【解説】
バラの主要香気成分である2-フェニルエタノールは，アミノ
酸L-フェ ニ ル ア ラ ニ ン か ら 生 合 成 さ れ る．重 水 素 標 識 化L-
フェニルアラニンをバラへ投与することで，バラにおいて2- フェニルエタノールは夏季と冬季で異なる経路によって生合 成されていることを明らかにした．季節に応じて植物二次代 謝産物の生合成経路がシフトする現象は報告例がない．本解 説ではバラにおける2-フェニルエタノール生合成経路シフト の発見の経緯と最近の知見を紹介する．
花の香りと香気成分
香りはフレーバーやフレグランスとしてわれわれの生 活に密接に結びついており，古くは古代ギリシャ・ロー マ時代からその芳しい香りで多くの人々を魅了し続けて きた．花の香りは スウィート ， フローラル ， グ リーン などさまざまな言葉で表現され，複数の香気成 分が混合されることにより構成されている．現在，植物 の香気成分は1,000種類以上報告されている．バラ，
ジャスミン，ライラックなどは豊かな芳香を放つことで 知られており，商業的に重要な花きである．バラから発 散される主要な香気成分は，2-フェニルエタノール，ベ ンジルアルコール，2-フェニルエチルアセテートなどの 芳香族化合物，ミルセン，シトロネロール，ネロール，
リナロールなどのモノテルペン化合物，香りの閾値が低 く特徴的な香気を有するローズオキサイド，
β
-イオノン などである（図1）．これら多様な化学構造を有する香 気成分は，植物自身にとって重要な生理学的意義をもつ ことが報告されている．植物香気成分の環境との相互作用
植物は運粉者や草食昆虫などの周囲の環境と相互作用 するために香気成分を発散する．ダイズは草食昆虫の食 害を受けると，（ ）-
β
-ファルネセン，（ ）-α
-ベルガモテ ンなどのテルペン化合物を発散し，これら揮発成分が草 食昆虫の天敵であるカリバチを誘引することで間接的な 防御システムを構築している（1）．また，タバコは（ ）-2- ヘキセナール，（ ）-3-ヘキセン-1-オール，（ ）-3-ヘキセ ニルアセテート，（ ）-3-ヘキセニルブチレート，（ ）-3-香りの生合成経路が季節によって変わる
平田 拓，大西利幸，渡辺修治
Roses Shift Biosynthetic Pathways of Floral Scent in Response to Seasonal Change
Hiroshi HIRATA, Toshiyuki OHNISHI, Naoharu WATANABE, 静岡大学創造科学技術大学院
ヘキセニルチグレートなどを発散し，タバコガを忌避す ることで直接的に食害を防いでいる（2）．
さらに植物は香気成分を発散することで運粉者（動 物，昆 虫） を 誘 引 す る．ラ ン 科 植 物 （
） は，C19‒C21 のアルカンやアルケン類を発散する ことにより運粉者であるミツバチの雌を誘引しているこ とが生物電気検出器を装着した GC-EAD （Gas Chroma- tography-Electro Antennographic Detection） による解 析で明らかになっている（3）．また，交尾期ではない雌が 交尾を回避する目的で発散するファルネシルヘキセン酸 メチルが，受精成立後のランからも発散される．このよ うにして成熟過程にある未熟種子への運粉者による機械 的傷害を最小限に抑制している（4）．さらに運粉者に対す る誘引作用だけでなく，運粉者ではない昆虫を忌避する 役割も果たしている（5）．このように植物が発散する香気 成分は昆虫や病原体に対する化学防御機構や生殖にかか わる重要なケミカルツールの一つである．
近年，香気成分の昆虫に対する誘引作用について調べ るために，遺伝子組換え植物を用いた解析が進んでい る．（3 ）-4,8-ジメチル-1,3,7-ノナトリエン （（ ）-DMNT）
生合成系における中間体である （3 ）-（ ）-ネロリドール の合成酵素であるリナロール/ネロリドール合成酵素を 過剰発現させたシロイヌナズナでは，（ ）-DMNT発散 量が増加し，さらに草食性昆虫の捕食者であるカブリダ ニの一種をより多く誘引する（6）．このように香気成分の
「生合成」に関する知見を研究の基盤として，自然界に
おける香気成分の生態学的役割が明らかになりつつあ る．
ケミカルプローブを用いた2-フェニルエタノールの 生合成研究
多様な骨格を有する揮発性化合物のうち，テルペン化 合物は，細胞質のメバロン酸経路と色素体のメチルエリ ストールリン酸経路から作られるイソペンテニルピロリ ン酸とそのアイソマーであるジメチルアリルピロリン酸 を初発物質として生合成され，芳香族化合物であるフェ ニルプロパノイド／ベンゼノイドは主としてシキミ酸経 路を経由して生合成される．また窒素や硫黄を含む揮発 性化合物はアミノ酸やその前駆体に由来する（7）．
バラの主要な香気成分である2-フェニルエタノールは 甘くまろやかな香調を有し，バラの香りを特徴づける重 要な香気成分の一つである．しかし，2-フェニルエタ ノールの生合成経路は20世紀末まで未解明であった．
われわれは有機反応機構と生化学の教科書にあるアミノ 酸の代謝経路を基に，l-フェニルアラニンから2-フェニ ルエタノールへ至る可能性のある4つの経路およびその 中間体の構造を推定した（8） （図2）．重水素標識体l-フェ ニルアラニン（l-［2H8］フェニルアラニン）を無傷状態 のロザ・ダマセナやロザ・ 芳純 の花の基部（ガクの 直上部に木綿糸を通してその両端をl-［2H8］フェニルア ラニンの水溶液に浸漬した）に投与することにより，発 散された［2H ］-2-フェニルエタノールの標識パターンと
図1■バラの香気成分
仮想した重水素の保持パターンを比較検討することで，
生合成経路の解明を試みた（図3A, B）．重水素標識化
さ れ た2-フ ェ ニ ル エ タ ノ ー ル の 生 成 比 率 は / 130/129/128 （［2H8］/［2H7］/［2H6］-2-フ ェ ニ ル エ タ ノ ー ル）＝75/20/5を示し，フラグメントイオンであるベン ジルカチオンも / 98が主要 （75%） であったことか ら，［2H8］-2-フェニルエタノールが主要に生合成される との知見を得た（図3C）．1H-NMR解析から，実験に使 用 し たl-［2H8］フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン のl-［2,3,3,2′,3′,4′,5′,6′-
2H8］フェニルアラニン（l-［2H8］フェニルアラニン）/l-
［3,3,2′,3′,4′,5′,6′-2H7］フェニルアラニン（l-［2H7］フェニルア ラニン）/l-［2H6］フェニルアラニン比率は83/16.5/0.5で あった．このことから，2-フェニルエタノールはl-フェ ニルアラニンの
α
位の水素を保持したまま生合成され た．ロザ・ダマセナ，ロザ・ 芳純 で生成が確認された
［2H8］-2-フェニルエタノールから，仮想中間体として
［2H8］フェニルアセトアルデヒドが想定された（図2経 路a, b）．その後，われわれは酵素活性を指標にバラ花 弁から芳香族アミノ酸脱炭酸酵素 （AADC） とフェニル アセトアルデヒド還元酵素 （PAR） の2種類の酵素を単 離・同定した．これらの酵素反応の解析から，l-フェニ ルアラニンは好気的条件下でAADCによってフェニル アセトアルデヒドへと直接変換され，さらにPARが触 媒する還元反応によって2-フェニルエタノールが合成さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た（9, 10） （図2経 路a, AADC- PAR経路）．
図3■バラ無傷植物を用いたL［- 2H8］フェニルアラニン投与実験
（A） ダイナミックヘッドスペース法による香気捕集．（B） バラ無 傷植物への木綿糸を介した（wick feeding 法）l-［2H8］フェニルア ラニン溶液の投与．（C） ［2H ］-2-フェニルエタノールのGC-MS分 析．図中の ʻDʼは重水素 （Deuterium） を表す．
図2■L［- 2H8］フェニルアラニンから
［2H］-2-フェニルエタノールへの仮 想生合成経路と重水素標識パター ン（8, 9）
［2H7］-2-フェニルエタノールの発見
前述のロザ・ダマセナは，4月下旬から5月上旬にし か開花せず，また ロザ・ 芳純 は真夏と真冬の時期に は花をつけない．そこで1年を通して安定的にバラ花弁 を入手するために，切り花として通年入手可能であるロ ザ・イブピアッチェ （ ʻYves Piagetʼ） を用いて実験 を行った．また鉢植えや切り花への重水素標識化合物投 与実験では，l-［2H8］フェニルアラニンの取り込み・変 換効率に課題があったため，ロザ・イブピアッチェの花 弁から調製したプロトプラストを用いてl-［2H8］フェニ ルアラニンの投与実験を行った（11）．一年を通してロ ザ・イブピアッチェ花弁から調製したプロトプラストへ のl-［2H8］フェニルアラニン投与実験を行うと，驚くこ とに11 〜 4月の冬季と5 〜 10月の夏季に採集したバラ 花弁由来プロトプラストでは，得られた ［2H , ＝6‒8］- 2-フェニルエタノールの分子イオン比が変化していた．
夏季に採集したバラでは，これまでと同様にベンジルカ チオンの生成比率は / 98/97/96＝75/20/5であった の に 対 し て，分 子 イ オ ン 比 率 が / 130/129/128＝ 10/75/15と顕著に変化していた．しかし11 〜 4月では
/ 130/129/128の比率は従来どおり ［2H8］-2PEに起因 する / 130が主要であった（表1）．
この現象は翌年にも同時期に再現性良く確認され，一 過性のものではなく，植物の生理現象を反映している可 能性があった．そこで筆者らはバラを毎月採取し，同様 の 投 与 実 験 を 行 い，［2H8］-2-フ ェ ニ ル エ タ ノ ー ル と
［2H7］-2-フェニルエタノールの生成がシフトする時期を 調べてみると，11 〜 4月に採取したバラでは ［2H8］-2- フェニルエタノールが主要に生合成され，5 〜10月に採 取したバラでは ［2H7］-2-フェニルエタノールが主要に生 合成されていた（図4A）．［2H7］-2-フェニルエタノール におけるベンジルカチオンの重水素標識化率は投与した
l-フェニルアラニンと類似していたことから，［2H7］-2-
表1■季節ごとの ［2H］-2-フェニルエタノールのアイソトポローグ比率と推定される生合成経路 アイソトポローグ比率
（%）
分子イオン（ / ） ベンジルカチオン（ / ）
生成物 経路
130 129 128 98 97 96
L-［2H8］フェニルアラニン
［2H8］ 83 ［2H7］
16.5 ［2H6］
0.5 ― ― ― ― ―
11 〜4月に検出した
［2H ］-2-フェニルエタノール 75 20 5 75 20 5
［2H8］-2-フェニル エタノール
a
5 〜10月に検出した
［2H ］-2-フェニルエタノール 10 75 15 75 20 5
［2H7］-2-フェニル エタノール
c
l-［2H8］フェニルアラニンは ［2H8］/［2H7］/［2H6］ の存在比率を示す．
図4■ロザ・イブピアッチェ花弁プ ロトプラストにおけるL［- 2H8］フェ ニルアラニン投与実験
（A） ［2H ］-2-フェニルエタノールのラ ベル化率の年間推移．［2H8］-2-フェニ ルエタノール， / 130 （●），［2H7］- 2-フ ェ ニ ル エ タ ノ ー ル， / 129
（○）．（B） ［2H ］-2-フェニルエタノー ル生成量の年間推移．
フェニルエタノールはl-フェニルアラニンの
α
位の水 素を保持していないことを示す．すなわち，5 〜10月に おける ［2H7］-2-フェニルエタノールは，前述の ［2H8］-2- フェニルエタノールを生成するAADC-PAR経路（経路 a）とは異なり，α
位が脱離するフェニルピルビン酸を 経由して生合成されることが示唆された．また5 〜 10 月には2-フェニルエタノールの生成量が5 〜 10倍増加 し，その増加分は ［2H7］-2-フェニルエタノールであった（図4B）．
微生物分野においてアミノ酸代謝経路の解明は進んで おり，アミノ酸からアルコールへの変換は一般的に3つ のタイプに分類されている（12〜14）．上述の図2に対応し た経路で示すと，経路a：アルデヒド合成酵素により脱 アミノ化反応および脱炭酸反応が触媒されて，アミノ酸 が直接的にアルデヒドへと変換される経路．経路b：ア ミノ酸は脱炭酸酵素によりアミンへと変換され，次にア ミンオキシダーゼによりアルデヒドへと変換される経 路．経路c：アミノ酸がアミノ基転移酵素によって
α
-ケ ト酸へと変換され，次にケト酸脱炭酸酵素によりアルデ ヒドへと変換される経路．アミノ酸α
位の水素の保持 または脱離に注目すると，経路aおよび経路b-1ではア ミノ酸のα
位の水素が保持されたままアミノ酸からア ルデヒドへと変換され，経路b-2および経路cではアミ ノ酸α
位の水素が脱離してアミノ酸からアルデヒドへ と変換される．上記に示した微生物のアミノ酸代謝を参 考にバラ花弁のフェニルアラニンから2-フェニルエタ ノールへの代謝を考えると，5 〜10月における ［2H7］-2- フェニルエタノール生合成は，［2H7］フェニルピルビン 酸を経る経路cを経由する可能性が示唆された．一方，11 〜4月における ［2H8］-2-フェニルエタノール生合成経
路は経路aに相当する（図2）．
これまでに類をみない，季節変化に伴う植物二次代謝 産物生合成経路のシフトを分子レベルで解明する目的 で，筆者らはまず時期別の2-フェニルエタノール生合成 経路の解明に着手した．特に経路cは微生物や酵母での 報告は多数あるが（エーリッヒ経路）（15），植物での報告 例はない．そこで植物における経路cの存在を明らかに するため，下記の実験を行った．
［2H7］-2-フェニルエタノール生合成経路の夏季にお
ける亢進
経路cの第一反応であるl-フェニルアラニンからフェ ニルピルビン酸への変換を確認するため，l-［2H8］フェ ニルアラニンを投与したプロトプラスト残渣から ［2H7］ フェニルピルビン酸の検出をLC-MSを用いて試みた結 果，プロトプラスト残渣から ［2H7］フェニルピルビン酸
（ / 170 ［M−H］−） を確認した．このことはバラ花弁 由来プロトプラスト内でl-フェニルアラニンからフェニ ルピルビン酸への変換を示している．
経路cが5 〜10月に働くことで ［2H7］-2-フェニルエタ ノールの生成に寄与しているのであれば，l-［2H8］フェ ニルアラニンから ［2H7］フェニルピルビン酸への変換活 性も同様に季節性を示すと考えられた．そこで，5 〜10 月，11 〜4月のバラ花弁から調製したプロトプラストに おいて変換活性を比較した．［2H7］フェニルピルビン酸 への変換活性は5 〜 10月のプロトプラストにおいて著 しく上昇した．経路cにおけるフェニルピルビン酸より 下流の生合成反応が同様に活性化しているかを調べるた め，プロトプラストにフェニルピルビン酸を投与した．
これまでの研究において，フェニルピルビン酸の代謝物
図5■季節ごとのL［- 2H8］フェニルア ラニンから ［2H8］-, ［2H7］-2-フェニ ルエタノールの生合成経路
であるフェニルアセトアルデヒドは，生体内では素早く 2-フェニルエタノールへと変換されることがわかってい る．そこで，フェニルピルビン酸を投与した際の2-フェ ニルエタノールへの変換活性を測定した．その結果11
〜4月のバラから調製したプロトプラストよりも，5 〜 10月のプロトプラストにおいて，2-フェニルエタノール への変換は有意に上昇した．このように，l-フェニルア ラニンからフェニルピルビン酸，フェニルピルビン酸か ら2-フェニルエタノールと，それぞれの変換活性が5 〜 10月に上昇していたことから，経路cが5 〜10月に亢進 していることが示された．以上のことを総合すると，季 節に応じてバラは異なる生合成経路を用いて，2-フェニ ルエタノールを生合成していることが明らかになった
（図5）．
プロトプラストだけでなく，5 〜10月期のバラ花弁か ら調製した粗酵素溶液を用いてl-フェニルアラニンから フェニルピルビン酸，フェニルピルビン酸からフェニル アセトルデヒドへの における変換反応を調べ，
その生成物を LC-MS, GC-MS で分析した．それぞれの 生成物であるフェニルピルビン酸，フェニルアセトルデ ヒドの酵素的生成が確認されたことから，バラ花弁中に これらの変換酵素が存在することが示された．有機反応 機構からl-フェニルアラニンからフェニルピルビン酸へ はピリドキサールリン酸依存性のアミノ基転移酵素，
フェニルピルビン酸からフェニルアセトルデヒドへはチ アミンピロリン酸依存性の脱炭酸酵素が関与すると予想 され，この2つの酵素を同定および機能解析を行うこと にした．
フェニルピルビン酸を経由する2-フェニルエタノー ル生合成酵素の解明
l-フェニルアラニンのアミノ基転移酵素として，芳香 族 ア ミ ノ 酸 ア ミ ノ 基 転 移 酵 素 （aromatic amino acid transferase ; AAAT） が想定された．しかし，植物体に お い て はl-フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン を 特 異 的 に 触 媒 す る AAATの報告はなされていなかった．そこで筆者らは，
l-フェニルアラニンを基質とする植物アミノ基転移酵素 のcDNA配列を参考にし，AAAT遺伝子候補を数種ク ローニングした．さらに大腸菌異種発現タンパク質を得 て，LC-MSを用いてl-フェニルアラニンに対するアミ ノ基転移活性を調べた．その結果，アミノ基転移酵素遺 伝子候補の一つに，顕著なフェニルピルビン酸生成活性 を見いだし，この酵素は芳香族アミノ酸（l-フェニルア ラニン，l-チロシン，l-トリプトファン）の中でもl- フェニルアラニンに最も高いアミノ基転移活性を示し た．以上から，この酵素がバラにおいてl-フェニルアラ ニンからフェニルピルビン酸への変換を担っている AAATであることを明らかにした（16）．
植物においてフェニルピルビン酸脱炭酸酵素 （
α
-keto acid decarboxylase ; KDC） について報告がなかったた め，筆者らはバラ花弁から酵素精製することにより KDCの単離を試みた．バラ花弁から調製した粗酵素溶 液を各種クロマトグラフィーに供した．酵素活性はフェ ニルピルビン酸を基質としてフェニルアセトルデヒドへ の脱炭酸活性を指標とした．3ステップのクロマトグラ フィー精製により得られた精製酵素をLC-MSMS解析に 供し，部分アミノ酸配列を同定後，全長 cDNA （Ry-図6■ロザ・イブピアッチェ花弁の 季節変化
花弁当たりの重量は，3 gに相当する 花弁枚数から算出した．
KDC1） を得て，その後バキュロウィルス-昆虫細胞異種 発現タンパク質を用いてバラRyKDC1の詳細な酵素学 的解析を行った．RyKDC1はフェニルピルビン酸を基 質として脱炭酸反応を触媒し，フェニルアセトルデヒド を生成した．またチアミンピロリン酸添加により活性が 上昇したことから，RyKDC1はチアミンピロリン酸依 存性であることがわかった．以上よりRyKDC1は植物 において初めて酵素機能が明らかになったフェニルピル ビン酸脱炭酸素である．次に，RyKDC1がバラ花弁に おいてもフェニルアセトアルデヒド（さらには2-フェニ ルエタノール）の生成に寄与しているのかを調べるた め，5 〜10月期のバラ花弁から調製したプロトプラスト を用いてRNAi試験を行った．RyKDC1 をノックダウ ンして，転写産物量を半減させた状態でl-フェニルアラ ニンをプロトプラストに投与すると，2-フェニルエタ ノールの生成量は50%まで有意に減少した．以上の結 果から，5 〜10月期のバラ花弁由来プロトプラストにお いて，RyKDC1が2-フェニルエタノールの生成に寄与し ていることを明らかにした．
今回われわれは，季節に応じてバラが2-フェニルエタ ノール生合成経路をシフトさせることを生物有機化学的 手法により明らかにした．しかし，「植物がなぜこのよ うに季節によって2つの経路を使ってわざわざ1種類の 化合物を作り出すのか？」「どのような環境要因が生合 成シフトを引き起こすのか？」についてはいまだ明確な 答えを出すことはできていない．冬季に比べ，夏季のバ ラ花弁数は少なく，花自体も小型になり軽量化する（図 6）．そのため夏季は香気成分の発散にとって不利になる ので，冬季とは異なる生合成経路を用いて生存戦略に重 要な香気成分2-フェニルエタノールを生合成するのでは ないかとも考えられる．また夏季の過酷な環境条件下で の人為的な開花時に，正常な環境では活用していない酵 素を緊急動員して香気成分の生合成に流用しているのか もしれない．
おわりに
今回，季節に応じてバラが二次代謝生合成経路をシフ トさせることを見いだせたのは，重水素化ラベルしたl-
［2H8］フェニルアラニンというケミカルプローブを用い，
その有機化学的な反応機構の推察と分析化学を併用する
という「農芸化学」的手法でアプローチし，研究を進め たことに起因する．近年，次世代シーケンサーの登場に より非モデル植物のゲノム解読やESTデータベースの 構築が急ピッチで進んでおり，ゲノム情報やオミクス解 析により植物の生理現象を解明する試みがなされ，優れ た成果を得ている．しかし，植物生理現象にかかわる植 物二次代謝産物の生合成や生理学的機能を明らかにする ためには，オミクス解析など網羅的手法だけでなく，そ れぞれの生合成経路を有機化学的な反応機構で推察し，
標識された生合成前駆化合物を用いて生合成経路を解析 していくような「化学」の視点と現象の観察に立脚した 研究アプローチが重要である．
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