実験手順

3.3.1. 水酸アパタイトペレット

第2章で作製したHAペレット「dense-HA」「100-nm fiber」「50-nm fiber」「30-nm fiber」「25-nm needle」「20-nm needle」「25-nm flake」「80-nm sheet」を細胞実験に使用した．ナノ構造HA についてはあらかじめ第2章2.3.3.2.の方法で洗浄した．

3.3.2. 培地の作製

E-MEM粉末1.88 gを超純水200 mlに溶解させ，121°Cで15分間オートクレーブ滅菌を

行った．室温まで冷却後，FBSを20 ml加え，さらに3％ L-glutamine水溶液2 ml，7％ 炭 酸水素ナトリウム水溶液 10 ml をそれぞれ濾過滅菌して無菌的に加えた．作製した培地は 4°Cで保管し，1日以上静置してから使用した．

3.3.3. PBS（－）の作製

PBSタブレット2錠を200 mlの超純水に溶解させ，121°Cで15分間オートクレーブ滅菌 した．作製したPBS（－）は4°Cで保存した．なお，PBS（－）とはDulbecco が開発した

Dulbecco PBSの組成[24]から，カルシウムとマグネシウムを除いたものである．

3.3.4. ラット骨芽細胞様細胞の作製

ラット骨芽細胞様細胞（骨芽細胞）はラット骨髄由来間葉系幹細胞（rat mesenchymal stem cell, RMSC）から分化誘導して作製した．

解凍したRMSCを培地中に分散させ，900 rpmで5分間，室温で遠心分離した．得られた 細胞ペレットを培地中に再分散させ，血球計算盤を用いて細胞数を計数した．RMSCを 24 wellディッシュに1.0 * 10⁴ cell/wellで播種し，37°C，5％CO₂下で培養した．翌日，位相差 顕微鏡にてRMSCがwellの底部に接着・伸展していることを確認し，分化誘導を開始した．

培地100 mlに骨芽細胞分化サプリメント（有効成分として主にdexamethasoneを含有）5 ml

を加えたものを分化誘導用培地とし，培地の代わりに分化誘導用培地を用いて細胞培養を 継続した．2 日に一度，分化誘導用培地の全量交換を行いながら20日間培養し，分化誘導 を完了した．得られた骨芽細胞はカルシウム蓄積能を獲得しており，well底面に白色の沈着 物が見られた（図3.1a）．一方で，分化サプリメントを投与しなかった非誘導群では沈着物 は確認できなかった（図3.1b）．沈着物はカルシウム定量分析の結果，カルシウム化合物で あることが確認された．骨芽細胞は培地中で，継代を行いながら37°C，5％CO₂下で維持し た．

図3.1 RMSCの分化誘導に使用したwell (a)と，非誘導群を培養したwell (b)の底部．矢印 はカルシウムの沈着．

3.3.5. 水酸アパタイトペレット上への骨芽細胞の播種

細胞播種の前日，HAペレットおよび細 胞実験に使用する器具は132°Cで15分間 オートクレーブ滅菌を行った．その後，

HAペレットを1枚ずつ4 wellディッシュ の底面に設置し，培地を500 µlずつ加え

て 37°C，5％CO₂下に一晩静置して前培

養とした．翌日，well 内の培地をすべて 除去した後，HAペレット上にテフロンチ ューブ（大・小）を設置し，細胞培養の 有効面積を直径10 mmに限定した．T-75 フラスコで培養した骨芽細胞はトリプシ ン処理で剥離したのち，遠心分離（1000

rpm，2分，室温）で回収した．回収した

細胞を新しい培地中に再分散させ，血球 計算盤で細胞数を計数した．骨芽細胞は 500 µlの培地とともに，1.0 * 10⁴ cell/well の濃度で各wellに播種した（n = 2）（図 3.2）．また細胞数を求めるための検量線

を引くため，4箇所のwellの底面にそれぞれ，細胞濃度1.0，2.0，4.0，8.0 * 10⁴ cells/well で骨芽細胞を播種した（HA，テフロンチューブなし）．播種した細胞は37°C，5％CO₂下で 1日，および4日間培養した．

図3.2 4 wellディッシュと細胞播種の様子．

3.3.6. MTT assay

培 養 後 の 生 細 胞 数 は MTT assay で 決 定 し た ． MTT assay は ， 黄 色 の MTT

（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide）が生細胞内のミトコンドリアの 呼吸鎖の作用により紫色のフォルマザン（formazan）化合物に変化する生体内反応を利用し た，生細胞数分析法である（図3.3）．

図3.3 MTT assayの機構．

細胞を培養した後，well内からテフロンチューブと培地を除去し，PBSで2回洗浄した．

その後well中にPBSを300 µl加え，MTT溶液「dye solution」を60 µlずつ添加し，静かに

混合した．37°C で 4 時間静置した後，生成したフォルマザン結晶を溶解させるため

「solubilization solution/stop mix」を400 µl加え，37°Cでさらに1時間静置した．その後混

合溶液を600 µl回収し，750 nmの吸光度を副波長として570 nmの吸光度を測定した．得ら

れた吸光度は検量線をもとに細胞数に換算した．

3.3.7. ALP assay

骨芽細胞の骨形成活性はALP assayで評価した．ALP（alkaline phosphatase）は骨芽細胞が 特徴的に発現する膜タンパクの一種である．ALP は脱リン酸化酵素であるため，リン酸系 の有機化合物を作用させその脱リン酸化反応を観測することで，酵素活性を定量すること が可能である．一般的にはpNPP（p-nitrophenyl phosphate）を骨芽細胞に作用させALP発現 量を定量する手法をALP assayと呼んでいる（図3.4）．

図3.4 ALP assayの機構．

細胞を培養した後，well内からテフロンチューブと培地を除去し，PBSで2回洗浄した．

その後well内にpNPP溶液を350 µl加え，37°Cで静置した．1時間後，1 M NaOHを350 µl

加えて酵素反応を停止し，混合液を600 µl回収して吸光度を測定した．吸光度は，500 nm の吸光度を基準として405 nmの吸光度を測定した．

3.3.8. 凍結乾燥

HAペレット上に接着した細胞の形態をSEMで観察するため，細胞をHAペレットごと 凍結乾燥した．細胞を培養した後，well内からテフロンチューブと培地を除去し，PBSで2 回洗浄した．PBS を除去した後2.5％グルタルアルデヒド/PBS を加え，20分インキュベー トして細胞を固定化した．グルタルアルデヒド溶液を除去し，PBSで2回洗浄した後，20，

50，80％エタノール水溶液を加えそれぞれ15分間インキュベートして細胞を段階的に脱水

した．その後100％エタノールで細胞を一度洗浄した後，新たに100％エタノールを加えて 30分インキュベートし，細胞を完全に脱水した．エタノールを除去し，t-ブチルアルコール で一度洗浄した後，新たにt-ブチルアルコールを加えてインキュベートすることで細胞内の エタノールをt-ブチルアルコールに置換した．15分後，t-ブチルアルコールを新しいものに 入れ替え，冷凍庫で凍結させた．凍結した細胞は凍結乾燥した後，オスミウムコートを 5 秒間施した．

3.3.9. 蛍光染色

ペレットに接着した細胞の接着状態を蛍光顕微鏡で評価するため，細胞を 2 色に蛍光染 色した．細胞骨格タンパクである F-アクチンは，タマゴテングダケ由来のタンパク毒「フ ァロイジン」を赤色蛍光色素ローダミンで標識した「ローダミンファロイジン」を用いて 染色した．また，接着斑の裏打ちタンパクの一であるビンキュリンを染色するため，免疫 組織化学染色を行った．

免疫組織化学染色は，免疫系で働く「抗体」を用いて生体組織を分子レベルで染色する

技術である．抗体は決まったタンパク質に特異的に結合する能力を持っている．例えば抗A 抗体はタンパク質 A に特異的に結合する抗体である．本研究では，細胞内のビンキュリン を染色するために抗ビンキュリン抗体を細胞に投与した．この抗ビンキュリン抗体は緑色

蛍光色素FITC（Fluorescein Isothiocyanate）で標識されているため，ビンキュリン分子のみ

を蛍光観察することが可能になる（図3.5a）．ただし FITC は褪色しやすく綺麗な像を得ら れないことがあるため，さらにもう 1 種類の蛍光標識抗体を作用させ，連結することで蛍 光を増強した．抗ビンキュリン抗体の実態はIgG（Immunoglobulin G）という種類のタンパ ク質であるため，抗IgG 抗体を共存させると，抗 IgG抗体は現在ビンキュリン分子に結合 している抗ビンキュリン抗体に結合する（図3.5b）．今回用いた抗IgG抗体は耐褪色性に優 れた緑色蛍光色素 Alexa Fluor 488 で標識されている．つまりこれでビンキュリン分子を

FITCとAlexa Fluor 488の二種類の蛍光色素で染色したことになる．

図3.5 免疫組織化学染色の機構（Vin: Vinculin, Pax: Paxillin, Tal: Talin, FAK: Focal Adhesion

Kinase）．（a）はビンキュリンに対しFITC標識された抗ビンキュリン抗体が結合した様子を，

（b）は抗ビンキュリン抗体に対してAlexa標識された抗IgG抗体が結合した様子をそれぞ れ示している．

今回使用したローダミンは赤，FITCおよびAlexa Fluor 488は緑の蛍光を発するため，細 胞は2重染色されたことになる．実際の染色は以下の手順で行った．

・細胞を培養

・well内からテフロンチューブと培地を除去し，PBSで2回洗浄

・2.5％グルタルアルデヒド/PBSを加え，20分インキュベート（細胞の固定化）

・グルタルアルデヒド溶液を除去し，PBSで2回洗浄

・0.1％ Triton X-100/PBSを加え，15分インキュベート（細胞の可溶化）

・細胞をPBSで2回洗浄

・ブロッキング溶液（1.0% BSA /PBS，0.1% Tween 20および0.02% アジ化ナトリウムを 含有）を加え，30分間インキュベート（ブロッキング）

・ブロッキング溶液を除去

・ローダミンファロイジン／ブロッキング溶液（1 U/ml）を加え，遮光下で1時間静置

・細胞をブロッキング溶液で2回洗浄

・抗ビンキュリン抗体をブロッキング溶液で50倍に希釈したものを加え，遮光下で1時 間静置

・細胞をブロッキング溶液で2回洗浄

・抗IgG抗体をブロッキング溶液で400倍に希釈したものを加え，遮光下で30分静置

・細胞をブロッキング溶液で2回洗浄

・観察までブロッキング溶液内で保管

蛍光染色した細胞は，蛍光顕微鏡で直ちに観察を開始した．

3.3.10. アポトーシスの検出

細胞死は「ネクローシス（necrosis）」と「アポトーシス（apoptosis）」の 2 つに大きく分 類される．ネクローシスとアポトーシスの定義や機構については今なお研究途上だが，一 般的にはネクローシスとは物理的または化学的な外的要因による細胞死をいう．例えば物 理的な力や酸・塩基の作用で細胞膜が破壊され，その結果細胞死が起こったならばそれは ネクローシスと分類される．それに対し，アポトーシスは「プログラム死」とも呼ばれ，

周辺環境の変化に応じて細胞が自殺することをいう．例えば，接着性細胞が足場を失い浮 遊状態のままでいると，細胞はやがてアポトーシスを起こす（足場喪失によるアポトーシ スは特にアノイキス（anoikis）と呼ばれる）[25-26]．アポトーシスの引き金となる現象（例 えば足場を失うことなど）が発生すると，細胞の中で一連の連鎖反応（cascade）が起こる[27]．

すなわち，ある酵素Aが活性化し，酵素Aが酵素Bを活性化させ，酵素Bが酵素Cを活性 化させる……といった反応であり，この反応が完結するとアポトーシスが発生し，細胞死 が起こるとされている．この連鎖反応に関わる酵素の中で，caspase が重要な役割を担って いることが知られている[28-30]．また，このcaspaseの発生の有無で，細胞がアポトーシス を起こしているか否かを知ることができる[31]．

本研究では，活性型caspase 3および7の検出キットであるSR-FLICA Apoptosis detection kit

Caspase assayを使用し，細胞のアポトーシスを検出した．FLICA（Fluorochrome Inhibiter of

Caspase）は赤色の蛍光を発するcaspase阻害剤であり，活性型caspase 3および7を発現し

ている細胞を選択的に蛍光染色することができる．実際の実験は以下の手順で行った．

・「10xバッファ」を必要量だけ純水で10倍に希釈し，1xバッファとした

・「FLICA」を50 µlのDMSOで溶解し，150x FLICA溶液とした