機物の汚染を取り除く. 次にチオールまたはジスルフィドを持つ化合 物のエタノール溶液（濃度 1 mM 程度）に基板を浸漬する. するとチオール・ 金属結合を介して表面の金属元素と結合する. この反応は速く最初の数秒から 数分で金属の表面はほとんど覆われるが, この段階では分子の配向性が低く, 膜として安定ではない. その後, 約 24 時間程度で分子の配向性が高く緻密な単 分子膜が形成される. 反応は室温付近で行われることが多い. この様な膜の分 子は金表面で（√3 × √3 ）R30°構造をしており, その構造を図 1-8 に示す通 り表面に対して垂直から約30°傾いて形成されている.

第１章 序章 - 17 - 図 1-8 Au 表面へのアルカンチオール SAM の吸着サイトと断面図

1.6.2 SAM の自己組織化メカニズム及び特徴

SAM が自己組織化されるメカニズムのドライビングフォースは複数存在す る. 第一は硫黄と金属間の親和性である. 硫黄・金属の相互作用は約 45kcal/mol で, 準共有結合レベルの安定な結合が形成される（炭素・炭素間の強さは約 83kcal/mol）. 次に重要なものは SAM の分子のアルキル鎖同士に働くファンデ ルワールス力による疎水性相互作用である. この相互作用は分子を表面から垂 直に対して傾けることで表面エネルギーを最小化させることができる. またこ の相互作用はアルキル鎖がある程度長い場合に現れ, 一般に炭素鎖が 10 以上で この相互作用が顕著になる. またこの効果のため複数種類の SAM 試薬を混合し て SAM を形成した場合, アルキル鎖が長い方の分子が優先的に吸着し, 試薬の 混合比とSAM 中の化合物の混合比は同じにならない. これらの事を勘案すると Au S 30°

第１章 序章 - 18 - 炭素鎖が10 以上のアルカンチオール（またはビスアルカンジスルフィド）化合 物を用いることで安定なSAM を形成できる. SAM では単分子膜が表面に高い配向性で形成されることを利用して表面に 様々な機能を導入できる. これはチオール基とはアルキル鎖を介して逆側に機 能性官能基を持つアルカンチオール化合物を用いることで達成できる. この時 の模式図を図1-9 に示す. R の部分の官能基を変化させることで様々な表面を作 ることが出来る. 例えばメチル基の場合であれば疎水性の表面を作ることが出 来, ヒドロキシル基の場合であれば親水性の表面を作ることが出来る. アミノ 基やカルボキシル基を用いれば他の化合物やタンパク質などを固定できる表面 を作ることが出来る. この様に様々な官能基を末端に持つチオール化合物を用 いることで様々な機能性表面を作製することが出来る. 図 1-9 表面への機能性官能基の導入 C₁₃チオール Thiol Head Group Substrate S

R

S

R

S

R

第１章 序章 - 19 -

1.7 アミンカップリング反応

17) 本研究ではセンサ表面の作製にアミンカップリング反応を用いる. この反 応を利用すると一級のアミノ基とカルボキシル基を結合させてアミド結合を作 ることが出来る. すなわちアミノ基を持つ化合物とカルボキシル基を持つ化合 物を結合させることが出来る. 一例を挙げるならばカルボキシル基を SAM によ ってセンサ表面に導入した場合, このアミンカップリングによってアミノ基を 持つ類似物質をセンサ表面に導入できる. このアミンカップリングの反応機序 を図 1-10 に示す. このアミンカップリングに用いる試薬は他にもあるが本研究 で は N ヒ ド ロ ス ク シ ン イ ミ ド (N-hydroxysuccinimide; NHS) と EDC(1-Ethyl-3-[3-imethylaminopropyl]carbodiimide HCl)を用いている. カル ボキシル基を持つ化合物と NHS/EDC 混合液を混合するとまず EDC とカルボ キシル基が反応する. この反応は速いが得られた中間体の寿命も短く水により 加水分解される. また一部の中間体はそのまま一級アミンと反応しアミド結合 を作る. カルボキシル基と EDC の中間体は NHS と反応し NHS エステルを作 る. この NHS エステルも加水分解を受けやすいが, 水を避ければ比較的安定で ある. 次にこの NHS エステルに脱プロトン化した一級のアミンが反応しアミド を形成する. ここで重要なのは反応する一級アミンは脱プロトン状態であるこ とである. すなわち水溶液では反応は酸性よりもアルカリ性で起きやすくなる. しかし強アルカリ性ではNHS エステルが加水分解を受けやすくなる. そのため 低分子同士のアミドを作る場合はpH=8.5 程度の水溶液を用いる. また NHS や EDC は水の影響を受けやすいのでその水溶液は冷凍状態で保存する必要があり, 使用直前に常温に戻し, 常温に戻した後は速やかに使用されるべきである.

第１章 序章

- 20 -

図 1-10 アミンカップリングのメカニズム

赤：原料（アミノ基・カルボキシル基） 青：生成物 （アミド）

第１章 序章 - 21 -

1.8 抗原抗体反応

生物は体内に侵入した異物に対応するために様々な防御機構を持っている. その中で脊椎動物は複雑な防御機構を持っており, これを免疫と呼ぶ. この免 疫システムの中で異物を認識し, これらを排出したり無害化したりするために 働く免疫反応を抗原抗体反応と呼ぶ. この抗原抗体反応の主役は抗体タンパク 質で, 免疫系は様々な種類の異物に対応した抗体を持っている. この抗体に対 応する異物を抗原と呼ぶ. この抗体の抗原に対する認識能力を用いて様々なバ イオセンシングに用いられている.

1.8.1 抗体

抗体は体内に侵入した異物に対して B 細胞が産生するタンパク質で, その 異物（抗原）に対して特異的に結合することで異物の毒性を無力化したり体外 への排出の手助けをしたりする. 抗体はイムノグロブリン(Ig)と呼ばれ, 可変領 域と定常領域に分けられる. 可変領域は抗原結合にかかわる部分で, 抗体によ って様々な多様性を持つ. 定常領域は抗体の種類によって IgG, IgM, IgA, IgD, IgE に分類できる. ここでは最も多く本研究で用いる IgG について述べる.

IgG は 4 本のポリペプチドがジスルフィド結合を介して接続された構造を 持ち, その可変領域と定常領域はそれぞれ Fab(fragment, antigen binding)領域 と Fc(fragment, crystallizable)領域と呼ばれる. その模式図を図 1-11 に示す. IgG 抗体は２つの Fab フラグメントの先端で分子を認識し特異的な吸着を起こ

第１章 序章 - 22 - すことが出来る. 抗体は通常, 分子量約 5000 以上の高分子の異物に対して産生 される. しかし単一の抗体は高分子全体の構造を認識しているわけではなく, 高分子のごく一部の構造を認識して吸着する. 抗体が認識する抗原部位をエピ トープと呼ぶ. 抗体はファンデルワールス力, 静電相互作用, 水素結合, 芳香族 性相互作用などの非共有結合を用いて抗原を認識している. これは抗原を鍵と するならば対応する鍵穴の様な関係で表すことが出来る. その為, 抗原によく 似た構造を持つ部位にも結合してしまう特徴がある. この時, 抗体は抗原と結 合するがその親和性は弱くなる. この様な様子を図 1-12 に示す. この様に抗体 は抗原の小さな領域の化学構造を認識して抗原と結合している.

第１章 序章 - 23 - 図 1-11 IgG 抗体の構造 図 1-12 抗体の親和性

C

H

3

C

H

2

C

H

3

C

H

2

S S

S S

+

-+

-+

-+

-+ +

-+

-+

抗原

抗体の抗原 結合サイト 親和性が高い場合 親和性が低い場合

第１章 序章 - 24 -

1.8.2 抗体の作製方法

18) 脊椎動物の体内に異物が侵入すると免疫細胞の一つの B 細胞によって抗体 は産生される. B 細胞は多種多様の種類の物が存在し, 一種類の B 細胞は一種類 の抗体を作成することが出来る. 異物が侵入した際, その異物の化学構造に対 応可能な抗体を産生できる B 細胞が増殖し, 抗体を産生する. 抗体はその異物 の分子量が約5000 以上の時に産生される. しかし抗体のエピトープ部位は異物 の小さな領域であるため, そのような異物に対しては複数種類の抗体が産生さ れる. 抗体は作製方法でポリクローナル抗体とモノクローナル抗体に分けられる. ポリクローナル抗体は免疫原となる物質を動物に注射して抗体を産生させた後 にその血漿中の抗体を精製して得られる抗体である. 抗原に対して複数種の抗 体を持つため親和性が高いが, 抗体溶液を一度使い切ると同じ抗体溶液は得ら れず実験での再現性に劣るという欠点がある. 一方で、モノクローナル抗体を用 いるとこの様な欠点を克服できる。抗体を産生する B 細胞を培養できれば同じ 抗体を産生できるが, B 細胞は生体外で長期にわたって生存できない. そこで無 限に増殖可能なミエローマ細胞と B 細胞を融合させてハイブリドーマ細胞とす ると生体外で培養できるため同じ抗体を継続的に得ることが出来る. これをモ ノクローナル抗体と呼ぶ. モノクローナル抗体の作製手順は次の様になる. まず動物に抗原を免疫し て抗体の産生を確認した後, 脾臓を取出し, 個々の細胞まで細分化し, その懸濁 液を得る. 次に脾臓細胞の懸濁液とミエローマ細胞とをポリエチレングリコー ル6000 などを用いて融合させる. 次にこの各種細胞の混合溶液を分離用培地で 育成する。この分離用培地はハイブリドーマ細胞のみ選択的に育成可能なもの

第１章 序章 - 25 - を使用する。次にここで得られたハイブリドーマ細胞溶液をマイクロタイター プレート上に分散させ, 培養する. 次に各ウェルの上清の抗体活性を測定する. 活性の高いウェルを選択し, 再び分離用培地に分散させて培養する. この分散 と選別を繰り返し, モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を得る. これらは無限に増殖できるので, 必要に応じて増殖させ抗体を産生させれば同 じ構造の抗体を安定的に得られる. 一方で抗体の種類が 1 種類しかいないので 抗原との親和性が低い場合が少なくない. しかし同じ構造の抗体が得られるメ リットは大きくモノクローナル抗体が用いられることは多い. 分子量が約 5000 未満の分子が異物として動物の体内に侵入しても抗体は 産生されない. 一方で抗体のエピトープ部はその様な高分子全体の構造ではな く, 全体に対して極一部の構造である. そのため低分子に対して抗体を産生で きれば抗体を使用した選択性の高い分子認識が可能となる. その方法としてタ ンパク質などの分子量の大きな物質に低分子の目的物質またはその類似物質を 結合させて免疫することで低分子の抗体を得ることが出来る. この時, 使用さ れるタンパク質としては卵白アルブミン（OVA; 分子量 45,000）, ウシ血清ア ルブミン（BSA; 分子量 67,000）, スカシ貝ヘモシアニン（KLH; 分子量 100,000～450,000）などがある. この様な方法で低分子物質の抗体が得られた 時, その低分子の事をハプテン（抗原類似物質）と呼ぶ. 本研究で用いた TNT 抗体（Strategic Biosolutions 製）は TNT の類似物質である TNP-glycine と KLH タンパク質を結合させた複合体をマウスに免疫して得られたモノクローナル抗 体である.

第１章 序章 - 26 -

1.9 本論文の構成

本論文は本章を含めて以下の章で構成される. 第１章 序章 第２章 爆発物の検出方法 第３章 RDX の高感度検出 第４章 ラジカル重合によるビニル系ポリマーを用いたTNT の高感度検出 第５章 表面開始原子移動ラジカル重合を用いたセンサ表面によるTNT の高感 度検出 第６章 本論文のまとめ 第１章では本研究の背景と本研究で用いるSPR センサの原理や装置の説明, 表面修飾に用いるSAM やアミンカップリング反応の説明, 測定原理として用い る抗原抗体反応の説明などを行う. 第２章では爆発物の検出方法について述べる. 検出に影響を与える要因や 具体的な測定方法である間接競合法や置換法の説明を行う. 第３章ではRDX の抗体を作製し, RDX の検出を行う. 第４章ではラジカル重合を用いて作製したポリマーによるセンサ表面につ いて述べる. ここではポリマーの作製条件と非特異吸着性を評価し TNT の高感 度検出を行う. 第５章では表面開始原子移動ラジカル重合を用いて作製したセンサ表面に ついて述べる. まず表面の作製に用いている原子移動ラジカル重合についてメ カニズムや影響を与える要因について説明する. また混合モノマーや混合 SAM を用いての非特異吸着抑制や抗体とセンサ表面の親和性制御とTNT の高感度検 出についても述べる. 第６章では本論文の総括と今後の展望について述べる.

第２章 爆発物の検出方法 - 27 -

第2章

爆発物の検出方法

2.1 諸言

本章ではSPR 免疫センサを用いて爆発物の検出を行う場合に必要となる性 能や具体的な方法について述べる. SPR センサは高感度な屈折率計で, センサ 表面での物質の相互作用を検出することが出来る. しかし RDX や TNT 分子の 様な低分子との相互作用は屈折率変化が小さくSPR センサにおいても直接検出 することが難しい. また SPR センサ自体には表面で起こる相互作用に関して選 択性はない. そこで選択性を持ち相互作用による屈折率変化が大きい抗体の吸 着を用いる. 本研究では抗原抗体反応の抗体とセンサ表面の相互作用を用いて RDX や TNT を間接的に検出するが, その方法についても述べる.

第２章 爆発物の検出方法 - 28 -

2.2 爆発物探知装置に求められる性能

爆発物探知装置にとって最も重要な性能は即応性, 感度, 選択性である. 一 般に感度や選択性は即応性とトレードオフの関係にある. そのため測定に時間 をかけると感度を高めることが出来るが, 逆に言えば即応性を犠牲にしない方 法で感度や選択性を高めることが出来れば, それらを犠牲にして即応性を高め ることもできる. それ以外に重要な性能は測定の正確性や簡便性である. 正確 性は測定の信頼性である. 誤検出を繰り返す様な測定装置ではその検出に信頼 がおけず装置として使用できない. これを防ぐには機器のセルフチェック機能 や校正用試薬によるキャリブレーションが必要になる. 簡便性は装置の操作や データ解析の簡便性である. 簡便性が無ければ検査員の育成に時間とコストが かかる上, 誤検出の可能性も高くなる. また即応性にも関係してくる. これらの 要求に応えるべく, 我々は RDX や TNT 抗体を用いた SPR 免疫センサを用いた.

第２章 爆発物の検出方法 - 29 -

2.3 高感度検出についての検討

SPR センサと抗原抗体反応を用いて低分子を高感度に検出するには多種多 様なパラメータを制御する必要がある. まず SPR センサの方では測定に用いる ランニングバッファの種類やその扱い, また流速なども影響を与える. 低分子 物質の表面への吸着に伴う誘電率変化は小さいので, それを補う測定法も必要 となる. 抗原抗体反応の特異的な結合を用いて検出を行うため, その様な反応 によらない表面への吸着である非特異吸着なども測定に影響を与える. このセ クションではそれらについて述べる.

2.3.1 測定方式

RDX や TNT の分子量は数百と低く, 抗体をセンサ表面に固定して RDX や TNT 分子を抗原として表面に直接吸着させたとしても屈折率変化が小さいため SPR センサで検出することは難しい. そこでセンサ表面には抗原の類似物質を 固定して抗原・抗体と類似物質・抗体の親和性の差を利用し, 表面に対する抗体 の吸着特性を SPR センサで測定することで間接的に抗原の検出を行う. この研 究 で は 間 接 競 合 法(indirect competitive assay)19)_{と 置 換 法(displacement}

assay)20,21)_{を用いた. 間接競合法は高感度の検出に向いている一方で測定時間}

第２章 爆発物の検出方法 - 30 -

2.3.2 間接競合法

間接競合法では抗原類似物質への抗体の結合が抗原の存在によって競合す ることを用いる. すなわち抗原が存在すると抗体は抗原類似物質よりも抗原に 吸着しやすくなり, 抗原類似物質を固定しているセンサ表面には抗体は吸着し にくくなる. この時, 表面に吸着している抗体の量から抗原濃度を推定する. 次に具体的な方法を述べる. 間接競合法ではある一定濃度の抗体溶液を使用 する. 抗体溶液は SPR 測定に用いるランニングバッファを溶媒として作製する. まず最終濃度の倍の濃度の抗体溶液を用意する. この溶液と同容量のランニン グバッファを混合させ抗体溶液を作製する. 同様に最終濃度の倍の抗体溶液と 最終濃度の倍の抗原溶液を1:1 で混合させて抗体抗原混合溶液を作製する. この 抗体抗原混合溶液は抗原分子と抗体を結合させるため必要に応じて一定時間静 置する（インキュベーション）. 測定においてはまず抗体溶液をセンサ表面に流 通させる. この時, センサ表面の類似物質に抗体が結合しセンサグラムが上昇 する. 一定時間の流通の後, 流通前後のセンサグラム変化を0として記録する. 次に再生溶液を流通させてセンサ表面から抗体を解離させる. その後, 抗体抗 原混合溶液を先ほどと同じ時間流通させて流通前後のセンサグラム変化を1 として記録する. この時, 抗体抗原混合溶液では抗原濃度に応じて抗体が抗原 分子と結合している. この様な抗体は表面と結合しないため抗原濃度に応じて 表面へ結合する抗体の量は小さくなる. この時のセンサグラムと実験の概要を 図2-1 に示す. この1/0の比を結合率(Bond Percentage)と呼ぶ. この結合率 を各抗原濃度で測定し検量線を作成する. また各濃度で 3 回の測定を行う. 検出 限界は最も低濃度の抗原溶液での測定値の標準偏差の3 倍から求める.

第２章 爆発物の検出方法 - 31 - 図 2-1 間接競合法のセンサグラムと実験の様子 次に間接競合法で測定に影響を与える要因を探るためにモデル化を試みる. 間接競合法における抗原と抗体の濃度の関係は Piehler らによって報告されて いる22)_{. この報告では抗原と抗体の親和性と抗原, 抗体, 抗原抗体複合体の濃度} を用いて定式化されている. しかし我々のセンサでは抗原と抗体の親和性だけ でなく抗原類似物質と抗体の親和性も重要である. そこで抗原類似物質の要素 を含めて定式化を試みた. ただし簡単化のため抗体と抗原・抗原類似物質の結合 時間

Sen

sor

gr

am

抗原 抗原類似物質 抗体 ₀ ₁ 再生 抗体 のみ フロー 抗体＋ TNT フロー 再生 抗体 再生 のみ フロー 再生 抗体 のみ フロー 抗体＋ TNT フロー 再生

第２章 爆発物の検出方法 - 32 - は簡単化のため一価のみとした. また抗原・抗体および抗原類似物質・抗体の結 合量は平衡状態であるとした. これは実際の測定においては溶液の流通時間を 無限時間としたことに対応する. 定式化に用いるパラメータを表 2-1 に示す. ま ず平衡の関係から次の式が導かれる. 𝐶𝑎𝑏𝑎𝑔 𝐶_𝑎𝑏∙𝐶_𝑎𝑔

= 𝐾

1 (2.1) 𝐶_{𝑎𝑏ℎ𝑎𝑝} 𝐶𝑎𝑏∙𝐶ℎ𝑎𝑝

= 𝐾

2 (2.2) 次に抗原・抗体・抗原類似物質の総量は一定であるから次の式が導かれる. 𝐶_𝑎𝑏,0 = 𝐶_𝑎𝑏 + 𝐶_{𝑎𝑏𝑎𝑔}+ 𝐶_{𝑎𝑏ℎ𝑎𝑝} (2.3) 𝐶𝑎𝑔,0 = 𝐶𝑎𝑔 + 𝐶𝑎𝑏𝑎𝑔 (2.4) 𝐶_{ℎ𝑎𝑝,0} = 𝐶_ℎ𝑎𝑝+ 𝐶_{𝑎𝑏ℎ𝑎𝑝} (2.5) 最終的にSPR センサの信号として出力されるのは類似物質に結合した抗体なの でCabhapを求める必要があるが, ここではまず Cabを求める. まず式(2.1)(2.2)を 用いて連立方程式(2.3)(2.4)(2.5)は次の様に書き換えられる. 𝐶𝑎𝑏,0= 𝐶𝑎𝑏 + 𝐾1𝐶𝑎𝑏𝐶𝑎𝑔+ 𝐾2𝐶𝑎𝑏𝐶ℎ𝑎𝑝 (2.6) 𝐶_𝑎𝑔,0 = 𝐶_𝑎𝑔+ 𝐾₁𝐶_𝑎𝑏𝐶_𝑎𝑔 (2.7) 𝐶ℎ𝑎𝑝,0 = 𝐶ℎ𝑎𝑝+ 𝐾2𝐶𝑎𝑏𝐶ℎ𝑎𝑝 (2.8)

第２章 爆発物の検出方法 - 33 - 表 2-1 間接競合法の定式化に用いたパラメータ 連立方程式(2.6)(2.7)(2.8)を Cabに対して一つにまとめると次の様になる. 𝐾1𝐾2𝐶𝑎𝑏3+ {𝐾1+ 𝐾2+ 𝐾1𝐾2(𝐶𝑎𝑔,0 + 𝐶ℎ𝑎𝑝,0− 𝐶𝑎𝑏,0)}𝐶𝑎𝑏2+ {𝐾1(𝐶𝑎𝑔,0− 𝐶𝑎𝑏,0) + 𝐾₂(𝐶_{ℎ𝑎𝑝,0}− 𝐶_𝑎𝑏,0) + 1}𝐶_𝑎𝑏 − 𝐶_𝑎𝑏,0 = 0 (2.9) この式をCabについて解を求める. 解は複雑であるため記述は省略する. そして 式(2.2)(2.5)から得られる次式で Cabhapに変換する. 𝐶𝑎𝑏ℎ𝑎𝑝 =𝐾2_𝐾𝐶𝑎𝑏𝐶ℎ𝑎𝑝,0 2𝐶𝑎𝑏+1 (2.10) Cab 平衡時の抗原・類似物質と結合していない抗体濃度 Cag 平衡時の抗体に結合していない抗原濃度 Chap 平衡時の抗体に結合していない類似物質濃度 Cab,0 初期の抗体濃度 Cag,0 初期の抗原濃度 Chap,0 初期の類似物質濃度 Cabag 平衡時の抗体抗原複合体濃度 Cabhap 平衡時の抗体抗原類似物質複合体濃度 K1 抗体と抗原の結合定数 K2 抗体と抗原類似物質の結合定数

第２章 爆発物の検出方法

- 34 -

得られた式に対してK1 = 1010 M-1, Chap,0 = 10-8 mol/l, Cab,0 = 100 ppb (ng/ml)と

固定し, 抗体と類似物質の親和性を表す K2 = 108, 109, 1010, 1011, 1012 M-1 と変

化させた場合の検量線のシミュレーション結果を図2-2 に示す. また K1 = 1010

M-1_{, Chap,0 = 10}-8 _{mol/l, K2 = 10}8 _M-1_{と固定し, 用いる抗体濃度を表す Cab,0 = 1,}

10, 100, 1000, 10000 ppb (ng/ml)と変化させた場合の結果を図 2-3 に示す. これ らが示すのは抗体と類似物質の親和性が抗体と抗原の親和性より低いほど高感 度に検出できることを意味する. また用いる抗体も低濃度の方が高感度検出に 有利なことが分かる. しかしこのシミュレーションでは SPR 測定の信号の誤差 等が全く考慮されていない. 抗体と類似物質の親和性や用いる抗体濃度が低す ぎる場合はセンサ表面に吸着する抗体の量が少なくなるため, センサ応答が小 さくなり SN 比が低くなる. そのためノイズの影響が増大し測定値の標準偏差 が大きくなることで検出限界が結果的に上昇してしまい, 高感度検出が難しく なると想定される. これらの事から間接競合法において抗体との親和性がなる べく低いセンサ表面を作成し低濃度の抗体溶液を使用して測定すれば高感度検 出が可能となると考えられる.

第２章 爆発物の検出方法

- 35 -

固定：K1 = 1010 M-1, Chap,0 = 10-8 mol/l, Cab,0 = 100 ppb (ng/ml)

変化：K2 = 108, 109, 1010, 1011, 1012 M-1 図 2-2 抗体と類似物質の親和性と結合率の関係 固定：K1=1010 M-1, Chap,0=10-8 mol/l, K2=108 M-1 変化：Cab,0=1, 10, 100, 1000, 10000 ppb (ng/ml) 図 2-3 抗体濃度と結合率の関係

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1

100

10000

1000000

結合率

測定対象濃度 [ppt]

K2=1e8 K2=1e9 K2=1e10 K2=1e11 K2=1e12

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1

100

10000

1000000

結合率

測定対象濃度 [ppt]

Cab=1 ppb Cab=10 ppb Cab=100 ppb Cab=1000 ppb Cab=10000 ppb

第２章 爆発物の検出方法 - 36 -

2.3.3 置換法

置換法はセンサ表面に結合した抗体を自然解離させる際に周囲の抗原濃度 に応じて解離速度が変化することを利用して抗原濃度を測定している. 図 2-4 にその概略を示す. まず抗体をセンサ表面に結合させるために抗体溶液を表面 に流通させる. この時, 抗体溶液の濃度と流通時間に応じてセンサ表面に抗体 が結合する. 次に抗体溶液の流通を止めてランニングバッファを流通させる. するとランニングバッファ中に抗体は含まれないためセンサ表面に結合してい る抗体はその結合定数に応じて平衡状態になるべく解離を始める. この時, 抗 体は解離・再結合を繰り返しながら解離して行く. 一方, ここである濃度の抗原 溶液を流通させる. すると解離した抗体の一部は抗原分子と結合する. 抗原分 子と結合した抗体はセンサ表面の類似物質と再結合しにくくなる. その為, 流 通させる抗原の濃度に応じて解離速度が速くなる. この抗体の解離速度や一定 時間の解離量から抗原濃度を推定する. 次に具体的な方法を述べる. まず抗体溶液をセンサ表面に一定時間流通さ せる. 抗体溶液流通終了後, ランニングバッファを一定時間流通させる. 一定時 間経過後のセンサグラムをpre とし, 抗原溶液の流通を開始する. そして抗原

溶液の流通終了直後のセンサグラムをpost とする. ここでi=post/pre とす

る(i=0,1,2,3… ; それぞれの抗原濃度. i=0 の時, 抗原の濃度は 0). これらの値 から(0 – i) / 0を解離率(Displacement Ratio)と呼ぶ. 測定は各濃度で 3 回行い

その平均値で検量線を作成する. また0（抗原濃度は0）の標準偏差の 3 倍から

第２章 爆発物の検出方法 - 37 - 図 2-4 置換法のセンサグラム 置換法の測定に影響を与えるパラメータを明らかにするために置換法のモ デル化を試みる. この試みは Yasuura らによって既に行われているので, その モデルを用いる 23)_{. 置換法で抗原を検出する際に用いるデータは抗体の解離速} 度または一定時間の解離量から求めるため平衡ではない. 間接競合法の時と同 じパラメータを使用するが濃度に関しては時間に対する微分方程式となる. し かしこれは三体問題となり解析的に解を得ることはできない. そこで計算を簡 単にするためセンサ表面近傍の層とそれ以外のバルクな層の二つの領域に分け て計算している. センサ表面近傍層では流路の流れが止まっているので抗原が 存在せず, 抗体のみ拡散で濃度が変化する領域となる. バルク層では抗体が抗 原と結合するが, 遊離している抗原濃度は常に一定で, 遊離抗体と抗原抗体複 合体の濃度が変化する. そしてバルク層の遊離抗体の濃度がセンサ表面近傍層 の抗体濃度の影響を受けるモデルとなっている. 詳しい計算過程は省略するが, 結論としては間接競合法と同じでセンサ表 面と抗体の親和性は低いほど良く, 用いる抗体濃度は低い方が良い. しかし実 時間 Sensor gra m 抗原 抗原類似物質 抗体 0 1

第２章 爆発物の検出方法 - 38 - 際にはこれも間接競合法の時と同様で程度の問題となる. 低すぎる親和性では 抗体の信号がノイズに隠れて見えにくくなる. また低すぎる抗体濃度ではノイ ズの影響もさることながらセンサ表面に結合している抗体が少ないため解離速 度が小さくなる問題がある. 置換法は解離速度変化で抗原濃度を判断するため 解離速度が大きいほど低濃度の抗原を検出しやすくなる. これは間接競合法以 上にシミュレーション結果と矛盾することになる. そのため, 間接競合法にお いても置換法においてもシミュレーション上はセンサ表面と抗体の低い親和性 と低い抗体濃度が高感度検出に重要になるが, 実際はどちらも親和性や抗体濃 度が低すぎるとセンサのノイズの影響が大きくなり高感度測定が難しくなる. さらに置換法は表面に接合している抗体の量が多い方が高感度検出に有利とい うこともあり, これが間接競合法に比べて感度が低い原因だと考えられる.

2.3.4 タンパク質の非特異吸着

本研究では抗体がSPR センサ表面の抗原類似物質に対して特異的に結合し, 抗原の存在によってその特異的な結合が妨げられることによって抗原の検出を 行っている. すなわち抗体は特異的な結合のみによって SPR センサ表面に結合 していることが重要である. そのためこの結合によらない非特異的な吸着があ ると SPR センサでは特異的な結合と非特異的な吸着を区別できないため, 結果 として抗原の検出は難しくなる. 検出に使用する抗体はタンパク質の一種で, タンパク質はアミノ酸からできているので等電点を持ち, また分子内に疎水的 な部分や親水的な部分を持つ. 等電点を持つため水溶液の pH によって正また は負に帯電する. その時, 仮にセンサ表面が逆の電荷に帯電していると静電的

第２章 爆発物の検出方法 - 39 - な相互作用でそのタンパク質はセンサ表面に吸着する. また水中においては疎 水的な領域同士が会合した方がエネルギー的に安定なためセンサ表面に疎水的 な領域があるとタンパク質の持つ疎水的な領域と会合してしまい, その疎水的 な相互作用で吸着が起こる. この様な抗原抗体反応の特異的結合によらない吸 着の事を非特異吸着と呼ぶ. まず疎水性相互作用による非特異吸着を防ぐにはセンサ表面を親水性にす る必要がある. 水の様な極性の大きな溶媒に対して親和性を高くするにはセン サ表面に分極の大きな構造を導入する必要がある. 最も単純なものであれば用 いる溶液の pH で電離するような官能基を表面に導入することで親水性とする ことが出来る. しかしこの方法の場合は表面が正または負に帯電するため静電 相互作用による非特異吸着が起こる可能性がある. そこでヒドロキシル基やエ チレングリコール構造の様な分極の大きい構造を表面に導入することで電気的 に中性な条件で親水性を得ることもできる. この様な非特異的吸着性はウシ血 清アルブミン（Bovine Serum Albumin; BSA）やリゾチーム(Lysozyme)を用い ることで評価することが出来る 24)_{. BSA はウシの血清中に含まれる分子量約} 66000 のタンパク質で, 中性水溶液中では負に帯電しているためセンサ表面に 流通させるとセンサ表面が疎水性または電気的に正に帯電している際に非特異 吸着を起こす. リゾチームは卵白などに含まれる分子量約 14000 の酵素で, 中 性水溶液中では正に帯電しているためセンサ表面が疎水性または電気的に負に 帯電している際に非特異吸着を起こす. この様なタンパク質と目的物質の抗体 を流通させて抗体のみが結合できるセンサ表面を作製することが高感度検出に とって重要となる.

第２章 爆発物の検出方法 - 40 -

2.3.5 測定に影響を及ぼすその他の要因

抗原・抗体の親和性と類似物質・抗体の親和性の大小関係やセンサ表面へ の抗体の非特異的吸着が検出に影響を及ぼすことはこれまで述べた. ここでは その他の要因について述べる. まず SPR センサではセンサグラムの絶対値では なく実験前後のセンサグラムの相対値をセンサ出力とする. そのため実験前の センサグラムの絶対値が安定していない場合はセンサ出力の誤差が大きくなる. そのためセンサグラムを安定させる必要がある. このセンサグラムの安定性だ が実験中, 徐々に変化して行く場合と表面への抗体溶液の流通, 再生溶液によ る抗体の解離の実験サイクル毎に変化する場合がある. 前者の原因はよくわか っ て い な い が 10wt% の ド デ シ ル ス ル ホ ン 酸 ナ ト リ ウ ム (Sodium Dodecyl Sulfonate; SDS) を流通させると改善されることがある. 後者の場合は主にラ ンニングバッファの溶存酸素の影響と再生溶液の影響がある. ランニングバッ ファは水溶液で水は酸素を溶かしやすい性質がある. 溶存酸素は SPR のセンサ グラムにスパイク状の信号となって現れ, 影響を与える. その為, ランニングバ ッファは使用前に 2 時間程度の真空脱気が必要になる他, 実験が 3~4 時間以上 になる際は空気中からの酸素の再溶解を防ぐ手だてが必要になる. 具体的には ランニングバッファの容器を窒素でバブリングするか測定系をすべて窒素雰囲 気中で行う必要がある. また可能ならばオンライン脱気装置などで随時脱気す れば測定が安定すると考えられる. また実験に使用する再生溶液も選定が必要 である. 再生溶液は抗体が抗原のエピトープ部位との結合に使用している静電 的な相互作用を働かなくすることで抗原抗体反応の吸着を解離させる. この方 法として溶液のpH を変えて抗体の電荷状態を変える物（酸や塩基）, 高塩強度 で静電相互作用を打ち消す物（塩化ナトリウム, 塩化マグネシウムなど）, 界面

第２章 爆発物の検出方法

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活性剤で静電相互作用や疎水性相互作用を阻害する物（SDS, Tween20 など）, キ レ ー ト 剤 で 静 電 相 互 作 用 を 阻 害 す る 物 （ エ チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸; ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA）, 抗体の３次元構造を壊す物（グア ニジン塩酸塩）などがある. 新しい種類のセンサ表面を作製した際は適切な再生 溶液の選定を最初にすべきである. 適切でない場合, 抗体の結合・解離の度に結 合量が減少して行く場合がある.

第２章 爆発物の検出方法 - 42 -

2.4 ２章のまとめ

この章では爆発物の具体的な検出方法とSPR 免疫センサで検出を行う際に センサ表面に求められる性能を検討した. まず SPR センサで RDX や TNT の分 子を検出するにはこれらの分子量が小さく吸着による誘電率変化が小さいため, 直接検出は難しい. そこで RDX や TNT を抗原としてこれらの類似物質をセン サ表面に固定することでこれら抗体が表面に吸着でき, 抗原分子の濃度によっ てその結合を阻害できる表面を作製した. 具体的な測定方法として間接競合法 と置換法を用いた. 間接競合法は抗体のみの溶液をセンサ表面に流通させた時 に比べて抗体と抗原の混合溶液を流通させた時の方が表面への抗体結合量が低 くなることを用いて測定している. 置換法は表面に抗体を抗原抗体反応で結合 させた後, 流通させる抗原溶液の濃度によって抗体の表面からの解離速度が大 きくなることを用いて測定を行っている. またこれらの方法に関してモデルを 作成してどのような測定条件が高感度検出に適しているかを検討した. その結 果は抗体と低い親和性を持つセンサ表面を作製して低濃度の抗体を用いて測定 を行うことが高感度検出に有利であることが示唆されたが, 実際の測定では誤 差の影響があるのでそれらが低すぎても良くないことも示唆された. また高感 度検出に影響を与える要因として抗体の表面への非特異吸着を抑制することも 重要である.

第３章 RDX の高感度検出 - 43 -

第3章

RDX の高感度検出

10)

3.1 諸言

これまで爆薬成分の検出として TNT の検出を行ってきた. しかし TNT よ りも威力が高く, 一方, 化学的には安定であるために衝撃や火気などではほと んど爆発することがないプラスチック爆弾（コンポジションC4）も良く用いら れ る. こ れ に 含 ま れ る 爆 薬 成 分 は RDX (research department explosive; 1,3,5-trinitroperhydro- 1,3,5-triazine)である. この RDX の検出も行えること は爆発物検出について有用である. しかし本研究の様な SPR 免疫センサでは検 出対象の抗体を使用するが, この RDX の抗体は一般に流通しておらず, 入手は 困難である. そこでオリジナルの抗 RDX モノクローナル抗体を作製した. これ までの研究からオリゴエチレングリコールを用いると非特異吸着が抑制できる ことが分かっているので5)_{, オリゴエチレングリコール鎖を持つ SAM を用いて} 類似物質を固定したセンサ表面を作製し, これらを用いて RDX の検出を行っ た.

第３章 RDX の高感度検出 - 44 -

3.2 RDX 抗体の作製

ここでは抗体の作製について述べる. まず類似物質として 2 種類用意した. これらとRDX の構造を図 3-1 に示す. RDX 抗体を得るために類似物質の一つで ある RDXa1 とスカシ貝ヘモシアニン(KLH; 分子量 100,000～450,000)をアミ ンカップリングで結合させコンジュゲートを作製した. 得られたコンジュゲー トをラットに免疫し, セクション 1.8.2 の方法でモノクローナル抗体を得た. 得 られた抗 RDX ラットモノクローナル抗体の交差反応を調べるために各種物質 との結合能力（親和性）を間接競合ELISA 法で確認した. RDX との結合能力を 100% として規格化し交差反応率とした. その結果を表 3-1 に示す. この様にコ ンジュゲートの作製に用いたRDXa1 に最も強く結合する. また類似物質の一つ であるRDXa2 も RDX よりも強く結合する. TNT にもわずかに結合する. この 様にRDX およびその類似物質に結合できる RDX 抗体が得られた.

第３章 RDX の高感度検出 - 45 - 図 3-1 RDX およびその類似物質の構造

RDX

分子量：222.12

RDXa1

分子量：365.25

RDXa2

分子量：293.21

第３章 RDX の高感度検出 - 46 - 表 3-1 各種物質と RDX 抗体との結合能力 化合物 交差反応率 [ % ] RDX 100 RDXa1 1047 RDXa2 397 TNT(2,4,6-トリニトロトルエン) 1.57 1,3-ジニトロトルエン N/A 2,4-ジニトロトルエン N/A 2,6-ジニトロトルエン N/A 2-アミノ-4,6-ジニトロトルエン N/A 4-アミノ-2,6-ジニトロトルエン N/A