＋PAO
第四節 gp30の再利用
た。その後再び細胞表面のgp30は抗gp30抗体とFITC標識抗ウサギ抗体を用い て1時間4℃でそれぞれインキュベートすることで染色を行った。これらのディ ッシュは0．35mlのPBSで2回洗浄し、1mlのPBSで細胞を回収した。回収液
はマイクロプレートへ移し、細胞表面のgp30−FITC標識gp30抗体の蛍光強度を
FluorImager 595で測定した。
抗体処理によるgp30の活性化に関しては、肝内皮細胞ディッシュに抗gp30抗 体を加え、4℃で0，15，30分インキュベートした。二次抗体添加に関しては、1 次抗体とのインキュベート30分後して洗浄後、更に2次抗体を加え4℃で30分 間インキュベートした。gp30活性化肝内皮細胞を37℃で0−90分インキュベート
した。細胞表面gp30の免疫染色法はコントロールの肝内皮細胞と同様に行った。
D3アルブミン処理によるgp30活性化法は、 D3アルブミン（5，25，50 mg／ml）
かnativeアルブミン（50 mg／ml）を加え、4℃で1時間インキュベートした。細 胞表面gp30の免疫染色法は、酸洗浄の操作がないことを除き、コントロールの肝 内皮細胞と同様に行った。
共焦点レーザー顕微鏡による観察
gp30の再利用に関しては、コントロールの肝内皮細胞にAlexa 488標識抗gp30 抗体（3μg／ml）を加え、1時間4°Cでインキュベートした。洗浄後、これら肝内 皮細胞を37℃で0〜90分間インキュベートして、前節と同様の方法で細胞中間部 を観察した（観察部位の詳細については図4−1参照）。
結果
前節までの結果（図4−2〜図4−4）は、変性アルブミンがgp30を活性化す ると、変性アルブミンの細胞内分解量を増加させることを示唆している。しかし ながら、この分解増加の過程は現時点で不明である。本節では分解増加の原因が gp30の再利用速度ではないかと仮説をたて検討した。まず、内皮細胞において gp30が内在化後、細胞表面に戻るかどうか確かめる為、 gp30の細胞内移動の観察
と、細胞表面におけるgp30存在量の経時変化を調べた。
図4−5Aは肝内皮細胞におけるgp30の細胞内移動を観察した顕微鏡画像で ある。細胞表面のgp30にAlexa 488標識抗gp30抗体を細胞内移動できない4℃
でまず結合させ、次に内在化を開始させるため37℃でインキュベートした。37℃
インキュベートの開始0分では、gp30は膜受容体として細胞表面に存在していた。
開始から50分の問で、細胞表面にあったgp30の多くが内在化した。50分から90 分の問に内在化したgp30は細胞表面に戻り、再利用されたように思われる。
図4−5Aの結果にはgp30と抗体の複合体が細胞内移動中に解離した可能性 がある。この点を明らかにするため、細胞表面のgp30に結合している古い抗gp30 抗体を除去し、新しい抗gp30抗体で染色することで、細胞表面のgp30存在量を 測定した。インキュベート開始から50分までは、細胞表面におけるgp30存在量 は低下した（図4−5B）。50分から90分間で細胞表面におけるgp30存在量は、
インキュベート開始前の90％にまで回復した。この定量結果は顕微鏡観察の結果
と一致しており、肝内皮細胞においてgp30が再利用される事を強く示している。
次に抗体またはD3アルブミン処理によりgp30が活性化した肝内皮細胞を用い てgp30の再利用について調べた。図4−6は抗体処理した肝内皮細胞表面におけ るgp30存在量の経時変化を示している。 gp30の細胞表面における存在量は0．20 分で減少し、20−50分で回復した。更なるインキュベーションで再利用されたgp30 は再び内在化されることを示唆した。二次抗体を用いた抗体処理に関しては、再 利用カーブが50分で1周したことを示した。再利用速度はgp30の活性化（架橋 形成やチロシンリン酸化；図4−2参照）されているほど上昇していた。培地に
9P30のリガンドがない状態（O mg／ml as negative control）では、細胞表面の9P30
の存在量に有意な変化はなかった。肝内皮細胞におけるgp30再利用における動的 解析は、抗体処理によりgp30が活性化されるほど、 gp30の再利用速度が上昇することを示唆した。
一方、図4−7はD3アルブミン処理により活性化した肝内皮細胞表面におけ るgp30存在量の経時変化を示している。 D3アルブミン（50 mg／ml）処理に関し ては、細胞表面のgp30存在量が、インキュベート開始0−20分において減少し、
開始20分後から回復する傾向を示した。ネガティブコントロールとしてのnative アルブミンは、細胞表面のgp30の存在量に有意な変化は与えなかった。肝内皮細 胞におけるgp30再利用における動的解析は、D3アルブミン処理によりgp30が活 性化される（図4−3参照）ほど、gp30の再利用速度が上昇することを示唆した。
D3アルブミンによる活性化でgp30の再利用速度が上昇するのは、抗体処理によ る効果と一致している。
A
B
（mm）
o
10
30
︵ざ︶︒毎﹂コ＝δΣ雲お二鐵
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80 60
40
20
50
70
（）o
0 20 40 60
Time（min）
30
図4−5 肝内皮細胞gp30の内在
化と細胞表面への移動
（A） 肝内皮細胞の共焦点顕微鏡
観察
コントロールの肝内皮細
胞をAlexa 488標識抗gp30 抗体（3pg／ml，緑）と1時間4°Cでインキュベートし た。洗浄後、これら肝内皮
細胞を示した時間（0，10，30、
50，70， 90分） 37°Cでイン
キュベートした。スケール バーは5μmを示している。
（B）抗gp30抗体の内在化で変 化する細胞表面のgp30存 在量の定量
コントロール肝内皮細胞 を非標識抗gp30抗体 （3
pg／ml） と 0，10，30，50，70，
90分37°Cでインキュベー
トした。これら肝内皮細胞 は酸性緩衝液の洗浄で細胞 表面の抗gp30抗体を除去し た。細胞表面のgp30は、新
しい抗gp30抗体とFITC標識二次抗体で染色した。細 胞表面におけるgp30の免疫 蛍光強度は細胞を回収後、
回収液をマイクロプレート
へ移してFluorlmager 595を
用いて定量した。データは
コントロールのシグナル強
度を100％と設定して算出
した。値は平均値土標準誤
差を示している（n−3）。
咲胤anti gp30 igG（O min）
唖撒撒芝i即：3｛｝1懇G（15麟の
一9 ｝■羅allti gp30茎gG（30nlin）一●一＋secondary IgG
︵ま︶①農お目①匿儒目の三
85毯︒﹄受国020
6・
40
20