血 合
K. Wは間接法(HPLC法)と直接法(フラスコ法およびジェネレータカラム法)により測定されるo 間接法は測定対象物質の類似物質に対して信頼性のあるW値が存在すれば､簡便かつ信頼性の
6.6 オククノール/水分配係数(H.Y)の測定
6.6.3 測定方法
6.6.3.1 HPLC法
間接測定法であるHPLC法は､逆相系分析カラムに対する測定物質の保持時間(tR)からK.W を求める方法である.その適用範囲はlogK.Wで0‑6と広く､また､簡便にK.Wを求めることが できる点が長所である.しかし､測定に必要な基準物質の選択を間違えると誤ったK.Wになるこ
とから､適切な基準物質の選択が必要という短所もある｡本研究では､基本的にOECDのテスト ガイドライン6に従った｡測定に使用するHPIJCは溶解度測定と同様のHPLCシステムである｡
HPLCの分析条件は､下記のとおりである｡逆相系分析カラムには､溶解度測定と同じスペック のWatersのp‑Bondapack C18カラムを用いた｡移動相も溶解度測定と同様の高純度水(もしく はpH 3.0のNaC104水溶液) /メタノール混合水溶液である.ただし､どの物質の分析に対して
もその混合比はl:3と固定した｡
まず､線形関係を得るために基準物質のJRを測定し､式6.16のように上｡(保持しない時間)から保 持容量kを求めた｡
k =立二ム
Jo
(6.16)
t.はFAMDの保持時間とした.得られたkの対数値logkと既知のlogK.Wを図6.17のように プロットして線形関係を確認し､式6.17中のaとbを最小二乗法により求めた｡
logKow =alogk+b
次に､測定物質のtRを測定してkを求め､式6.17‑代入してK.Wを求めたo
(6.17)
6.6.3.2 フラスコ法
直接測定法であるフラスコ法は､測定物質をオクタノール/水2相系に溶かし､分配平衡後の水 相とオクタノール相モル濃度(それぞれ､ CwとC｡)からK.Wを求める方法である｡本研究では oECDのガイドライン7を参考にして､図6.18のようにK.Wを測定したo まず､あらかじめ高純 度水にオクタノールを適量入れて擾拝し､オクタノール飽和水を調製した｡その水溶液20mLを 50mLの褐色のフラスコ‑移した｡次に､オクタノール溶液に測定物質を0.1‑1g･L 1程度の濃度 になるように溶解させたo そのオクタノール溶液2mLを褐色のフラスコの中‑注いだ.その後､
三角フラスコに栓をして25℃の水恒温槽に浸し､フラスコ内の溶液をマグネチックスターラーに よって1.5cm程度の渦ができる程度に摸拝した｡平衡時間は4時間とし､ 4時間後に二相溶液を 遠心管‑移して､遠心分離器MX‑300 (TOMY)を用いて相分離を行った｡遠心分離の条件は､
40分で9000×gとした｡相分離後､シリンジを用いて各相から溶液をサンプリングした｡ HPLC による濃度分析条件は､水‑の溶解度の測定と同じ条件とした｡また､解離性の物質の測定の際 には､やはりpH3.0の高純度水を用いた｡
オクタノール飽和水と 測定物質を溶解させたオク
タノール溶液を10:1で混合
獲拝しながら分配平衡化(4時間) 遠心分離:
9000×g, 40分
オクタノール相を HPLCにて分析
水相をHPLCに
て分析
図6.18 フラスコ法によるlogK.Wの測定手順
6.6.3.3 ジェネレータカラム法
ジェネレータカラム法は､図6.19のようにSwの測定で用いたジェネレータカラム法とほぼ同 じであるが､大きな違いが3点あり､ 1点目は､ジェネレータカラムの作成方法である｡ Swの測 定では､固体の測定物質をガラスビーズに担持させたが､ K.Wの測定では､測定物質を水飽和オ
クタノール溶液‑溶解させ､疎水処理したガラスビーズ(chromosorbAWA‑DMCS Chromatography
ResearchSupplies)にそのオクタノール溶液を保持させてカラムに充填することによりジェネレー
タカラムを作成した｡ 2点目は高純度水ではなく､オクタノール飽和高純度水をジェネレータカ ラム‑通液することである0 3点目は､ジェネレータカラムから流出するマイクロエマルション を除去するために､ジェネレータカラムの後段に疎水処理したビーズとガラスウールを充填した
ミニカラムを取り付けた｡ 3点目は技術的に非常に重要であり､このカラムを装着しないと測定 は不可能であった｡
113
I 'artl:分配平衡部【Part2:濃縮部 I 劔冪art3:濃度分析部
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ル飽和水
±±≡̲ 移動相
‑弓軒:オクタノール飽和水の流れ
.日.■‑ :移動相の流れ
A:デガッサ,B:デュアルプランジャーポンプ,C‥水恒温櫓,D‥ジェネレータカラム,E‥テープ ヒーター(温度制御), F:抽出カラム, G:空気恒温槽, H:六方バルブ, I:フラクションコレク
ター,I:分析カラム, K: HPLCポンプ,L: HPLCデガッサ,M: UV検出器, N:インテグレータ‑､
0:ミニカラム
図6,19 K.W測定用のジェネレータカラム法(DCCLC法)
カラム内で分配平衡に達して､溶出してきた水相の濃度は､乱の測定におけるDCCLC法と同
様に抽出カラムが付随したHPLCシステムにより分析した｡しかし､ 2,2',4,4',5‑PeBDEや 2,2,,4,4,,5,5,‑HxBDEの場合には､ DCCLC法では濃縮時間が数時間から10時間ほど必要になるた め､より低濃度を分析可能な電子捕獲型検出器を有したガスクロマトグラフGC‑ECDもしくはガ スクロマトグラフ質量分析計GC‑MSをHPLCの代わりに用いた｡本研究では､ 4臭素化以上の pBDEsとHBCDの測定ではGC‑ECDもしくはGC‑MSを用いた｡具体的な測定手法については下 記に述べる｡図6.20のように､ジェネレータカラム内で分配平衡に達して溶出してきた水相をセ ップパックに通液した｡用いたセップパック(Waters社)はPBDEsに対してPS‑2を､ HBCDに 対してはC‑18を使用した｡通液時間は分配係数のレベルによって様々であるが､短い場合には 20分程度､長い場合には240時間程度とした｡次に､溶質を吸着したセップパックをN2パージ にて乾燥させ､溶質を‑キサンもしくはトルエンによって溶離させた｡ 2,2'4,4'‑TeBDE と 2,2,,4,4,,5‑PeBDEの場合は溶離液をそのままGC‑ECDで分析し､セップパック中の溶質の量を決
定した0 2,2,,4,4',5,5'‑HxBDEとDeBDEの場合には溶離液を0.2からo･5mL ‑濃縮し､ GC‑ECDにて溶質の量を決定した｡ HBCDの場合には､溶離液を直接ガスクロマトグラフ質量分析計で分
図6.20 GC‑ECDおよびGC‑MSを用いたジェネレータカラム法
表6.18 4‑6臭素化PBDEsの分析条件
分析装置: Aglilent6890 (Agilent)
検出器: ECDカラム: DB‑17MS 0.25mmIDx30
mxO.15pmキャリヤー: N2
オープン: 130℃ (2min
holdh20℃/min..･2 8 0 ℃ (16.5min hold)
注入口温度: 250℃
検出器温度: 300℃
注入量: 4lll
6.6.4 測定結果と考察 6.6.4.1 HPLC法のK.Y測定
HPLC法では､ BPhsとpBBzsのlogKowを測定したo式6.17のパラメータaとbを得るための 基準物質として､クロロフェノール類(cphs)とクロロベンゼン類(CBBzs)を用いた｡これらの 基準物質をHPLCで分析して保持時間板を求めて保持容量kを算出した｡得られたlogkに対して logKLwの文献償6,1125をプロットした.プロットから良好な相関関係が得られたので､フィッティ ングを行いBPhsおよびPBBzsの測定に必要な式a tbを求め､表6.19にまとめた｡次に､ BPhs とpBBzsをHPLCで分析L kを求めて式6.17に代入した結果を表6.20aとb示すo BPhsに関し
115
ては､測定値は0.26の範囲内で文献値と良好に一致した｡また､ pBBzsに関しては､測定値は0･17 の範囲内で文献値と良好に一致し､ HPLC法で得られた値は妥当であることがわかった0 I,2,4‑TrBBzおよびPeBPhのK.W値には既往の文献に実測値がないことから､本研究によって初め て信頼性のある実測値を提供したことになる｡ BPhsとPBBzsの臭素数の効果として､臭素数が 増えるとPBBsのlog K.Wが大きくなり､疎水性が増すことがわかったo BPhsとPBBzsに対して 臭素の置換基効果を計算したところ､ BPhsに関しては1臭素あたりlogK.Wが0･66増加し､ PBBzs に関しては1臭素あたりlogK.Wが0.6 1増加したo BPhsとpBBzsは共にほぼ同等の置換基効果を 有していた｡
表6.19 基準物質から求められた式6.2のパラメータと相関係数
基準物質 式6.2のパラメータ(aとb)ど相関係数(r)CPhs a=2.91､ b‑3.84､ ∫‑0.997
cBzs a=2.76､ b=3.09､ r=0.996
表6.20a HPLC法によるBPhsのlogK.Wの測定結果
tR (平均) logk logK.w lo醗W (文献値‖ )
4‑MoBPh
2,4‑DiBPh 2,4,6‑TrBPh P5BPh3.98 ‑0.42
5.04 ‑0.12
6.81 0.13
12.00 0.50
2.62 3.48 4.23 5.30
表6.20b HPLC法によるPBBzsのlog&Wの測定結果
2.59 3.22 4.13
na
tR (平均) logk logK.w logKow (文献値1 ))
1 ,4‑DiBBz 1 ,2,4‑TrBBz 1 ,2,4,5‑TeBBz
7.42 0.19
1 0.96 0.45
17.11 0.69
6.6.4.2 フラスコ法
フラスコ法はlもしくは2臭素化PBDDs/Fsにしか適用できないことから､フラスコ法の実験 では､測定法を確立することが主な目的である｡まず､フラスコ法の信頼性のチェックを行った｡
EPAやoECDのテストガイドライン4･7では､フラスコ法の有効適用範囲は､ logK.Wが‑2から4 である0本研究では､ベンゼン(文献値:2.1325)とナフタレン(文献値:3.3726)を基準物質とし て､これらのlogK.Wを測定したo測定結果を表6.21に示す｡測定値は文献値と良好に一致し､本 研究のフラスコ法で信頼性のあるデータを取得できることを確認した0
信頼性を確認できたことから､ 4‑MoBPhと2,4‑DiBPhのlogK.Wを測定した｡測定結果を文献値 およびHPLC法で得られた結果と共に表6.24に示す｡フラスコ法の実測値は､文献値およびHPLC 法で得られた実測値と良好に一致した｡したがって､フラスコ法の測定法は確立できたと考えら れる｡また､この結果はHPLC法の信頼性を保証する結果でもある0
衰6.21フラスコ法によるベンゼン(Bz)とナフタレンPAPH)のlogK.Wの測定結果
標準物質 水相の濃度/オクタノール相 logK.w logK.W(文献mg･L‑1 の濃度/ mg･L 1 25,26)
Run l慧鞘
NAPH Run 1 Run2 Run3
平均
4.55 619
4.23 565
4.52 604
0.348 862 0.287 877 0.236 883
3 3 3 3
= = =日日 =
2 2 2 2
n7 0ノ 7 00 3 4 5 4 3 3 3 3
3.37
表6.22 フラスコ法およびHPLCによる4‑MoBPhと2,4‑DiBPhのlogK.Wの測定結果
化合物と測定数 logK.w logK.w logK.W (文献値1 1)
(フラスコ法) (HPLC法)
∠U 4 0ノ ′○
∠U ∠U /hV /LU 2 2 2 2
3 3 7 4 5 5 5 5 3 3 3 3
2.59
6.6.4.3 ジェネレータカラム法によるPBDEsのH.W測定
まず､フェナントレン(PHE)やトリフェニルアミン(TPA)の測定を行い､再現性を確かめるとと もに文献値Il･25と比較し､本研究で用いたジェネレータカラム法の信頼性をチェックしたo実測 値を図6.21および表6.23に示す｡これらの図表より､実測値は再現性も高く､文献値と同等の値 が得られ､本研究で用いたジェネレータカラム法について信頼性が高いことを確認できたo
0 50 100 150
測定時間
図6.21フェナントレンのK.W測定における再現性
▲:Run l､ ロ:Run 2､ 0:Run 3
表6.23 ジェネレータカラム法によるフェナントレンとトリフェニルアミン
のlogKowの測定結果化合物 免 tｲ蚌 logK.W(文献値) Vb
phenanthrene 釘緜" 4.57 b
triphenylamine 迭緜 5,74 免ﾂ
測定方法の信頼性が確認できたことから､ logK.Wの測定を行い､ TBBP‑A､ PBDEsおよびHBCD