岡 山 医 誌 (1994) 106, 861∼874
骨髄 異形 成症候群 にお け る骨髄細胞 周期 に関す る研 究
岡 山大学 医学 部 第二 内科 学教 室(指 導:木 村 郁郎 教授)
谷
水
将
邦
(平成6年3月28日 受 稿)
Key words: Myelodysplastic syndrome, Flowcytometry, Cell cycle analysis, Erythroid hyperplasia, Ineffective hematopoiesis
緒 言 骨 髄 異 形 成 症 候 群(Myelodysplastic syn drome,以 下MDS)は,多 能 性 造 血 幹 細 胞 レ ベ ル で の 質 的 な 異 常 に 基 づ くClonal hemopathy で あ り, 3血 球 系 統 に わ た る 血 球 減 少 と,血 球 形 態 異 常,血 球 機 能 異 常 を来 し,骨 髄 造 血 に 於 け る産 生 と成 熟 の プ ロ セ ス の 欠 陥(無 効 造 血) を特 徴 と し て い る.臨 床 経 過 は 慢 性 で は あ る が, 通 常 は 不 可 逆 性 に 進 行 し,し か も治 療 抵 抗 性 で, 特 に 骨 髄 中 に 芽 球 が 増 加 す る 病 型 で は 早 晩 急 性 白血 病 化 す る か,骨 髄 不 全 に 陥 る 予 後 不 良 の 疾 患 で あ る.こ のMDSの 骨 髄 細 胞 に お け る細 胞 周 期 比 率 に つ い て 種 々 の 報 告 が な され て い るが, Clark R. 1)は, MDSの 骨 髄 細 胞 のDNAを propidium iodideで 染 色 し,フ ロ ー サ イ トメ ト リー に て個 々 の 細 胞 の 細 胞 周 期 比 率 を 測 定 検 討 し, DNA量 の 減 少 と 白 血 病 化 に 関 連 が あ る と報 告 して い る.ま た, Montecucco2).3)や, S. W. Peters4)は 同様 にDNAの フ ロー サ イ トメ トリー を 用 い た 方 法 で, MDSをFrench-American-British(FAB)分 類5).6)によ り, 5病 型 に 分 け て, そ の 骨 髄 の 細 胞 周 期 比 率 を 検 討 して い る.そ の 報 告 に よ る と,い わ ゆ るLow-Risk群 のMDS で は, S期 比 率 が 正 常 人 に 比 して 増 加 して お り, High-Risk群 のMDSに お い て は,正 常 人 に 比 し てS期 比率 は 減 少 し,逆 に,. G0+G1期 比 率 が 増 加 して お り,臨 床 経 過 を追 って み る と, S期 比 率 が 多 い 症 例 程 予 後 が 良 く,ま た,白 血 病 化 に 先 立 っ てS期 比 率 の 減 少 を 認 め た と し て い る.し か し,い ず れ の報 告 に して も, MDSの 病 期 の 進 展 に 伴 う骨 髄 細 胞 周 期 比 率 の 変 化 の 原 因 に つ い て は 言 及 し て お らず,詳 細 に つ い て は い ま だ 不 明 で あ る. 今 回,著 者 は 前 述 のDNAフ ロ ー サ イ トメ ト リー を 利 用 し, MDSに お け る 骨 髄 細 胞 周 期 を測 定 し,病 期 の 進 展 や,治 療 に よ る病 態 の 改 善 に 伴 う細 胞 周 期 の 変 化 を 含 め,細 胞 周 期 に 影 響 を 与 え る 因 子 に つ い て 検 討 した の で 報 告 す る. 対 象 対 象 は 過 去2年 間 の 当 科 に お け る 骨 髄 異 形 成 症 候 群(Myelodysplastic syndrome,以 下 MDS)全23例[年 齢23∼83歳(平 均56.8歳),男 女 比=9:14]で, FAB分 類5).6)によ る病 型 で は Refractory Anemia(RA) 12例, RA with ring siderob1asts(RARS) 2例, RA with excess blasts(RAEB) 3例, RAEB in transformation
(RAEBt) 9例 で あ った.更 に それ を, RA, RARS のLow-Risk群14症 例[年 齢23∼71歳(平 均 50.5歳),男 女 比=3:11]とRAEB, RAEBtの High-Risk群9症 例[年 齢56∼83歳(平 均67.1 歳),男 女 比=6:3]と に分 け,各 々 の 群 に つ い て 検 討 した.な お,正 常 人14例[年 齢19∼65歳 (平 均37.9歳),男 女 比=8:6]をNormal Controlと し た. ま た 病 態 コ ン トロ ー ル と して,骨 髄 の 赤 芽 球 過 形 成 を 示 し たMDS以 外 の 病 態,ビ タ ミンB12 欠 乏 性 貧 血1症 例(62歳,男 性)と,人 工 弁 に よ る赤 血 球 破 砕 症 候 群1症 例,薬 剤 誘 起 性 溶 血 性 貧 血1症 例,鉄 欠 乏 性 貧 血 の 回 復 期2症 例, 赤 芽 球 癆 の 回 復 期1症 例,急 性 白血 病 の 化 学 療 861
法 後 で の 骨 髄 の 回 復 期5症 例 の 計10症 例[年 齢 17∼80歳(平 均54.9歳),男 女 比=3:7]に つ い て も骨 髄 細 胞 周 期 比 率 を検 討 した. 方 法 1.骨 髄 細 胞 周 期 比 率 の 測 定(図1) 1)単 核 球 層 の 分 離 患 者 及 び正 常 人 よ り十 分 な イ ン フ ォ ー ム ドコ ン セ ン トを得 た 後,骨 髄 液 を ヘ パ リン1ml加 に て 合 計3ml採 取 し,そ れ に 生 理 食 塩 水17mlを 加 え 合 計20mlの 浮 遊 液 と し, Ficoll-Hypaque (HISTOPAQUE-1077; 1.077g/μg, Sigma, St. Louis, MO)の 上 に 静 か に 重 層 し,比 重 遠 沈 法(450g, 20分 間)に て 骨 髄 単 核 球 層 を分 離 回 収 した.次 に,回 収 し た 骨 髄 単 核 球 の1×106個
以 上 を, RPMI 1640(GIBCO LABORA-TORIES, Gland Island, NY)に10%牛 胎 児 血 清(fetal calf serum; FCS, Flow general company, McLean, VA), 40U/mlペ ニ シ リ ン
(明 治 製 菓,東 京), 40μg/mlス トレ プ トマ イ シ ン(明 治 製 菓,東 京)を 加 え た も の7mlに 浮 遊
図1 骨髄単核球 の分離
させ, 25cm2 Cell Culture Flask(Triangular/ Canted Neck, Costar, Cambridge MA)に て
2時 間 静 置 培 養(37℃, 5%CO2)し 非 付 着 細 胞 を 採 取 し た. Phosphate-buffered saline (PH=7.2, CaとMgイ オ ン を含 ま な い,以 下PBS)に て2回 洗 浄 後,採 取 し た 細 胞 に て 浮 遊 液(PBS4mlに 浮 遊)を 作 成 し, 70%エ タ ノ ー ル(-20℃)をvortex mixerを 撹 拌 し な が ら 細 胞 浮 遊 液 を 滴 下 し,細 胞 を ア ル コ ー ル 固 定 し た.な お,ア ル コー ル 固定 後 の 細 胞 は4℃ で 保 存 し た. 2)フ ロ ー サ イ ト メ ト リー に よ るDNA量 測 定 4℃ の 条 件 下 で保 存 さ れ た70%エ タ ノ ー ル 固 定 後 の 骨 髄 非 付 着 単 核 球 細 胞 はPBSで 洗 浄 し, 0.25%ト リプ シ ン 液(千 葉 県 血 清 研 究 所)5ml を加 え 室 温 に て 充 分 に ピペ ッテ ィ グ し10分 間 反 応 させ た 後,再 び2回 のPBS洗 浄 を行 っ た. 次 にRNase(Sigma, St Louis, MO)1mg/ml
を加 え 室 温 に て 充 分 に ピペ ッテ ィ ン グ し30分 間 の 反 応 後, Propidium iodide(以 下PI Sigma, St Louis, M0)50mg/mlで 遮 光 の う え 室 温 に て
30分 間DNA染 色 し た.そ の 後 染 色 し た 骨 髄 非 不 着 単 核 球 細 胞1×106個 をPBS 2mlに 浮 遊 させ,フ ロサ イ トメ ト リー(Epics-Profile II, Coulter Electronics社, USA)を 用 い て,個 々
の 細 胞 の もつPIの 蛍 光 量 を20,000個 に つ き測 定 し た7).8).
3) DNAヒ ス トグ ラ ム の 作 成
フ ロ ー サ イ ト メ ト リー に て 得 ら れ た デ-タ を DNA cell cycle analysisで あ るMulti-cycle
(Coulter Electronics社, USA)を 用 い,測 定 し た細 胞 集 団 のDNAヒ ス トグ ラ ム を 作 成 し, G0+G1期, S期, G2+M期 の 細 胞 周 期 比 率 を解 析 算 出 し た.な お, DNAヒ ス トグ ラ ム の 演 算 処 理 はDean9)の プ ロ グ ラ ム に よ っ て行 い, CV値(Coefficient of Variation,偏 位 係 数 値) は, 5%未 満 と し た.(図2) 2.治 療 前 後 で の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 の 変 化 MDS症 例 の う ち, Low-Risk群 に 対 し, 1 症 例 に つ い て は, human recombinant granulocyte colony stimulating
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薬,(50μg/day everyday s. c.)]とEryth-ropoietin(EPO)10)[エ ポ ジ ンTM;中 外 製 薬,
(12000 unit/day three times a week s. c.)] に よ るサ イ トカ イ ン併 用 療 法 を行 い, 8症 例 に つ い て は,蛋 白 同 化 ス テ ロ イ ド11)(Metenolone asetate)[プ リモ ボ ラ ンTM;シ ェ ー リン グ社,(30
mg/day p. o.)]に よ る 治 療 を行 っ た.ま た, High -Risk群7症 例 に 対 して はlow dose melphalan 療 法12)[ア ル ケ ラ ンTM;ウ エ ル カ ム 社,(2㎎/ day everyday p. o.)]を 行 っ た.両 群 の 各 々 の 症 例 に 於 い て,治 療 前 後 で の 骨 髄 の 細 胞 周 期 比 率 の 変 化 を 臨 床 経 過 を 追 っ て 検 討 し,ま た, 治 療 に 反 応 し た症 例 と治 療 無 効 例 との 治 療 前 の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 を検 討 し た.な お,治 療 効 果 の 判 定 はMDSの 治 療 効 果 判 定 基 準13)に従 った. 3.臨 床 検 査 項 目 対 象 疾 患 の 患 者 よ り末 梢 血 検 査(赤 血 球 数, ヘ モ グ ロ ビ ン値,白 血 球 数,好 中球 数,血 小 板 数,網 状 赤 血 球 数),生 化 学 検 査(LDH,ハ プ ト グ ロ ビ ン,血 清 鉄, UIBC,フ ェ リチ ン),骨 髄 検 査(骨 髄 有 核 細 胞 数,骨 髄 顆 粒 球 系 細 胞 比 率, 骨 髄 赤 芽 球 比 率,骨 髄 芽 球 比 率),骨 髄 生 検 に よ る骨 髄cellularityの 検 査,染 色 体 検 査 等 を行 い, 各 々 の 臨 床 検 査 と骨 髄 細 胞 周 期 比 率 との 関 係 を 検 討 し た. ま た,患 者 の 骨 髄 塗 抹 標 本 に 鉄 染 色 を行 い, 木 村14) 15) 16)の 考 案 し たsideroblastogram 17) 18) 19) 20)を作 成 し , MDSの 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 との 関 係 を検 討 し た. sideroblastogramの 作 成 は, sideroblastの 百 分 率 を求 め る と 同 時 に,赤 芽 球 内 可 染 性 鉄 顆 粒 数 に よ り, 0個 をO型, 1 ∼2個 をI型 , 3∼5個 をII型, 6個 以 上 をIII 型 と し て,赤 芽 球100個 に つ き分 類 し,各 型 の 百 分 率 を求 め,そ し て横 軸 に 各 型 を,縦 軸 に こ れ ら各 型 に 対 応 す る百 分 率 を と り作 成 し た.正 常 値 は,木 村 の 検 討16) 17) 18)に従 っ て 認 定 し た. 結 果 1. MDS症 例 と正 常 人 に おけ る骨 髄 細 胞 周 期 比 率 の 検 討(図3) 1) G0+G1期 比 率 各 群 の 平 均 値 は 各 々, Low-Risk群72.3±5.4 %(62.8∼84.0%), High-Risk群83.7±7,8% (68.7∼92.0%), Normal Control 78.2±4.2
図2 Flow Cytometryに よ るDNA解 析
%(70.1∼84.5%)で あ っ た. High-Risk群 で は, Low-Risk群 に 比 し てG0+G1期 比 率 の 有 意 な 増 加(p<0.01)を 示 し, Normal Control に 比 し て 増 加 傾 向(p=0.07)を 示 し て い た. 2) S期 比 率 各 群 の 平 均 値 は 各 々, Low-Risk群21.2±4.9 %(14.7∼33.1%), High-Risk群9.9±5.9% (2.0∼20.7%), Normal Control 15.2±3.1% (10.5∼20.0%)で あ っ た. Low-Risk群 は, High-Risk群(p<0.01), Normal Control(p<
0.01)に 比 し てS期 比 率 の 有 意 な 増 加 を 示 し て い た.ま た 逆 にHigh-Risk群 は, Low-Risk群 (p<0.01), Normal Control(p<0.05)に 比 し てS期 比 率 の 有 意 な 減 少 を 示 し て い た. 3) G2+M期 比 率 各 群 の 平 均 値 は 各 々, Low-Risk群6.4±2.9 %(1.3∼12.4%), High-Risk群6.3±3.9% (1.7∼12.0%), Normal Control 6.5±3.2% (1.0∼12.7)で あ り, G2+M期 比 率 に つ い て は,各 群 間 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た. 2.治 療 前 後 で の 細 胞 周 期 比 率 の 変 化 1) Low-Risk群 蛋 白 同 化 ス テ ロ イ ド(Metenolone asetate) に よ る 治 療 を行 っ た8症 例 の 経 過 は,臨 床 的 に 無 効 で,そ の う ち3症 例 に お い て 治 療 前 後 で の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 を追 跡 し え た が,そ の 細 胞 周 期 比 率 に 変 化 は な か っ た. G-CSFとEPOに よ る サ イ トカ イ ン併 用 療 法 を行 っ た1症 例 は 臨 床 的 にGood responseが 得 ら れ た が,そ の 治 療 前 後 で の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 は 正 常 化 しな か っ た.同 時 に行 っ た染 色 体 検 査 も依 然 と して 異 常 が 認 め られ, sideroblastogram もIII型優 位20) 21)のま ま で あ っ た. 2) High-Risk群
High-Risk群 の う ちlow dose melphalan療 法 に て 完 全 寛 解 を得 た2症 例 と,治 療 無 効 で あ っ た5症 例 で は,治 療 前 の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 は 各 々, G0+G1期 比 率85.4±0.3%と84.7± 7.3%, S期 比 率10.8±2.1%と9.1±4.9%, G 2+M期 比 率3.7±1.9%と6.1±4.7%で あ り, 図3 MDS症 例 と正 常 人 に お け る 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 の 検 討 G0+G1期 比 率
High-Risk群 はLow-Risk群 に 比 し て 有 意 な 増 加 を 示 し, Normal controlに 比 して 増 加 傾 向 に あ っ た. Low-Risk群 はHigh-Risk群, Normal controlに 比 し て 有 意 な 減 少 を 示 し た.
S期 比 率
Low-Risk群 はHigh-Risk群 やNormal controlに 比 して 有 意 な 増 加 を示 し た. High-Risk群 はLow -Risk群 , Normal controlに 比 し て 有 意 な 減 少 を 示 し た.
G2+M期 比 率
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有 意 な 差 は 認 め られ なか っ た.
High-Risk群7症 例 に 対 し て, low dose me1phalan療 法 を 行 い,臨 床 的 に 無 効 で あ っ た 5症 例 と,完 全 寛 解 が 得 ら れ た2症 例 に つ い て, そ の 治 療 前 後 で の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 の 変 化 を検 討 した.そ の 結 果,無 効 例 で の 治 療 後 の 細 胞 周 期 比 率 は,治 療 前 と比 し て変 化 は 認 め られ な か っ た が,完 全 寛 解 が 得 られ た2症 例 に お い て は, そ の 治 療 後 の 細 胞 周 期 比 率 は 治療 前 に 比 し て, S期 比 率 の 増 加 とG0+G1期 比 率 の 減 少 が 認 め られ,ほ ぼ 正 常 人 に近 い 比 率 に 改 善 し た.図 4に そ の う ち の典 型 的 な1症 例 の 経 過 図 を示 す が,同 時 に行 っ た染 色 体 検 査 で も染 色 体 異 常 は 消 失 して お り, sideroblastogramに つ い て もIII 型 優 位 か ら正 常 パ ター ン と な っ た. 3.各 種 検 査 項 目 と骨 髄 細 胞 周 期 比 率 との 関 係 MDS症 例 に お け る 骨 髄 細 胞 周 期 のS期 比 率 と,各 種 臨 床 検 査 項 目 と の 関 係 を相 関 係 数 を用 い て 検 討 し た.そ の 結 果,赤 血球 数,ヘ モ グ ロ ビ ン値,白 血 球 数,好 中 球 数,血 小 板 数,骨 髄 有 核 細 胞 数,骨 髄 顆 粒 球 系 細 胞 比 率, LDH,ハ プ トグ ロ ビ ン, UIBC,フ ェ リチ ン に つ い て は 有 意 な相 関 関 係 を認 め な か っ た が,骨 髄 赤 芽 球 比 率[r=0.64(p<0.01)],骨 髄 芽 球 比 率[r=-0.62(p<0.01)]は 中 程 度 の 相 関 を,網 状 赤 血 球 数[r=0.43(p<0.05)],血 清 鉄[r=0.43(p< 0.05)]は 弱 い 相 関 を 認 め た.(図5) 次 に, MDS症 例 を染 色 体 異 常 の 有 無 に よ り分 け,骨 髄 細 胞 周 期 比 率 を 比 較 検 討 を行 っ た.そ の 結 果, Low-Risk群 に お い て 染 色 体 異 常 を示 し た3例 と染 色 体 異 常 の な い11例 で は 各 々, G 0+G1期 比 率72.7±10.6%と72.2±4.0%, S 期 比 率21.3±10.1%と21.2±3.4%, G2+M期 比 率5.9±5.7%と6.5±2.2%で あ り,有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た. High-Risk群 で は2例 が 染 色 体 異 常 を 示 し,染 色 体 異 常 の な い7症 例 と 比 し て,各 々G0+G1期 比 率88.8±4.5%と 82.2±8.2%, S期 比 率5.6±5.1%と11.2±5.9 %, G2+M期 比 率5.5±0.6%と6.5±4.5%で あ り,染 色 体 異 常 の 有 無 に よ る細 胞 周 期 比率 に は 有 意 な 差 は 認 め られ な か っ た. ま た, MDS症 例 を 骨 髄 生 検 検 査 に よ るcel lularityの 差 に よ り,過 形 成,正 形 成,低 形 成 に 分 け,各 々 の 骨 髄 細 胞 周期 比 率 を比 較 検 討 し た. そ の 結 果, Low-Risk群 に お い て 過 形 成7例, 正 形 成5例,低 形 成2例 で あ り,各 々, G0+ G1期 比 率74.7±6.1%, 68.2±5.0%, 71.7± 2.8%, S期 比 率19.4±4.3%, 24.5±5.3%, 21.0±2.4%, G2+M期 比 率6.2±3.5%, 6.3± 1.8%, 7.3±5.2%と 細 胞 周 期 比 率 に は 有 意 な 差 は 認 め られ な か っ た. High-Risk群 で は 過 形 成 4例,正 形 成2例,低 形 成2例 を 認 め た が,各 々 G0+G1期 比 率87.2±4.6%, 82.4±11.9%, 85.4±0.3%, S期 比 率6.5±5.5%, 10.5±4.7 %, 10.8±2.2%, G2+M期 比 率6.2±3.5%, 6.9±7.2%, 3.7±1.9%と,骨 髄 生 検 検 査 に よ るcellularityの 差 に よ り細 胞 周 期 比 率 に は 有 意 な差 は 認 め られ な か っ た. MDSに お け るsideroblastogramはIII型 優 位 の パ タ ー ン を と る も の が 多 いが20) 21),今 回 の 検 討 症 例 に お い て も, High-Risk群 で は 全 例 が, Low -Risk群 で も14例 中12例 がsieroblastogramは III型優 位 の パ ター ンで あ っ た. sideroblastogram がIII型優 位 とな らな か っ たLow-Risk群2例 と, III型優 位 のLow-Risk群12例 で は, G0+G1 期 比 率74.0±6.1%と72.0±5.6%, S期 比 率 17.7%±2.3%と21.8±5.1%, G2+M期 比 率 8.3±3.8%と6.1±2,9%で あ り,各 々 の 細 胞 周 期 比 率 に 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た. 4.骨 髄 赤 芽 球 の 過 形 成 を 示 すMDS以 外 の 病 態 に お け る 細 胞 周 期 比 率 の 検 討 病 態 コ ン トロ ー ル と し て,骨 髄 に お い て 赤 芽 球 の 過 形 成 を示 すMDS以 外 の 病 態 に つ い て 細 胞 周 期 比 率 の 検 討 を行 っ た.そ の 結 果,無 効 造 血 を示 す ビ タ ミンB12欠 乏 性 貧 血 の1例 で は, G 0+G1期 比 率43.5%, S期 比 率49.6%, G2+ M期 比 率6.9%と 著 しいS期 比 率 の 増 加 とG0+ G1期 比 率 の 減 少 を認 め た.ま た,薬 剤 誘 起 性 溶 血 性 貧 血 や 赤 血 球 破 砕 症 候 群(人 工 弁),鉄 欠 乏 性 貧 血 や 赤 芽 球 癆 の 回復 期,急 性 白血 病 の 化 学 療 法 後 の 骨 髄 の 回復 期 等 の 有 効 造 血 を示 す 病 態 に お い て も, G0+G1期 比 率69.8± 5.8(61.2∼76.7%), S期 比 率25.9±3.9% (21.0∼31.4%), G2+M期 比 率4.3±2.4% (1.4∼7.9%)とNormal Controlに 比 し てS 期 比 率 の 有 意 な 増 加(p<0.01)とG0+G1期
図4 完 全 寛解 例 に おけ る治療 前 後 の 骨 髄 細 胞 周期 比 率 の経 過
Low dose melphalan療 法 に て完 全 寛 解 とな ったMDS(High-Risk群)の 治 療 後 の骨 髄 細 胞 周 期 比率 は 正 常化 して いた. 比 率 の 有 意 な 減 少(p<0.01)を 認 め た.(表1, 図6) 次 に,前 述 の 各 種 臨 床 検 査 項 目 とS期 の 細 胞 周 期 比 率 の 関 係 に つ い て,こ れ らMDS以 外 の 赤 芽 球 過 形 成 を示 す 病 態 で も検 討 を 行 っ た.そ の 結 果,こ れ ら に お い て も骨 髄 赤 芽 球 比 率 に つ い て, MDS症 例 の 場 合 と同 様 に 中程 度 の 相 関 関 係[r=0.74(p<0.01)]が あ り, MDS症 例 に
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図5 MDS症 例 に おけ るS期 比率 と各 種 臨床 検 査 との相 関関 係 骨 髄 芽球 比率,骨 髄赤 芽 球 比率 に は 中程 度 の相 関 関 係 が あ り,網 状 赤 血 球 数,血 清 鉄 に は弱 い相 関 関 係 が あ った. お い て 弱 い 相 関 関 係 を示 し た 網 状 赤 血 球 数 に 中 程 度 の 相 関 関 係[r=0.61(p<0.05)]が 認 め ら れ た.(図7) 考 察 血 液 疾 患 に お い て, DNA染 色 を 用 い た フ ロー サ イ ト メ ト リー に よ る細 胞 周 期 比 率 の 解 析 に つ い て,こ れ ま で種 々 の 報 告 が な さ れ て い る.こ の 解 析 に よ り,細 胞 集 団 の あ る 時 点 で の, G0+ G1, S, G2+M期 の 比 率 が 知 り得 る こ とで, そ の 細 胞 集 団 の 増 殖 性 の 解 析 と臨 床 的 な 予 後, 抗 ガ ン剤 投 与 効 果 の モ ニ タ リン グ等 に 広 く応 用 さ れ て きて い る.高 本22)や 太 田23),中 村 ら24)によ る と,造 血 器 腫 瘍,特 に 急 性 白 血 病 の 芽 球 細 胞 で は,一 つ 一 つ の 細 胞 周 期 は む し ろG0+G1 期 に 留 る も の が 多 く,全 体 でG0+G1期 比 率 が 増 加 して い る と報 告 して い る. MDSに おけ る骨 髄 細 胞 の細 胞 周 期 比 率 につ い て は,緒 言 で 述 べ た よ うに, MontecuccoやS. W. Petersが, Low-Risk群 のMDSで は, S 期 比率 が 正 常 人 に 比 し て 増 加 し て お り, High-Risk群 のMDSに お い て は,正 常 人 に 比 して S期 比 率 は 減 少 し,逆 に, G0+G1期 比 率 が 増 加 し て い る と報 告 し て い る.今 回 検 討 した 当 科 で の 過 去2年 間 のMDS23症 例 の 骨 髄 細 胞 の 細 胞 周 期 比 率 の 結 果 は,こ れ ら の 報 告 と同 様 に, Low-Risk群 に お い て 正 常 人 よ りS期 比 率 が 有 意 に 高 く, High-Risk群 で は 正 常 人 に 比 してS 期 比 率 は 有 意 に 低 下 して お り, G0+G1期 比 率 は 増 加 す る傾 向 に あ っ た.ま た, Montecucco 等 は,長 期 観 察 に てS期 比 率 の 多 いMDS症 例 に お い て,そ の 臨 床 的 予 後 が 良 い こ と と,白 血 病 化 に 先 立 っ て そ の3∼24ヶ 月 前 に,有 意 なS 期 比 率 の 減 少 を認 め た と報 告 し て い る.今 回 の 検 討 で は,追 跡 期 間 が2年 間 と短 か く,は っ き り と し た 臨 床 的 予 後 との 関 係 は 不 明 で あ っ た が,表1 MDS以 外 で 骨 髄赤 芽 球 過 形 成 を示 す 病 態 に お け る骨髄 細 胞 周 期 比 率
図6 有効 造 血 に よ り赤芽 球 過 形 成 を示 す病 態 に お け る骨 髄 細 胞 周 期 比 率 の検 討
有 効造 血 に よ り赤芽 球 過 形 成 を示 す病 態 ではNormal Controlに 比 してS期 比 率 の有 意 な増加 と, G0+ G1期 比 率 の 有 意 な減 少 を認 め た.
骨髄 異 形成 症候群 にお け る骨髄 細胞 周期 に 関す る研 究
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図7 有 効 造 血 に よ り赤芽 球 過 形 成 を示 す 病 態 に お け るS期 比率 と各 種 臨 床検 査 との相 関 関係 S期 比率 と骨 髄 赤芽 球 比率,網 状 赤 血 球 数 との 間 には 中程 度 の相 関 関 係 が あ っ た. Low-Risk群 に てS期 比 率 が 有 意 に 増 加 し, High-Risk群 に てS期 比 率 が 有 意 に低 下 して い る こ と よ り,臨 床 的 予 後 と の 関 係 に つ い て は 同 じ よ う な 結 論 と な る こ とが 考 え られ た. ま た,今 ま で にMDSに お い て 治 療 経 過 との 関 連 か ら骨 髄 細 胞 周 期 比 率 を み た 報 告 は な さ れ て い な い が,今 回, hrG-CSFとEPOに よ る サ イ トカ イ ン併 用 療 法 を行 つ たLow-Risk群 の1 例 に はGood responseが, low dose melphalan 療 法12)(2mg/day連 日経 口)を 行 っ たHigh-Risk群 の2例 に お い て は,完 全 寛 解 が 得 られ, そ の 治 療 前 後 で の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 の 変 化 を検 討 す る こ とが 出 来 た.興 味 深 い こ と に,同 じ く 治 療 に 良 好 な 反 応 を示 し た3症 例 で は あ る が, そ の 治 療 前 後 の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 の 変 化 は 異 な っ た 経 過 を 示 し た.す な わ ち,サ イ トカ イ ン併 用 療 法 を行 っ たLow-Risk群 の1例 で は, Good responseを 得 た に もか か わ ら ず,骨 髄 細 胞 周 期 比 率 の 変 化 は 正 常 化 せ ず,治 療 前 と同 じ比 率 に 留 っ て い た.こ の こ とは, G-CSF等 の サ イ トカ イ ン の 投 与 で 得 ら れ た 血 球 の 増 加 が, MDSク ロ ー ン由 来 の 血 球 で あ る との 諸 家 の 報 告25) 26) 27) 28)に 矛 盾 せ ず,更 に,染 色 体 異 常 が 続 き, sideroblasto-gramの パ ター ン もIII型優 位 の ま ま で あ り,こ の Good responseを 得 たLow-Risk群 の1例 も, 同 様 にMDSク ロ ー ン 由 来 の 血 球 が 増 加 し た も の と考 え ら れ た.次 に, low dose melphalan療 法 を行 い 完 全 寛 解 が 得 られ たHigh-Risk群 の2例 にお いて は, そ の 治 療 前 後 の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 は,臨 床 経 過 に 伴 な っ てS期 比 率 の 上 昇 とG0+G1期 の 低 下 が 認 め られ,ほ ぼ 正 常 人 に 近 い パ ター ン と な り,染 色 体 異 常 の 消 失 や, sideroblastogramの パ ター ン もIII型優 位 か ら正 常 パ タ ー ン に 変 化 す る こ と を 認 め た. U. B. Wandl等29)は, MDSで は な い が, CMLに 対 し て イ ン ター フ ェ ロ ン に よ る 治 療 で完 全 寛 解 を得 た症 例 に お い て,同 様 に 治 療 に よ り骨 髄 細 胞 周 期 比 率 が 変 化 す る こ と を 報 告 し て お り,そ の 機 序 と して,イ ン タ ー フ ェ ロ ン に よ るph1ク ロー ン の 殺 細 胞 作 用 に よ る正 常 造 血 の 回 復 に よ る も の と想 定 し て い る.
て は,同 様 な 選 択 的 殺 細 胞 作 用 の 可 能 性 も考 え ら れ る が,教 室 で 報 告12)し て い る よ う に,治 療 経 過 中 に 血 小 板 を始 め とす る 血 球 減 少 を認 め ず 寛 解 導 入 が 得 ら れ た こ と よ り, MDSの 異 常 ク ロー ン を分 化 誘 導 さ せ,異 常 ク ロー ン の 自 己 複 製 を 抑 制 し,残 存 す る正 常 ク ロ ー ン の 造 血 を誘 導 し た た め 完 全 寛 解 が 得 られ た と も考 え ら れ た.細 胞 周 期 比 率 の 正 常 化 に 関 して は,い ず れ に し て も病 的 ク ロ ー ン 消 失 に よ る も の と考 え ら れ た. High-Risk群 に お い て,寛 解 に至 っ た 症 例 と 治 療 無 効 例 の 治 療 前 の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 に 差 が あ る か ど うか を検 討 して み た が,症 例 が 少 な い もの の,治 療 前 の 細 胞 周 期 比 率 に差 を 認 め る こ とは で き ず,一 般 に い わ れ て い る よ うに 寛 解 に 至 っ た 症 例 がS期 比 率 が 増 加 し て い る と い う こ とは な く, MDSに お け る骨 髄 細 胞 周 期 比 率 は 治 療 反 応 性 の 指 標 に は 成 り得 な か っ た. ま た,各 種 臨 床 検 査 項 目 とMDS症 例 の 細 胞 周 期 比 率 の 相 関 を 検 討 し,細 胞 周 期 比 率 に 影 響 を 与 え る 因 子 を検 討 し た結 果, S期 比 率 と骨 髄 芽 球 は 中程 度 の 相 関 関 係 を示 し て い た.こ の こ と は, Low-Risk群 に てS期 比 率 が 有 意 に 増 加 し, High-Risk群 に てS期 比 率 が 有 意 に 減 少 し て い る こ と の 反 映 と もい え る が,一 般 にIruma S.30)やBraian MJ.31)に よ っ て 報 告 さ れ て い る よ うに,病 期 の 進 展 に 伴 い 骨 髄 で の 造 血 細 胞 の 増 殖 能 力 が 低 下 して く る た め, S期 に あ る細 胞 が 減 少 し,そ の 結 果G0+G1期 の 休 止 期 に 細 胞 が 長 く留 る 結 果 で あ る と考 え ら れ た. 骨 髄 赤 芽 球 比 率 は 検 討 し たMDS症 例,特 に Low-Risk群 で 増 加 して お り, S期 比率 と 中程 度 の 相 関 関 係 に あ り, S期 比 率 の 増 加 に 赤 芽 球 系 の 過 形 成 が 関 与 し て い る可 能 性 が考 え られ た. そ こ で,細 胞 周 期 に 及 ぼ す 赤 芽 球 の 過 形 成 の 影 響 を検 討 す るため,病 態 コン トロー ル と してMDS 以 外 で 無 効 造 血 を呈 した1症 例 と有 効 造 血10症 例 に つ い て 細 胞 周 期 を 比 較 検 討 した.無 効 造 血 を呈 す る ビ タ ミンB12欠 乏 性 貧 血 の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 は,著 し いS期 比 率 の 増 加 とG0+G1期 比 率 の 減 少 を認 め た. こ れ ら の こ と は,ビ タ ミンB12欠 乏 性 貧 血 で は DNA合 成 障 害 が あ る に もか か わ らず, S期 に あ る細 胞 比 率 が 増 加 し て お り,個 々 の 細 胞 がS期 に あ る時 間 が 延 長 して い る 可 能 性,す な わ ちS 期 で 細 胞 周 期 が 一 時 停 止 して い る こ とが 考 え ら れ る.無 効 造 血 と細 胞 周 期 に 関 して 論 じた 報 告 は 少 な い が, Jacob32)ら は,鉄 芽 球 性 貧 血 の 無 効 造 血 に お い て,細 胞 周 期 のS∼G2期 で のarrest を推 定 して お り,今 回 のLow-Risk群 のS期 比 率 の 増 加 も,ひ とつ の 可 能 性 と して 細 胞 周 期 の S期 に お け るarrestが 考 え ら れ た. 一 方,有 効 造 血 を 示 し た10症 例 に つ い て の 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 も, MDS症 例 と同 様 に 正 常 人 と 比 して 有 意 なS期 比 率 の 増 加 を認 め た.こ れ ら の 病 態 で も,や は り骨 髄 赤 芽 球 比 率 とS期 比 率 は 中 程 度 の 相 関 関 係 に あ っ た が, MDS症 例 に 比 し て,網 状 赤 血 球 数 とS期 比 率 の 増 加 との 相 関 関 係 が よ り強 く示 され た,こ の こ と は,有 効 造 血 に お い て は,骨 髄 赤 芽 球 の 増 加 や 網 状 赤 血 球 の 増 加 が そ の ま ま全 体 の 造 血 細 胞 の 増 殖 を 直 接 的 に 反 映 して お り,そ の 盛 ん な 増 殖 の た め にS 期 比 率 の 増 加 を認 め る も の と考 え ら れ た. Cazzola33)ら は 鉄 代 謝 の 面 か らMDSを 検 討 し,赤 芽 球 の 過 形 成 を示 す 典 型 的RAや,ま た 特 にRARSで は,造 血 細 胞 の か な りの 部 分 が 骨 髄 内 早 期 崩 壊 をお こ して い る も の の,赤 血 球 造 血 は 抗 進 して お り, RAEB, CMMoLやRAEBt で は 赤 血 球 造 血 は低 下 して い る と報 告 して い る が,今 回 のLow-Risk群 に お け るS期 比 率 の 増 加 の も う ひ とつ の 可 能 性 と して,無 効 造 血 で は あ るが,有 効 造 血 の よ うに 造 血 細 胞 が 盛 ん に分 裂 増 殖 を繰 り返 して い る こ とが 考 え ら れ た. な お, MDS症 例 に お い て のS期 比 率 と網 状 赤 血 球 数 の 弱 い 相 関 関 係 に つ い て は,武 内 ら31)が, MDSで は幼 若 網 状 赤 血 球 が 流 血 中に 出 て も即 座 に 網 内 系 細 胞 に 捕 捉 崩 壊 さ れ る と い う,い わ ゆ る 骨 髄 内 の 赤 芽 球 溶 血 の み で な く,網 内 系 細 胞 で の 網 状 赤 血 球 溶 血 も含 め た 無 効 造 血 の た め に 幼 若 網 状 赤 血 球 が 増 加 して い る と報 告 して お り, 無 効 造 血 に 関 連 す る二 つ の 因 子 の 弱 い 相 関 と考 え ら れ た. MDS症 例 に お い て 血 清 鉄 とS期 比 率 が 弱 い相 関 を示 して い た が, MDS症 例,特 にLow-Risk 群 で は 赤 血 球 系 無 効 造 血 の 程 度 の 反 映 と し て, 骨 髄 内 の 赤 芽 球 溶 血 や 網 内 系 細 胞 で の 網 状 赤 血 球 溶 血 に よ る 血 清 鉄 の 増 加 が み ら れ, S期 比 率
骨 髄 異形 成症候 群 に おけ る骨 髄細 胞周期 に関す る研 究
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の 増 加 との 相 関 を示 し た と考 え られ た. 以 上, MDSに お け る 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 は,病 態 を 反 映 し,変 動 す る こ とが 明 らか と な っ た. Low-Risk群 に お け るS期 比 率 の 増 加 は,主 に 赤 芽 球 系 を 中 心 と した 無 効 造 血 に よ る も の と考 え られ,そ の 機 序 と し て, DNA合 成 障 害 に 起 因 し た 細 胞 周 期 のS期 で のarrestな い し,骨 髄 内 細 胞 崩 壊 を伴 う盛 ん な 造 血 細 胞 の 分 裂 増 殖 に よ る もの が 推 察 さ れ た.こ れ らの 検 討 はMDSの 病 態 解 析 に 際 し重 要 な 情 報 を 提 供 す る も の と考 え られ た. 結 論 MDS 23症 例 に お い て,骨 髄 の細 胞 周 期 比 率 の 検 討 を行 っ た. 1) Low-Risk群 は, High-Risk群(p< 0.01), Normal Control(p<0.01)に 比 してS 期 比 率 の 有 意 な 増 加 を認 め た.逆 に, High-Risk 群 は, Low-Risk群(p<0.01), Normal Control(p<0.05)に 比 してS期 比 率 は 有 意 に 減 少 し, Low-Risk群 に 比 してG0+G1期 比 率 の 有 意 な 増 加(p<0.01), Normal Controlに 比 して 増 加 傾 向(p=0.07)を 示 し た. MDSの 病 期 の 進 展 に 伴 っ て,細 胞 周 期 比 率 は G0+G1期 比 率 の 増 加 とS期 比 率 の 減 少 を 認 め た. 2)サ イ トカイ ン併 用 療 法 に てGood response が 得 ら れ たLow-Risk群 の1例 は,そ の 治 療 前 後 で の 細 胞 周 期 比 率 の 変 化 は 認 め られ な か っ た が, low dose melphalan療 法 に て 完 全 寛 解 が 得 られ たHigh-Risk群 の2例 は,病 態 の 改 善 に よ り細 胞 周 期 比 率 の 正 常 化 を 認 め た. 3) MDS症 例 にお け る骨 髄 細 胞 周 期 のS期 比 率 と,骨 髄 赤 芽 球 比 率[r=0.64(p<0.01)], 骨 髄 芽 球 比 率[r=-0.62(p<0.01)]は 中 程 度 の 相 関 を 網 状 赤 血 球 数[r=0.43(p<0.05)], 血 清 鉄[r=0.43(p<0.05)]は 弱 い相 関 を認 め た. MDSと り わ けLow-Risk群 に お け る 骨 髄 細 胞 周 期 のS期 比 率 の 増 加 は, DNA合 成 障 害 に よ る細 胞 周 期 のS期 で のarrestま た は,骨 髄 内 細 胞 崩 壊 を 伴 う盛 ん な造 血 細 胞 の 分 裂 増 殖 を反 映 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た.以 上, MDSに お け る 骨 髄 細 胞 周 期 比 率 は病 態 を反 映 し,変 動 す る こ とが 推 察 さ れ た.こ れ らは 病 態 解 析 に 有 力 な 情 報 を 提 供 す る もの と考 え られ た. 稿 を終 え るに あ た り御 指 導 な らびに御 校 閲 を賜 っ た 木村 郁 郎教 授 に深 甚 な る謝意 を表 す る と と もに, 終 始 懇切 な る御 指 導 と助 言 をい た だい た大 本 英 次 郎 助 手 に感 謝 の 意 を表 す る. 本 論 文 の 要 旨 は 第35回 日本 臨 床 血 液 学 会 総 会 (1993,広 島)に お いて 発 表 した.
文
献
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Cell cycle in myelodysplastic
syndrome
Masakuni
TANIMIZU
Second Department
of Internal
Medicine,
Okayama
University
Medical School,
Okayama
700, Japan
(Director:
Prof. I. Kimura)
Bone marrow cell cycle analysis was performed on 23 patients with myelodysplastic syn drome (MDS) [12 with refractory anemia (RA), two with RA with ringed sideroblasts (RARS), three with RA with excess blasts (RAEB), six with RAEB in transformation (RAEBt)] , and 14 normal volunteers. Cells were stained with propidium iodide and analyzed by flow - cytometry.
Patients with RA and RARS (low-risk MDS) showed higher rates of S-phase (21.2•}4.9%) and patients with RAEB and RAEBt (high-risk MDS) showed lower rates of S-phase (9.9•}5. 9%) compared with normal controls (15.2•}3.1%). Although the rate of S-phase decreased with disease progression, it was normalized with complete remission. An intermediate correlation (r=0.64, p<0.01) existed between the rate of S-phase and the percentage of erythroblasts in MDS.
The rate of S-phase clearly reflects the severity of MDS. The high rate of S-phase in low-risk MDS was considered to be due to erythroid hyperplasia with ineffective hematopoiesis.
