RATTUS N◎RVEG：CUS
第五節 立体構造の解析
液（pH 7．0）に透析しておいたアルブミン1．8μMを1mmセルで測定した。一方 near−UV領域（250．300nm）の測定では、上記と同様に透析しておいたアルブミン 18μMを1cmセルで測定した。
これらの結果から平均残基楕円率（MRE）を下に示した式より算出した。
MRE＝⑤obs ／ 10 × c × NA × 1
（D obs：観察された楕円率［mdeg］
c：タンパク質濃度 【mol・1−i］
NA：アミノ酸残基数（ラット血清アルブミンは584）
1：セルの長さ 【cm］
タンパク質のヘリックス含量はChenの公式を用いて算出した。
ヘリックス含量 【％］＝ （MRE222−2340）／ 30300
Trp及びANS蛍光スペクトル測定
Muzammi1ら（101）の方法を参考に行った。アルブミンは50mMリン酸ナトリウ ムbuffer（pH 7．0）に透析後、最終濃度1．8μMになるように調製した。 ANSの蛍 光を測定するときはANSの最終濃度が125μMになるように加えた。これらの試 験管を室温で30分インキュベートした。Trpの蛍光はEx280nm Em340nm（スペ クトルはEm300〜400nm）、ANSの蛍光はEx380nm Em470nm（スペクトルはEm400
〜600nm）の条件で測定した。
アクリルアミド消光
Muzammi1ら（103）の方法を参考に行った。18μMの各アルブミン（N1・D2・
D3）ストック溶液、18μMNArAストック溶液、5Mのアクリルアミドストック 溶液を50mMリン酸ナトリウムbuffer（pH 7．0）で調製した。これらのストック 溶液を混合し、希望するアクルリルアミド濃度の1．8μMアルブミンあるいは1．8
μMNArA溶液を調製した。各サンプルのTrp蛍光を測定するために295nmで励 起した。またOMアクリルアミド溶液の各サンプルを300−400nmにおける蛍光ス ペクトルを記録した。そのスペクトルから極大蛍光波長（λMAX）を求め、その 極大蛍光波長における蛍光変化を3回測定した。またこれらの値をStern−Volmer
の関係式（34）
Fo／F ＝ 1 ＋ Ksv［Q］
Fo：アクリルアミド非存在下における蛍光強度 F：アクリルアミド存在下における蛍光強度 Ksv：Stren−Vblmer定数
［Q］：アクリルアミドの濃度
で表した。
尿素誘導変性
尿素誘導変性はTayyabら（157）の方法に従った。18μMの各アルブミンストッ ク溶液、10Mの尿素溶液を50mMリン酸ナトリウムbuffer（pH7．0）で調製した。
これらのストック溶液を混合し、希望する尿素濃度の1．8μMアルブミン溶液を 調製した。これらの試料を励起波長280nm蛍光波長340nmで3回測定した。
プロテアーゼ感受性分析
トリプシン消化はSchneebergerら（134）、 Lottspeichら（83）の方法を一部変更して
行った。まず各アルブミン（N1， D2，D3）を50mMリン酸ナトリウム（pH 7．8）に透析した。これらのアルブミン（1mg／m1）をTpCK treated trypsin（0．01mg／ml）
で37℃で消化した。0，5，15，30，60，100分後に酵素反応を止める為、trypsin inhibitor
（3．4mg／ml）を加え、更に変性剤（3％SDS、1．2％2．メルカプトエタノール）を 加え、10分間煮沸処理した。各試料10μgをゲル濃度12％のSDS．pAGEにかけ た。泳動後のゲルはSYPRO Orangeで染色し、オリジナルバンドを蛍光的にボリ
ューム解析した。
結果
図2−13（a）はpH 7．0における3種類のアルブミンのfar−UV領域におけるCD スペクトルを示している。222nmにおけるMRE値はN1アルブミンが一26．15、 D2
アルブミンが一12．88、D3アルブミンが一1．26、 M．Albが一13．11であった。 Chenによ る二次構造予測を使うとαヘリックス含量は74．38％、32．71％、，3．77％、32．44％
とそれぞれ求まった。αヘリックスはN1アルブミンに比べてD2アルブミンと M−Albは半分であり、 D3アルブミンは全く認められなかった。 N1アルブミンの スペクトルはαヘリックス構造に特徴的な2っの極小値208、222㎜を持ってい ることが観察された。
N1， D2， D3の各種アルブミンの三次構造における違いは、 near−UV領域におけ
るCD測定で調べた。図2−13（b）は250−300nmの波長において記録した各アル ブミンのnear−UV領域CDスペクトルを示している。N1アルブミンのスペクトル から芳香族発色団やジスルフィド結合に特徴的な277、285nm付近の2つの極大 値、及び262、268nmの2つの極大値が観察された。 D2、 D3アルブミン、 M−AlbはN1に比べて正に増加していた。
D2， D3アルブミンの構造情報を更に得る為、これらタンパク質のTrpとANS 蛍光及びアクリルアミド消光を測定した。表2−1はN1、 D2、 D3アルブミンの 蛍光パラメーターのまとめである。Trp蛍光強度はN1アルブミンと比較してD2 アルブミンは1．6倍、D3アルブミンは6．4倍に増加した。 ANS蛍光強度はN1ア
ルブミンと比較してD2アルブミンは1．6倍、D3アルブミンは0．3倍に増加した。
消光スポットの最小二乗法の傾きにあたるKsvはTrpの異性体NArAが19．0で あった。D2アルブミンはN1アルブミンと近似していたが、 D3アルブミンはN1 アルブミンよりも約1．4倍であった。尚NATA、 N1、 D2、 D3アルブミン全てにお いて、Trp蛍光強度とアクリルアミド濃度の相関係数が0．95以上であった。
図2−14は3種類（N1、 D2、 D3）アルブミンのTrp蛍光における尿素処理 の影響を示している。N1とD2アルブミンのunfoldingカーブは4Mの尿素付近 で急激に減少し、9Mまで少し上昇している。しかしながらD3アルブミンは尿 素処理で影響はなかった。
N1， D2， D3アルブミンのプロテアーゼ感受性はトリプシンによる消化で評価 した。図2−15よりN1アルブミンがほとんど、もしくは全く消化されていな い様子が観察できた。それに対しD2、 D3アルブミンは明らかに感受性の高いこ とが観察された（消化反応100分後に50％、20％以上を消化）。またN1，D2アル ブミンが67kDaである（図2−15（a、 b））のに対し、 D3アルブミンは75kDa であった（図2−15（c））。
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