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第五節 カベオラ小胞を介したD3アルブミンの
エンドサイトーシス
試薬と実験方法
試薬
filipin、 phenyl arsine oxide（pAO）はSigma社より購入した。その他の試薬は本
論文で関連する各章において述べられている。肝内皮細胞の単離と培養
第三章第三節と同様の方法で行った。
FITC標識アルブミンの取り込み量・分解量
内皮細胞による取り込み量と分解量は前節と同様の方法で測定した。D3アルブ ミンのエンドサイトーシス経路に関しては、カベオラを介するエンドサイトーシ
ス阻害剤であるfilipin（5μ9／ml）（141）やdigitonin（4μM）（132）、クラスリンを介
するエンドサイトーシス阻害剤であるPAO（2μM）（5）を培地に加えて検討した。その他の操作は前節と同様に行った。
共焦点レーザー顕微鏡による観察
LysoTracker（50 nM）とAlexa 488標識D3アルブミン （2μg／ml）を含む培地 Aで、阻害剤のPAOかフィリピン存在下、2時間37℃でインキュベートした。
肝内皮細胞は培地交換後、共焦点顕微鏡により観察した。顕微鏡操作は第三節と
同様に行った。
結果
D3アルブミン分解における輸送小胞
前節では肝内皮細胞におけるD3アルブミンの受容体を介したエンドサイトー シス経路が主にgp18／30を介したものであることを明らかにした。本節ではD3 アルブミンの輸送小胞について検討するため、2種類の阻害剤PAO（クラスリン を介する経路の阻害剤）、filipin・digitonin（カベオラを介する経路の阻害剤）を 用いた。PAOは37℃2時間インキュベートしている間、 D3アルブミンの取り込 み及び分解に有意な阻害効果はなかった。それに対してfilipinとdigitoninはD3 アルブミンの取り込み及び分解において、コントロールの2割になるほど阻害効 果を強く示した（図3−11）。これらの結果はD3アルブミンが細胞表面の受容 体gp18／30に結合した後、カベオラ小胞によるエンドサイトーシス経路を介して、
リソソームで分解されることを示唆している。
尚、共焦点顕微鏡による観察結果（図3−12）は図3−11の定量結果と一 致した。PAO存在下、細胞内D3アルブミン（緑色）はリソソーム（赤色）と同
じ場所に存在した。しかしfilipinではD3アルブミンの蛍光シグナルは無くなっ
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control PAO
filipin digitonin
図3−11 D3アルブミンの取り込み及び分解におけるエンドサイトーシス阻害剤の効果