博 士 （ 生 命 科 学 ） 鄭 藹 萍 学 位 論 文 題 名

博 士 （ 生 命 科 学 ） 鄭    藹 萍

学 位 論 文 題 名

Structure Analysis of Eukaryotic Translation Initiation Factors 5B and lA Complex

（真核生物翻訳開始因子eIF5B‑lA 複合体の構造解析）

学 位 論 文 内 容 の 要 旨

        The initiation of protein synthesis is one of the crucial processes in the cell for all organisms and requires at least eight initiation factors (eIFs) in eukaryotes. In this process, 48S initiation complex,  formed by 40S ribosomal subunit, mRNA, eIF2iGIP'Met̲tRNAjMe', eIFIA, eIFl, etc. scans mRNA for the start codon, during which the eIF2‑bound GTP hydrolysis. The recognition of start codon triggers the dissociation of elFl, elF2  GDP and Pi. Afterwards, eIFIA, which is still present on the 48S initiation complex assists in recruiting eIF581GTP to the initiation complex: and eIF5B*GTP encourages the joining of 60S ribosomal subunit to form the 80S initiation complex. After that, the GIP bound to elF5B  is hydrolyzed and eIF5B*GDPleaves the complex with eIFIA, resulting an 80S complex which is ready for the elongation step.

       The interaction between eIF5B and eIFIA, two universally conserved initiation factors through all three kingdoms, is important for the conversion of 48S complex to a functional 80S ribosome. In bacteria, their homolog IF2 and IFl have been cross‑linked on the ribosome. In eukaryotes, it was reported that eIFIA and elF5B bind to each other even off the ribosome. However the details of this interaction are not yet understood  To elucidate the molecular bases for this interaction, we attempt to determine the structure of eIF5B‑eIFIA complex from Saccharomyces cerevisiae by X‑ray crystallography.

         As the N‑terminal domain of S. cerevisiae eIF5B is not required for its function and the N‑terminal tail of S. cerevisiae eIFIA is unstructured, the N‑termini of both proteins are truncated and these truncation variants are referred to as eIF5B and eIFIA. The recombinant eIF5B and eIFIA were overexpressed and purified independently, eIF5B‑eIFIA complex was constructed by mixing two purified protein and further purified by size‑exclusion chromatography. The crystals, which were confirmed to contain both proteins by SDS‑PAGE, were obtained and diffracted to maximum resolution of 3.3 A. The structure was solved by molecule replacement. There are two complex molecules in the asymmetric unit.

         The structure of eIF5B consists of four domains, a conserved N‑terminal G‑domain (domain I), an EF‑Tu‑type p barrel (domain iD, an a/p/a‑sandwich (domain III), and a second EF‑Tu‑type p barrel (domain IV), which is connected to domain I‑III via a long helix. The two eIF5B molecules in the asymmetric unit have different conformations. Although the structures of individual domain of two

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−

 eIF5B molecules are similar, the positions of domain III and domain IV relative to domain I‑II are quite different. Domain IV even adopt almost opposite orientation :in two eIF5B molecules. Their conformations are also different from tbat of the isolated eIF5B structure. Such high flexibility of eIF5B conformation may refiect the requirement for conformational change between pre‑ and post‑ state of ribosomal subunits j oining.

       Although the model of elFIA core domain is difficult to build since the electron density map is poor, we are still able to build the extreme C‑terminal tail of eIFIA based on the 2Fo‑Fc and Fo‑Fc map. The C‑terminal tail of eIFIA binds to a pocket formed by two helices in eIF5B domain IV The interaction is mainly hydrophobic as suggested by previous reports, while the hydrogen bonds between eIF5B side chain and eIFIA main chain are also important. This interaction is unique to eukaryotes because the unstructured C‑terminal tail of eIFIA is not found in bacteria and archaea, and in bacteria IF2 (e1F5B homolog) also lacks the corresponding binding pocket. The evolution of this unique interaction may result from the much weaker affinity between eIF5B and initiatdr tRNA in eukaryotes (Kd = 40 VM) compared to its bacterial and archaeal homologs, which are in micromolar range. The interaction between eIFIA and elF5B domain IV might facilitate the weak binding between elF5B domain IV and initiator tRNA by restricting the flexibility of elF5B domainIV, and as a result prevent the dissociation of initiator tRNA and stabilize the interface between 40S and 60S subunit for upcoming ribosome assembly.

       Finally, a model for the interaction between eIF5B and eIFIA on the ribosome is proposed based on structures of ribosome in complex with translation factor. eIFIAis assigned to the A‑site of small subunit by superposing to the structure of its bacterial homolog IFl in the 30S*IFl complex. The position of eIF5B on the ribosome is obtained via superposing domain G of eIF5B to tbat of another ribosomal dependent GFPase EF‑G in the crystal structure of EF‑G'70S complex. In tbis model, the core domain of eIFIAis close to domain lII of eIF5B, while domain IV of eIF5B is far from the initiator tRNA acceptor arm, which is consist with a state aiter eIF5B‑bound GTP hydrolysis. Before GTP hydrolysis, initiator tRNA is supposed to adopt a hybrid P/I state, and elF5B domain IV is supposed to bind with initiator tRNA acceptor arm To build the GTP state model, eIF5B domain IV was manually rotated to initiator tRNA acceptor arm, which is easy to accomplish in vivo considering the high flexibility of eIF5B conformation  In this GTP state model, both eIFIA C‑terminal tail and initiator tRNA acceptor arm bind with elF5B domain IV, forming a stable tripod ready for the binding with 60S subunits. The joining of 60S subunit induces the hydrolyzation of eIF5B‑bound GIP, which causes the movement of elF5B domain IV and the dissociation of eIF5B and tRNA contacts. Then initiator tRNA back‑translocate into P/P state ready for the formation of the first peptide bond. The resulting conformation change of 80S  complex also looses the binding of eIFIA and promotes a rapid release of eIFIA, whereas eIF5B, having lost main anchorages to the 80S complex, dissociates from the ribosome coupled with eIFIA.

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学 位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

Structure Analysis of Eukaryotic Translation Initiation Factors 5B and lA Complex

（真核生物翻訳開始因子eIF5B‑lA 複合体の構造解析）

    

蛋 白質 の翻 訳開 始 反応 は， すべ ての生物種 に存在する最も重要なプロセ スの1っであり，

真核 生 物に おい て少 な くと も

8

個 の 開始因子(eIFs)が必要とする．この翻訳 開始反応では，ま ず，

mRNA

，

eIF2

． GTP． Met̲tRNAjMet，eIFIA，eIFlな どが り ボソ ーム

40S

サブ ユニ ットに 結 合 し ， 開 始 複 合 体 で ある

48S

にな る． そし て，

eIF2

に 結合 して い るGTPが加 水 分解 しな が ら ，

mRNA

の 開 始 コ ド ン を ス キ ャ ン す る ． 開 始コ ド ンが 認識 され た ら，

eIF1

，eIF2．

GDP

と

Pi

が

48S

から 解 離す る． その 後，

eIF5B

．

GrP

がり ボ ソー ム小 サブユニットに 残っている

eIFlA

との 相 互作 用に よっ て りボ ソー ム小 サブユニッ トに結合し，eIFlAと協調的 に働くことによっ て60Sサ ブユ ニ ット との 会合 を促 進 する ．

80S

リ ボソ ーム が形 成 され た後 に，

eIF5B

に 結合し て い る

GTP

が 加 水 分 解 し ，

eIF5B

．

GDT

が

eIFlA

と と も に

80S

か ら 離 れ ， 翻 訳 は 次 の 伸 長 反 応へ と 移行 し， タン パ ク質 合成 が開 始さ れ る，

    

これ らの 開始 因子 の 中で ，真 核， バ クテ リア ，古 細菌 の

3

大種 類 の生 物種 によ く保存さ れ て いる のは

eIF5B

と

el[FIA

で あ る． この ニつ の因 子 の相 互作 用は ， リボ ソー ム小 サブユニ ッ ト から 機能 する

80S

リボ ソー ム にな るこ とに 対し て 重要 である．バクテリアで は，elF5Bと

eIFIA

のホ モ ログ であ るIF2と

IF1

はり ボソ ーム に依 存 的に 結合 する こ とに 対し て， 真核生物 の

eIF5B

と

eIFIA

はり ボソ ー ムが 存在 しな くて も 相互 作用 する こと が 知ら れて いる が ，そ れ ら の 相互 作用 の詳 細は ま だ明 らか にさ れ てい ない ．そ こで ， 本研 究は

X

線 結晶 構造 解析によ り 酵 母由 来の

eIF5B‑eIFIA

複合 体 の構 造を 明ら かに し ，そ れら の相 互 作用 の分 子基 盤を解明 す る ，

    

酵 母 由 来

eIF5B

の

N

末 端 ド メ イ ン は 機 能 に 寄 与 し て い な い ， ま た

eIFIA

の

N

末 端 の 部 分は フオ ー ルド して いな いた め ，こ のニ つの タン パ ク質 のN末端 を欠 損し たサ ン プルを用い て， 複合 体 の構 造解 析を 行っ た ．二 つの サン プル を 大腸 菌の発現系によ りそれぞれ発現し，

大量 調製 し た． 精製 後の サン プ ルを 混合 する こと に よっ て，複合体を形 成し，結晶化を試み た 結 果 ，

3.3A

回 折 能 を 持 つ 結 晶 を 得 る こ と に 成 功 し た ． ま た ， 得 られ た 結晶 を用 いて ，

SDS

−PAGEに よっ てチ ェ ック した とこ ろ ，eIF5Bと

eIFIA

の バ ンド が確 認さ れ， そ の結晶は複 合体 であ る こと を確 認で きた ． また ，分 子置 換に よ り位 相計 算を 行 い， 非対 称単 位に2個の 複合 体の 分 子が 存在 する こと が わか った ，

eIF5B

の 構 造 は ， よ く 保 存 さ れ て い る

N

末 端

G

ド メ イ ン （ ド メ イ ン

I

），

EF‑Tu

タ イプ

8

―

317

―

閔 勲

誠 之

   

   

農

   

中 村

瀬

姚 田

出 尾

授 授

授 授

教  

  教

准 教

教 准

査 査

査 査

主 副

副 副

barrel

ド メイ ン （ ド メ イ ンiD， （ 】ゆ ん ーsandwichド メ イ ン （ドメ インm），2番 目のEF．

1

、

uItypc Dban

℃

l

ド メ イ ン （ ド メ イ ンIV） の

4

つ の ド メ イ ン か ら な る ． ド メ イ ン

IV

は

1

本 の 長 い

helix

に よ っ て ド メ イ ン

I

一

III

と っ な が っ て い る ． 非 対 称 単 位 に あ る

2

個 の

eIF5B

分 子 の そ れ ぞ れ の ド メ イ ン 構 造 が 似 て い る に も か か わ ら ず ， 全 体 の 構 造 は 異 な っ て い る ． そ れ は ， ド メ イ ン

I

，

II

に 対 し て の ド メ イ ン

m

と

W

の 配 置 が 異 な っ て い る か ら で あ る ， 二 っ の 分 子 の ド メ イ ン

W

は ほ ぼ 反 対 方 向 を 向 い て い る ． さ ら に ， こ れ ら の ド メ イ ン の 配 置 も 本 研 究 室 で 解 析 さ れ た 単 独 の

eIF5B

構 造 と 異 な っ て い る ． こ の よ う な

highnexibil

吋 を 持 つ

eIF5B

構 造 は ， リ ボ ソ ー ム サ ブ ユ ニ ッ ト 会 合 の 前 後 （

re

．

andpost

‐

state

） に 要 求 され て い る

eIF5B

の 構造 変 化 を 反 映 して い る と 考え ら れ る ．

    eIFIA

の コ ア 構 造 は 電 子 密 度 マ ッ プ の 貧 弱 の た め ， 構 築 で き な か っ た が ，

eIFIA

の

C

末 端

tail

の

2Fo‑Fc

と

Fo‑Fc

マ ッ プ は 明 瞭 で あ っ た ．

eIFIA

の

C

末 端 が

eIF5B

ド メ イ ン

IV

の

2

つ の

helix

か ら 形 成 さ れ た ポ ケ ッ ト に 入 り ， 主 に 疎 水 性 相 互 作 用 に よ り

eIF5B

と 結 合 し て いる ． ま た ，

eIF5B

の 側 鎖 と

eIFIA

主 鎖 の 間 に 水 素 結 合 も 形 成 さ れ て い る ． こ の よ う な

eIF5B

と

eIFIA

の 相 互 作 用 は 真 核 生 物 に 特 有 で あ る ， 何 故 な ら ば ， バ ク テ リ ア

IF1

と 古 細 菌aIFIA (eIFIAの ホ モ ロ グ ） に は ，

C

末 端

tail

が 存 在 し な い ， ま た ， バ ク テ リ アIF2 (eIF5Bの ホ モ ロ グ ） に は

eIFIA

と 結 合 す る ポ ケ ッ ト も 欠 け て い る た め で あ る ， こ の ユ ニ ー ク な 相 互 作 用 は

eIF5B

と 開 始

tRNA

の 相 互 作 用 の 進 化 に よ る も の と 考 え ら れ る ． す な わ ち ， バ ク テ リ ア お よ ぴ 古 細 菌

(mM

レ ベ ル ） と 比 べ て ， 真 核 生 物 で は ，

elF5B

と 開 始

tRNA

の 結 合 ア フ イ ニ テ ィ

(Kd=40yM)

が 弱 い た め ，

eIF5B

の ド メ イ ン

IV

が

eIFIA

の

C

末 端 か ら 受 け た

flexibility

＾ の 制 限 は 開 始

tRNA

と の 弱 い 相 互 作 用 を 補 助 し ， 開 始

tRNA

の 解 離 を 防 ぎ ，

40S

と

60S

の 会 合 に 有 利 な 接 触 面 を 保 っ と 考 え ら れ る ．

    

リ ボ ソ ー ム に お け る

eIF5B

と

eIFIA

の 働 き を 明 ら か に す る た め ， 得 ら れ た 構 造 を

80S

リ ポ ソ ー ム 構 造 に マ ッ ピ ン グ し た ． ま ず ， ＠

eIFIA

を 構 造 解 析 さ れ た

30S

． ロ

1

複 合 体 構 造 の

IF1

に

fitting

に よ っ て ，

eIFIA

が

40S

の

A

サ イ ト に 配 置 さ れ る こ と が 分 っ た ， ◎eIF5Bを

70S

．

EF‑G

複 合 体 の 構 造 に あ る

EF‑G (eIF5B

の ド メ イ ン

G

の ホ モ ロ グ ） と 重 ね 合 わ せ る こ と に よ っ て ，

70S

．

eIF5B

複 合 体 の モ デ ル を 作 成 し ， さ ら に ， そ の モ デ ル を

30S

．

eIFIA

と 重 ね る こ と に よ っ て ，

70S

．

eIF5B

゜

eIFIA

の モ デ ル を 得 た ， ◎

70S

．

 eIF5B

．

 eIFIA

の モ デ ル を80Sの 結 晶 構 造 の

rRNA (28S)

と 重 ね 合 わ せ る こ と に よ っ て ， 最 終 的 に

80S

．

 eIF5B

．

 eIFIA

の モ デ ル を 作 成 し た ． こ の モ デ ル で は ，

eIFIA

の コ ア が

eIF5B

の ド メ イ ン

m

の 付 近 に 配 置 さ れ ，

eIF5B

の ド メ イ ン

IV

が 開 始

tRNA

と 離 れ て い る ． こ れ は ，

eIF5B

に 結 合 し て い る

GTP

の 加 水 分 解 後 に

eIF5B‑GDP

が り ボ ソ ー ム か ら 解 離 す る 直 前 の 状 態 と 考 え ら れ る ， ま た ，

80S

に 会 合 す る 前 に ， 不 安 定 な

P/I

結 合 状 態 の 開 始

tRNA

の ア ク セ プ タ ー ア ー ム が

eIF5B

の ド メ イ ン

IV

と 結 合 す る こ と が 報 告 され て い た の で， 本 研 究 で 得 られ た

high flexibility eIF5B

の構 造 に 基 づ ぃ て，

elF5B

の ド メ イ ン

m

と

I

を 回 転 さ せ ，

GTP

が 加 水 分 解 す る 前 の モ デ ル を 作 成 し た ． っ ま り ，

eIFA

の

C

末 端 に 制 限 さ れ た

eIF5B‑GTP

の ド メ イ ン

IV

は 開 始

tRNA

の ア ク セ プ タ ー ア ー ム と 結 合 す る こ と に よ っ て

60S

と 会 合 し や す い 界 面 を 形 成 す る ． そ し て ，

60S

と 結 合 す る こ と で ，eIF5Bの

GTP

が 加 水 分 解 さ れ ，

eIF5B‑GDP

の ド メ イ ン

m

と

IV

の 構 造 変 化 が 起 こ り ， 開 始

tRNA

か ら 離 れ る ． 最 終 的 に ， 開 始

tRNA

が

P/P

配 置 に な り ，

eIF5B

と

eIFIA

が り ボ ソ ー ム か ら 解 離 し ，

80S

が タ ン パ ク 質 合 成 反 応 の 伸 長 段 階 に 入 る ，

  

以 上 ， 本 研 究 で は 真 核 生 物 の 翻 訳 開 始 因 子

eIF5B‑lA

複 合 体 の

X

線 構 造 解 析 に よ っ て

eIF5B

と

eIFIA

の 相 互 作 用 を 明 ら か に し ， 得 ら れ た 構 造 を り ボ ソ ー ム 構 造 に マ ッ ピ ン グ す る こ と に よ っ て ，

eIF5B

と

eIFl

の 働 き を 提 案 し た ． 本 研 究 が 生 命 科 学 に 及 ぼ す 貢 献 に は 多 大 な も の が あ り ， よ っ て 審 査 員 一 同 は ， 申 請 者 が 北 海 道 大 学 博 士 （ 生 命 科 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 あ る も の と 認 め た ．

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