博 士 （ 医 学 ） 西 堀 宗 樹
学 位 論 文 題 名
胸 腺 内 ペ プ チ ド 抗 原 投 与 に よ る 胸 腺 細 胞 選 択 機 構 の 研 究
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
I目 的
Tリン バ球 の分化・ 成熟は，胸腺内での正，負 の選択を介して誘導される． これら両選択は，T細胞抗原 受 容 体(TCR)と 自 己 の 主 要 組 織 適 合 抗 原 複 合 体 分 子(MHC)お よび 自己 ベプ チ ド分 子と の間 の 相互 作用 によ ると 考 えら れて いる ． これ まで のと ころ正の選 択においては，未熟胸腺細胞 がTCRを介して，胸腺内に発 現 さ れ る 自 己MHCと ベ プ チ ド 複 合 分 子に よっ て適 当な 刺 激を 受け ，そ の結 果 自己MHC拘束 性を 獲得 したTリ ンバ 球 が増 殖す ると 考 えら れて いる ．一方，負 の選択においては，自己MHCと自己ベプチド複合体に強く 反 応 す るTCRを発 現す るT細胞 が排 除 され る． これ らT細胞 クロ ー ンの 選択 は，TCRを介 した 刺 激を 受け る点 にお い ては 共通であ るが，刺激の質または量によ って，全く正反対の運命を たどることになるという，非 常 に興 味 深い テーマの ーつである．しかし，未熟胸 腺細胞が分化のどのような 時期に，どのようなべプチド 十 MHC複合 体に よ って 選択 を受 ける か については不 明な点が多い．本研究では ，コンジェニックマウスある い はシ ン ジェ ニックマ ウス間で骨髄移植を行い，こ の骨髄キメラマウスの胸腺 内にべプチドを直接注入する こ と に よ り ， 胸 腺 細 胞 の 分 化 過 程 と 正 負 の 選 択 に 関 与 す る べ プ チ ド 分 子 の 性 状 の 分 析 を 行 っ た ．
u結果
ま ず ，Thylコ ンジェニックマウス間で骨 髄キメラを作製し，未熟胸腺 細胞の胸腺内分化を解析し た．胸腺 内に お ける ドナ ー骨 髄由 来 細胞 の表 面抗 原 の発 現を 解析 する ことによ り，骨髄移植後12日目から16日目の 間 に ，CD4゛CD8゛ ダ プ ル 陽 性(DP)の 未熟 型胸 腺細 胞がCD4+CD8‑， ある い はCD4‑CD8゛ シン グル 陽性(SP) の成 熟 型胸 腺細 胞に分化していくことが判 明した．また骨髄移植後21日 目以降ではレシピェント由 来の胸腺 細胞がすべてドナ ー由来の胸腺細胞に置換して いた． ．
次 に ，種 々の ハト チト ク ロー ムc43‑58 (p43‑58)ア ナ 口グ ペプ チド と マウ スのMHCクラスu分子 （I‐Aり との 結 合親 和性 を解 析し た ，用 いた ベプチ ドはp43‑58のエピトープ部 位である50番目のアスバラギ ン酸(D) をグルタミン酸(E)に置換(50E)，あるいは，バ1Jン(V）に置換したもの(50V)，さらに，50E，50Vのアグレトー プ部位である54番 目のアスバラギン（間をアラ ニン(A)に置換(50E54A，50V54A)，あるいはアルギニン(R)に置 換(50E54R，50V54R)した も ので ある ，そ の 結果 ，50Eと50Vは 全 く異 なるT細 胞ク ロー ンを刺激す ること，
ま たI̲Abとの 結合 能は ，そ れ ぞれ ，50E54A>50E>50E54R，50V54A>50V>50V54Rで あり ， エピ トー プと は 無 関 係 に ア グ レ ト ー プ 残 基 に よ る 結 合 親 和 性 の ヒ エ ラ ル キ ー が 決 定 さ れ る こ と が 判 明 し た ． 以 上 の結 果に 基づき，シンジェニックマ ウス間の骨髄移植後の適当な 時期に，これらのアナログ ベプチド を直 接 マウ ス胸 腺内に投与（i．りし，この べプチド抗原と自己MHC分子 複合体が，未熟胸腺細胞の 分化と選
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択にどのような影響を与えるか解析した．骨髄移植後21日目以降に，上記ベプチドをi．t．したキメラマウス のp43‑58アナログベプチド刺激に対するT細胞増殖反応は，正常マウスのそれと変わらなかった，一方，骨 髄移植後13日目にI̲Abに対して結合性が高い50E54Aをi.t.した場合，50E54A特異的T細胞の反応性のみが 低下しており反応性のヒェラルキーは50E>50E54Aとなった．しかし，50Vアナログベプチドに対する反応 性には影響はなかった．同様に骨髄移植後13日目にI̲Abに対して結合性が低い50E54Rをi.t.した場合のT細 胞増殖反応については，いずれのp43‑58アナログベプチドに対しても明らかな変化は見られなかった．
m考察
骨髄移植後28日目以降では，胸腺はほぼ完全にドナー由来の細胞に置換されており，．これらのCD4，CD8 発現バターンは正常成熟マウスのものと変わらなかった，また骨髄移植後の比較的早い時期の胸腺について は，骨髄移植後8日目からわずかながらドナ一由来DP細胞が出現し始め，再建後16日目には，明確なCD4SP 細胞，あるいはCD8SP細胞ポピュレーションが出現した，これらの結果は，Thylコンジェニックマウス間 で作製した骨髄キメラにおいては，完全異系キメラのものよりも早期に胸腺細胞の成熟化が進むことを示し ている．従って，骨髄移植後にドナー由来細胞が正または負の選択の最初のシグナルを受けるのは，12日目 から遅くとも15日目であると推察された，骨髄再建後13日目前後に抗原性ベプチドを投与した場合が，最 も効 果的に負の選択を誘導したという今回の結果は，この時期が厳密に重要であることを示唆する．
次に，p43‑58アナログベプチドとIーハ分子拘束性のT細胞増殖反応についての解析結果より，50Vと50E アナログペプチド間には互いに交叉反応性がなく，50E関連ベプチドと50V関連ベプチドは，末梢では異な るT細胞レバートリーを活性化することが確認された．また，50E，50E54A，50E54Rの3種の50E関連ペプ チドに対するI̲Ab分子拘束性のT細胞増殖反応では，エピトープ部分が同一なために互いに交叉反応性を示 したが，反応性にはヒエラルキ―が認められ(50E54A>50E>50E54R)，これはI̲Ab分子とべプチド分子との 親和性のヒエラ´レキーを反映していると考えられた．これらp43‑58アナログベプチドは，マウス胸腺内に発 現されているI̲Ab分子にも，同様のヒエラルキーで結合すると考えられた．実際I̲Abとの結合性の高い50E54A を骨髄移植後13日目に投与することにより，50E54Aに対する反応性が特異的に低下することが観察された．
50E54Aのi．t，は50Vアナログに対する反応性には影響を与えなかった．従って，負の選択に関しては，エピ トープ部位の1アミノ酸残基の置換によってクローンの選択が影響されることから，1ペプチド：1TCRクロ ーンの関係が機能していると考えられた．また今回13日目の50E54Rのi．t．が，50E54Aに対する反応には全 く影響を与えないことが判明した．このことは，負の選択に関与するベプチドはI̲Abと一定の親和性を持つ ことが必要であることを示唆する，最後に13日目に50E54Ai．t．により，50E54Aに対する反応性の低下と同時 に，50E54Aと50Eに対する反応性の逆転(50E>50E54A)が認められた．これは50Eアナログベプチドの54 番残基に特異的なT細胞ク口一ンが存在することを示す，従って，p43‑58アナ口グベプチドの54番残基が，
アグレトープ以外にエピトープとしても機能する可能性が示唆された．この点は，現在クローンレベルで解 析中である，
N結語
Thylコンジェニックマウス間で作製した骨髄移植キメラ胸腺では，異系キメラと比べて骨髄移植後早期 (21日目）にはほぼドナ一細胞に置換した，
移植後12〜16日目に既にドナ一由来のSP胸腺細胞が出現した．
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3．骨髄移植後13日目に，I̲Abに親和性の低い50E54Rをi．t．した場合はT細胞の反応性に影響を与えなかっ た．しかし，親和性の高い50E54Aをi.t.した場合には，50E54A特異的T細胞の反応性の低下が認められ これは負の選択によると考えられた，また50E54Aのi．t．は50E特異的T細胞には影響しないことから，
54番残基はアグレトープ以外に，エピトープとしても働くと考えられた．
4，骨髄移植後21日目以後にべプチド抗原をi．t．した場合には，T細胞の反応性に有意の影響が見られなかっ た．従って，ペプチド抗原i．t．による負の選択はDPからSP細胞分化が始まる時期に限定されると考え られた，
学位論文審査の要旨
主 査 教 授 小 野 江 和 則 副 査 教 授 柿 沼 光 明 副 査 教 授 細 川 ． 眞 澄 男
学位論文題名
胸腺内 ベプチド抗原投与による胸腺細胞選択機構の研究
T リン バ球の 分化 ・成 熟は ，胸 腺内 での 正， 負の 選択 を介 して 誘導さ れる ．こ れら両選 択 は ， T 細 胞 抗 原 受 容 体 （ TCR ） と 自 己 の 主 要 組 織 適合 抗原 複合 体分 子（ MHC ） およ ぴ自 己ベ プチ ド分 子と の問 の相 互作 用に よると 考え られ ている．しかし，未熟胸腺細胞が分化 のど のよ うな 時期 に， どの よう なベ プチド 十MHC 複 合体 によ って 選択を 受け るか について は不 明な 点が 多い ．木 研究 では ，コ ンジェ ニッ クマ ウスあるいはシンジェニックマウス間 で骨 髄移 植を 行い ，骨 髄キ メラ マウ スの胸 腺内 にべ プチドを直接注入することにより，胸 腺 細 胞 の 分 化 過 程 と 正 負 の 選 択 に 関 与 す る べ プ チ ド 分 子 の 性 状 の 分 析 を 行 っ た ， ま ず， Thyl コン ジェ ニッ クマ ウス 問で骨 髄キ メラ を作製し，未熟胸腺細胞の胸腺内分化 を解 析し た． 骨髄 移植 後12 日目 から 16 日目 と比 較的 早期に，CD4 ゛CD8 ゛ダブル陽性の未熟 型胸 腺細 胞が CD4 ゛ CD8 ．，あるいはCD4 ℃D8 ゛シングル陽性の成熟型胸腺細胞に分化してい くこ とが 判明 した ．次 に， 種々 のハ トチト クロ ーム c43‑58 （p43‑58 ）アナログベプチド，
50E ．50E54A ， 50E54R ， 50V ，50V54A ．50V54R と マウ スの MHC クラ スII 分 子（ I̲Ab ）との親 和 性 を 解 析 し た ． その 結 果 ， 50E と 50V は 全 く 異 な るT 細胞 クロ ーン を刺 激する こと ，ま た I̲Ab と の 結 合 能 は， それ ぞれ ，50E54A>50E>50E54R ， 50V54A>50V>50V54R であ り， エピ トー プと は無 関係 にア グレ トー プ残 基によ る結 合親 和性のヒエラルキーが決定されること が判明した，
以 上の 結果 に基 づき ，シ ンジ ェニ ックマ ウス 問の 骨髄移植後の適当な時期に，これらの アナ口グベプチドを直接マウス胸腺内に投与（i ．t ．）し，未熟胸腺細胞の分化と選択にどの ような影響を与えるか解析した．その結果，骨髄移植後13 日目に、I‑A に対して結合性が高 い 50E54A を i.t. し た場 合の み， 50E54A 特 異的 T 細胞 の反 応性 が低 下し てお り， 50E ア ナロ グに 対す る反 応性 のヒ エラ ルキ ーは 50E>50E54A とな った ．し かし ，50V アナ ログ に対する 反応 性に は影 響は 見ら れなかった．同様に骨髄移植後13 日目にI‑A ￣に対して結合性が低い 50E54R を i ．t ．し た場 合のT 細胞増殖反応については，いずれのp43‑58 アナログベプチドに 対しても明らかな変化は見られなかった．
今 回， I̲Ab との 結合 性の 高い 50E54A を骨 髄移 植後 13 日目に投与することにより，50E54A に対 する 反応 性が 特異 的に 低下 し， 50E に 対す る反 応性 には 影響 を与え ない こと が判明し た． 従っ て， p43‑58 ア ナロ グベ プチ ドの54 喬残 基が ，アグレトープ以外にエビトープとし ても 機能 する こと が示 唆さ れた ．ま た負の 選択 に関 して は， エピ トー プ部 位の 1 アミノ酸 残基 の置 換に よっ てク 口ー ンの 選択 が影響 され るこ とか ら， 1 ベ プチド ：1TCR ク ローンの 関係が機能していると考えられた．
公 開発 表に あた って ，副 査の 細川 真澄男 教授 より ，自己抗原ではなくp43‑58 を用いたこ
との 問題 点， ベプ チド のア フイ ニテ イーの 差が どの ような影響を与えるのか，柿沼光明教
授 か ら ， ア フ イ ニ テイ ーと T 細 胞活 性化 の関 係，TCR の 識別 する べプ チド の大き さ， ベプ
チドit とIV 差，反応T 細胞の亜群について，主査の小野江和則よりsyngenelcpreference の メカニズム．MHC クラスll 結合性ペプチド投与によるCD8 ゛T 細胞の活性化等について質問 があった，申請者は大概妥当な回答をした．．
審査員一同は，TCR トランスジェニックを用いなけれぱ実験的にはなかなか困難な胸腺 細胞の負の選択について，正常マウス間の骨髄移植キメラを題材とすることにより，ベプ チドによるク口ーン消去を証明した成果を高く評価し，申請者が博士（医学）の学位を受 けるに充分な資格を有するものと判定した，
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