博 士 （ 生 命 科 学 ） 鈴 木 哲 矢
学 位 論 文 題 名
酸 化 損 傷 ヌ ク レ オ チ ド 誘 発 変 異の 塩 基 除 去 修 復 蛋 白 質 に よ る 抑 制
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
［研究背 景］
呼吸 、エ ネ ルギ 一代 謝な ど の内 在的要因や電離放射線、 紫外線などの外在的要因によ り生体 内 で は 活 性 酸 素(ROS)が 生 じ る 。 こ の 活 性 酸 素 はDNAや そ の 前 駆 体(dNTP)と 反 応 す る こ とが知ら れている。これらの損傷を 受けたヌクレオチドは、遺伝子上に突然変異を引き起こし、癌 や老化、 多くの遺伝性疾患の原因と なると考えられている。生体 はこれらの損傷に対して複数の 防 御機 構を 備 えて いる 。そ れ らの 中で 塩基 除去 修 復は 、特 に活性酸素により生じるDNA損傷を 効 率 良 く 除 去 で き る 修 復 機 構 の ― つ で あ る 。 酸 化 損 傷DNAは 、 直 接DNAが 酸 化 を 受 け る こ と や、 ヌク レ オチ ドプ ―ル 中 に生 じた酸化ヌクレオチドがDNAポリメラーゼによりDNA中 に取り 込まれる ことにより生じる。DNA構成 塩基の中でもグァニンは酸化されやすく、8‑ヒドロキシグァ ニ ン(8‑OH‑Gua)を 生 じ る 。DNA中 に 生 じ た8‑OH‑Guaに 対 し て はdCTPだ け で な くdATP も取り込 まれることが明らかにされ ており、またヌクレオチドプ―ル中に生じる8七ドロキシ‑dGTP (8‑OH‑dGTP)はDNAポ リ メ ラ ― ゼ の 基 質 と な り 、 誤 っ た 塩 基(A)に 対し て 取り 込ま れる こと が 報 告 さ れ る な ど 、 変 異 の 誘 発 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ て い る 。 本研 究で は 、8‑OH‑Guaに よ る変 異誘 発に 対す る 塩基 除去 修復 の関 与 を明 らか にする ため、
大 腸菌 の塩 基除去修復酵素欠損 株、siRNAにより塩基除去修 復酵素をノックダウンしたヒ ト由来 の 培養 細胞 の 系を 用い て、 酸 化損 傷に よる 変異 誘 発と その 修復 メカ ニ ズム の解 析を行 った。
［結 果お よ び考 察］
本腿 萱！ 三 おLナ 歪 鰹極
大 腸 菌 塩 基 除 去 修 復 酵 素endonuclease川(Nth)欠 損 株NKJ1002 (nth)、endonuclease VIII (Nei)欠損 株NKJ1003 (nei)に塩 化 カル シウ ム法 を用 い て、8‑OH‑dGTPを 導入 し、 リ ファ ンピ シン 耐 性を 指標としたrpoBア ッセイにより変異体率を算 出し、コント口‑ル（水処理 ）の変 異 体 率 を 差 し 引 く こ と で 、 そ の 変 異 体 率 の 上 昇 量 を 各 株 で 比 較 し た 。 野 生 型 に 比 べ てnth欠 損 株 に お い て8‑OH‑dGTPの 導 入 に よ り 誘 発 さ れ た 変 異 体 率 が2.7 倍 増 加 し 、8‑OH‑dGTPに よ り 誘 発 さ れ る 特 徴 的 な 変 異 で あ るA:Tか らC:Gへの トラ ンス バ―
ジョ ン変 異 体率 が増 加し てい た 。一 方、nei欠損 株に おい て 誘発 変異体率は野生株に比 べて増 加傾 向に あ るも のの 、顕 著な 変 化は みら れなかった。しかし ながら、nei欠損株において もA:T からC:Gへの 変異 の 割合 が増 加し てい た 。
大 腸 菌 の8‑OH‑dGTPの 分 解 酵 素 で あ るMutTと 塩 基 除 去 修 復 酵 素 で あ る 、Nth、Neiを 二重 欠損 し た大 腸菌 株(mut Tlnth、mut Tlnei)を用いて、同 様にrpoBアッセイにより自 然突然 変 異 体 率 を 調 べ 、MutTの 欠 損 に よ り 内 在 的 に 蓄 積 さ れ る8‑OH‑dGTPの 誘 発 変 異 に 塩 基 除 去修 復欠 損 が与 える 影響 を調 べ た。
mutTlnthの 二 重 欠 損 株 に お い てmutTの 単 独 欠 損 株 に 比 べ て 、 自 然 突 然 変 異 体 率 が2 倍 程 度 高 か っ た 。 一 方 、mut Tlnei二 重欠 損株 ではmutT単 独欠 損株 と同 程 度の 自然 突然 変異 体率 しか 示 さな かっ た。
ー1361ー
以上の結果から、Nthが8‑OH‑dGTPが誘発する変異を抑制していることを明らかにした。
喧塾動物鋼胞！三葢ける解盤
ヒ トの 塩基 除去 修復 酵素 であ るOGG1、MYH、NTH1、及びNEIL1をsiRNAによルノ ックダ ウンした293T細胞に、レポ―タ一遺伝子supFを有する複製型プラスミドp2189‑Stulを導入 後、浸透圧シフト法により8‑OH‑dGTPを細胞に導入した。培養後、細胞から複製されたプラスミ ド を 回 収 し 、 指 示 大 腸 薗KS40/pOF105に 導 入 し 、supF変 異 体 率 を 算 出 し た 。 dGTPに 比較 して8‑OH‑dGTPの導 入に より 変異 体率 が増 加し た 。8‑OH‑dGTPが誘 発する 変異は、MYHのノ ックダウンにより減少した。この結果は、MYHが8‑OH‑dGTPによる変異誘 発を促進していることを示している。また、OGG1、NTH1、NEIL1をノックダウンした細胞では 8‑OH‑dGTP誘発変異体率の顕著な変化は見られなかった。
さらに、OGG1、MYH、NTH1、及びNEIL1をノ ックダウンした293T細胞Iこ 、p2189‑Stulの supF遺伝 子中 に8‑OH‑Gua:Cまた は8‑OH‑Gua:A塩 基対 を含 むプ ラス ミドを導入し た。培 養 後 、 細 胞 か ら 複 製 さ れ た プ ラ ス ミ ドを 回 収し 、同 様にsupF変異 体率 を算 出し た。
従 来 の 研 究 か ら 予 想 さ れ る よ う にOGG1、MYHを ノ ッ ク ダ ウ ン し た細 胞に おい て、
8‑OH‑Guaニcにより誘発される変異体率は増加した。さらに、NEIL1、NTH1をノックダウンした 細胞 にお いて も8‑OH‑Gua:C誘発 変 異体 率は増加した 。これらの結果は、DNA中に 生じた 8‑OH‑Gua:Cに よ り 誘 発 さ れ る 変 異 をOGG1、MYH、NTH1及 びNEIL1が 抑制 して いる こと を示している。
―方で、8‑OHーGua:A塩基対を含むプラスミドの変具体率はMYHのノックダウンにより減少 したが、OGG1、NTH1、NEIL1のノックダウンでは変異体率の変化はみられなかった。このこと は 、MYHが8‑OH‑Gua:AのAを 除 く こ と でGニCへ 変 換 し て い る こ と を 示 し て い る 。
［結論］
活性酸素により生じる酸化損傷である8‑OH‑Guaについて大腸菌と哺乳動物細胞を用いて 変異誘発と塩基除去修復酵素の関連についての解析を行った。
大腸菌ではNthが、8‑OH‑dGTPにより誘発される変異を抑制していることを示した。またヒト 培 養 細 胞 で は 、OGG1、MYHに 加 え てNEIL1、NTH1もDNA中 の8‑OH‑Guaに よ る 変 異 誘発 を抑 制す る作 用が ある ことを明らかにした 。さらに、MYHは8‑OH‑Gua:A形成による 8‑OH‑dGTP誘発変異を促進していることが示唆された。
―1362ー
学位論文審査の要旨
主 査 准 教 授 紙 谷 浩 之
副 査 教授 原島秀吉 副 査 教授 松田 彰
副 査 教 授 有 賀 寛 芳
学 位 論 文 題 名
酸化損傷ヌクレオチド誘発変異の 塩基除去修復蛋白質による抑制
鈴木 哲矢君は、酸化損傷ヌクレオチドが誘発する変異に対する塩基除去修復蛋白質の影 響を解 明することを目的に本研究を行った。酸化損傷ヌクレオチドは、生体内で内在的に 発生す る活性酸素によルヌクレオチドプール中で生ずると考えられる。鈴木君は、生細胞 に酸化 損傷ヌクレオチド／酸化損傷塩基を含むプラスミドDNAを導入する方法を用いて、
様々な研究を行った。
まず 、鈴木君は、ヌクレオチドプール中に生じる酸化dGTPで ある8―ヒドロキシーdGTP (8‑OH‑dGTP)に着目し、大腸菌の塩 基除去修復酵素欠損株に8‑OH―（lGTPを導入し、誘発 される変異を解析した。大腸菌塩基除去修復酵素endonucleasem（Nm）欠損株NIくJ1002（n脚、
endonucleaseVm（Nei）欠損株NKJ1003（nピめに塩化カルシウム法を用いて8―OH‐dGTPを 導入し 、ワDBアッセイにより変異体率を算出した。その結果、 鈴木君は、門m欠損株にお い ては 野生 型 に比 べて8―OH―dGTP誘発変異体率が約2．7倍増加 することを見出した。
8―OH‐dGTPにより誘発される変異であるA：TうC：Gトランスバージョンの割合も同時に増 加していた。また、門8f欠損株においては、誘発変異体率は野生株に比べて増加傾向にある ものの顕著ではなかった。しかし、凡甜欠損株においてもA：TうC：Gトランスバージョンの 割合が 増加していた。さらに鈴木君は、主要な8―OH―dGTP分解酵素を欠損しているために 内在的 に8ーOH−dGTPが細胞内に蓄 積していると考えられるm甜 げ株に着目し、NmやNei欠 損の影 響を調べた。その結果、mMr列門m二重欠損株においてはm げの単独欠損株に比べて 自然突 然変異体率が2倍程度高いことを見出した。一方、m rm8f二重欠損株では、m甜げ単 独欠損 株と同程度の自然突然変異体率しか示さなかった。以上の結果から、鈴木君は、Nm が8―OH−dGTP誘発変異を主として抑制していると結論づけた。
次に 鈴木君は、siRNAにより塩基 除去修復酵素をノックダウンしたヒト由来の293T細胞 を用いて、ヒト塩基除去修復酵素と8−ヒドロキシグアニン（8―OH−Gua、G由来の酸化損傷 塩基）／8‐OH―dGTPが誘発する変異との関連を調べた。293T細胞の塩基除去修復酵素（OGG1、 MYH、NTH1、 及 びNEIL1） をsiRNAに よ ル ノ ッ ク ダ ウ ン し 、レ ポー タ ー遺 伝子sゆF遺 伝 子中 に8ーOHーGuaを 含む 複製型プ ラスミドを導入した。その結果、OGG1、MYHをノッ クダウンした細胞において、8‐OH‐〔maによって誘発された変異体率は増加した。さらに、
鈴木君は、NTHl、N1三ILlをノックダウンした場合においても8‐OH−GIla誘発変異体率が増 加する ことを見出した。これらの結果は、DNA中に生じた8‐OH―（haにより誘発される変 異 をOGG1、MYH、NTH1及 びNEIL1の4種 の 塩 基 除 去 修 復 酵 素が 抑制 し てい るこ とを 示 しており、鈴木君は予想外の知見を得た。
―1363ー
最後に、 鈴木君 は、OGG1、MYH、NTH1、 及びNEIIー1をノックダウンした293T細胞に、
supF遺伝子を 含む複製型プラスミドと8．OH‐dGTPを導入した。培養後、細胞から複製さ れたプラスミドを回収し、指示大腸菌KS40／pOF105に導入し、ゴMpF変具体率を算出した。
その結果 、MYHの ノック ダウンに より、8．OH・dGTP誘発変異は減少した。また、OGG1、 NTH1、NE凡1をノックダウンした場合には、8‐OH｜dGTP誘発変異体率に顕著な変化は観察 されなか った。以 上の結果から、鈴木君は、MYHが8ーOH‐dG11Pによる変異誘発を促進し ているこ と、及び 、OGG1、NTm、NEIL1の8‐OH‐dGTP誘 発変異を 抑制する機能は低いこ とを明らかにした。
以上、鈴木哲矢君は、活性酸素により生じる酸化損傷である8‐0H‐Gua／8‐0H‐dG口が誘 発する変異に関して、大腸菌とヒト細胞の塩基除去修復酵素との関連を明らかにした。酸 化損傷は、内在的要因や様々な外在的要因により生ずる活性酸素の作用により生成し、変 異・癌・神経変性・老化などとの関連が指摘されている。鈴木君の研究を基盤として、さ らなる研究の展開が可能であると思われる。しゝずれの審査委員も、博士の学位の授与に十 分な研究を行ったものと判断した。
よって鈴木哲矢君は、北海道大学博士（生命科学）の学位を授与される資格のあるもの と認める。
−1364―
