口腔扁平上皮癌細胞の新たな癌幹細胞マーカーとしての糖鎖認識レクチンrBC2LCNに関する研究

学

位 論 文

A study of rBC2LCN as a novel cancer stem cell marker of oral squamous cell carcinoma cells

（ 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 の 新 た な 癌 幹 細 胞 マ ー カ ー と し て の 糖

鎖 認 識

レク チン rBC2LCN に 関す る研究 ）

学 位 申 請 者 中 峠 洋 隆

広 島 大 学 大 学 院 医 歯 薬 保 健 学 研 究 科 医 歯 薬 学 専 攻

主 指 導 教 員 ： 岡 本 哲 治 教 授

（ 応 用 生 命 科 学 部 門 分 子 口 腔 医 学 顎 顔 面 外 科 学 ）

平 成 28 年 度

1 第 １ 章 緒 言 癌 組 織 は 一 様 な 細 胞 集 団 で は な く ， 多 様 な 細 胞 集 団 か ら 構 成 さ れ ， そ の 中 で も 細 胞 周 期 の 遅 い 細 胞 群 は ， ご く 少 数 で も 癌 を 生 体 内 に 再 構 築 で き ，放 射 線 療 法 や 化 学 療 法 に 対 し て 抵 抗 性 を 示 す こ と か ら ， 癌 に お け る 幹 細 胞（ 癌 幹 細 胞 ）で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い た (Reya, et al, 2001)． 近 年 ， 癌 は 幹 細 胞 能 力 と 癌 形 成 能 を 併 せ 持 つ 少 数 の 癌 細 胞 群 と ， 同 細 胞 に 由 来 し た 幹 細 胞 の 特 性 を 持 た な い 細 胞 群 に よ り 形 成 ， 維 持 さ れ て い る こ と が 示 さ れ ， 癌 幹 細 胞 は 癌 治 療 に お け る 新 た な 標 的 細 胞 と し て 注 目 さ れ て き て い る (Tan, et al, 2006; Ailles, et al, 2007; Kvinlaug, et al, 2007; Lobo, et al, 2007) ．

癌 幹 細 胞 の 特 徴 と し て 正 常 幹 細 胞 と 同 様 に ， ① 未 分 化 な 表 面 形 質 を 示 す (Gilbert, et al, 2009)， ② 自 己 複 製 能 に よ り 癌 幹 細 胞 集 団 を 維 持 す る (Schatton, et al, 2009) ， ③ 多 分 化 能 を 有 し 多 様 な 癌 細 胞 に 分 化 す る (Gupta PB, et al, 2009) ， ④ 高 い 薬 剤 耐 性 を 示 す （ Hermann, et al, 2007）， ⑤ 高 い 腫 瘍 形 成 能 を 示 す （ Folkins, et al, 2009）， な ど が あ げ ら れ て い る ． そ の た め ， 癌 幹 細 胞 は 癌 の 発 生 ・ 進 展 の み な ら ず 再 発 ， 転 移 お よ び 治 療 抵 抗 性 に も 深 く 関 与 し て い る と 考 え ら れ て い る (Dalerba, et al, 2007; Trumpp, et al, 2008; Visvader, et al, 2008; Jones, et al, 2009) ．

癌 幹 細 胞 研 究 に お い て は ， 他 の 細 胞 集 団 か ら 幹 細 胞 群 を 正 確 に 分 離 ・ 同 定 す る こ と が 重 要 で あ る ． 現 在 ま で に 癌 幹 細 胞 の 特 徴 を 利 用 し た 色 々 な 分 離 方 法 が 報 告 さ れ て い る ． ま ず ， 正 常 幹 細 胞 の 機 能 的 特 徴 を 利 用 し た 方 法 と し て ， ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー 分 子 （ Zhou, et al, 2001; Huls, et al, 2008） に よ る 色 素 や 薬 剤 排 出 能 力 を 利 用 し た 方 法

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で あ る ． つ ま り 幹 細 胞 で は ， そ の 生 存 の た め 非 幹 細 胞 と 比 較 し て ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー が 高 発 現 さ れ て い る た め ， DNA 結 合 蛍 光 色 素 Hoechst33342 （ Goodell, et al, 1996） で 処 理 す る と ， ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー 高 発 現 細 胞 は Hoechst33342 を 排 出 す る と い う 染 色 抵 抗 性 を 利 用 し た も の で ， UV 光 で 励 起 す る と 大 部 分 の Hoechst33342 に よ る 蛍 光 強 度 の 高 い 細 胞 集 団（ main population）よ り も 蛍 光 強 度 の 低 い 細 胞 群 つ ま り side population (SP)細 胞 群 が フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 分 離 さ れ る が ， こ の SP 細 胞 群 に は 高 頻 度 に 癌 幹 細 胞 が 存 在 す る と い わ れ , 乳 癌 , 肺 癌 お よ び 脳 腫 瘍 で が ん 幹 細 胞 と し て 報 告 さ れ て い る (Hirschmann-Jax, et al, 2004; Kondo, et al, 2004; Hadnagy, et al, 2006; Ho, et al, 2007; Wu, et al, 2008; Charafe -Jauffret, et al, 2009)．次 に ，細 胞 表 面 マ ー カ ー を 利 用 し て 分 離 す る 方 法 が あ る ．急 性 骨 髄 性 白 血 病 （ AML） の 癌 幹 細 胞 が CD34 陽 性 /CD38 陰 性 細 胞 群 に よ り 濃 縮 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て (Lapidot, et al, 1994)以 来 ， 色 々 な 分 子 が 癌 幹 細 胞 で 特 異 的 に 発 現 す る 細 胞 表 面 マ ー カ ー と し て 検 討 さ れ て い る （ Deonarain, et al, 2009）． こ の よ う な 癌 幹 細 胞 表 面 マ ー カ ー の 発 現 パ タ ー ン の 同 定 は ， 癌 幹 細 胞 を 検 出 す る 有 効 な 手 段 お よ び 抗 体 治 療 の 標 的 と な る と 考 え ら れ , 最 近 最 も 広 く 認 識 さ れ て い る 細 胞 表 面 マ ー カ ー と し て は ，組 織 幹 細 胞 マ ー カ ー で あ る CD44，CD133（ prominin 1）， CD34 等 が 有 力 で あ る （ Major et al. 2013） 1875 年 ，Cohnheim は 癌 幹 細 胞 が 組 織 幹 細 胞 か ら 発 生 す る と い う 説（ コ ー ン ハ イ ム 仮 説 ） を す で に 提 唱 し て お り ， 正 常 幹 細 胞 と 癌 幹 細 胞 の 関 係 の 重 要 性 を 示 唆 し た ．

近 年 induced pluripotent stem (iPS)細 胞 に 代 表 さ れ る よ う な ， 幹 細 胞 研 究 の 進 展 に よ り ， 多 能 性 幹 細 胞 に 関 連 し た 知 見 が 集 積 さ れ て き て

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お り ， 多 能 性 幹 細 胞 と し て の 特 徴 を 備 え た 細 胞 が 癌 幹 細 胞 と な り 得 る 可 能 性 ， す な わ ち 共 通 性 が 考 え ら れ て い る ．（ Lessard,J ら 2003 ， Barker ら 2009）

未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 マ ー カ ー と し て SSEA-3 ， SSEA-4 ， TRA-1-60 ， TRA-1-81 が 用 い ら れ て い る が こ れ ら の エ ピ ト ー プ は 糖 鎖 で あ り ，糖 鎖 構 造 の 特 異 性 を 認 識 す る 抗 体 が 広 く 用 い ら れ ， 組 織 幹 細 胞 マ ー カ ー と は 性 質 が 異 な っ て い る ．（ Adewumi ら 2007，Wright ら 2009）特 定 の 糖 鎖 構 造 を 認 識 結 合 す る タ ン パ ク 質 の 総 称 と し て レ ク チ ン が 存 在 し ， こ れ ら ， 未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 の 表 面 上 の 特 異 的 な 糖 鎖 構 造 を 認 識 ， 結 合 で き る レ ク チ ン の 存 在 が 想 定 さ れ た ． 2013 年 ， レ ク チ ン ア レ イ よ り Burkholderia cenocepacia (バ ー ク ホ ル デ リ ア ・ セ ノ セ パ シ ア 菌 )に 由 来 す る リ コ ン ビ ナ ン ト レ ク チ ン rBC2LCN は こ の 未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 の 特 異 的 な 糖 鎖 構 造 を 認 識 し ， か つ 分 化 し た 体 細 胞 で は 糖 鎖 構 造 の 変 化 か ら そ の 結 合 は 失 わ れ る 事 が 報 告 さ れ た ．（ Tateno ら 2013） さ ら に ， 蛍 光 色 を 結 合 さ せ た rBC2LCN を 用 い る 事 で ， 未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 を 生 存 状 態 の ま ま で 標 識 す る こ と や ， 再 生 医 療 に 腫 瘍 化 の 問 題 と な る 未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 の 残 存 を 効 果 的 に 検 出 ・ 除 去 す る 事 へ の 有 効 性 が 示 さ れ た ．（ Tateno ら 2013）こ の こ と か ら ，未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 は rBC2LCN 認 識 糖 鎖 を 発 現 し て い る が ， 一 方 で 癌 細 胞 集 団 内 に お い て そ の 糖 鎖 発 現 細 胞 が 存 在 す る の か ， ま た ， 発 現 細 胞 が 存 在 す る 場 合 ， 未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 の 持 つ 特 徴 を 有 す る 細 胞 で あ る の か ， 癌 幹 細 胞 と し て の 特 徴 を 有 す る か 否 か は 一 切 報 告 が な い ． 本 研 究 で は ， ヒ ト 口 腔 扁 平 上 皮 癌 (OSCC)に お け る 癌 幹 細 胞 を 標 的 と し た 新 し い 診 断 ・ 治 療 法 を 開 発 す る こ と を 目 指 し ， 未 分 化 多 能 性 幹 細

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胞 の 細 胞 表 面 上 に 発 現 す る 特 異 的 な 糖 鎖 構 造 を 認 識 す る レ ク チ ン で あ る rBC2LCN を 利 用 し ， ヒ ト 口 腔 扁 平 上 皮 癌 由 来 細 胞 株 よ り 分 離 し た rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 群 の 細 胞 ・ 分 子 生 物 学 的 特 性 の 解 析 を 行 っ た ．

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第 ２ 章 材 料 と 方 法

第 １ 節 細 胞 培 養 法 と 細 胞 の 調 整

１ ） 基 礎 栄 養 培 地 の 調 整

DMEM (Sigma-Aldrich) と Nutrient Mixture Ham F-12 (Sigma-Aldrich) (Ham, 1963) を 1: 1 に 混 合 し た 培 地 を Milli-Q 水 に 溶 解 し ， 90mg/L ペ ニ シ リ ン G ナ ト リ ウ ム ， 90mg/L カ ナ マ イ シ ン ， 165mg/L ピ ル ビ ン 酸 ナ ト リ ウ ム ， 20mM N-2 ヒ ド ロ キ シ エ チ ル ピ ペ ラ ジ ン -N-2-エ タ ン ス ル ホ ン 酸 (HEPES)及 び 2.0g/L 重 炭 酸 ナ ト リ ウ ム を 添 加 後 ，pH. 7.4 に 調 整 し ，PVDF メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー (孔 径 0.25μ m) で 濾 過 滅 菌 し ， DF 培 地 と し た (Barnes and Sato, 1980; Darmon, et al, 1981)．

２ ） 血 清 添 加 培 地 の 調 整

DF 基 礎 栄 養 培 地 に 5%ウ シ 血 清 （ SH30072.03， AQC23417， Hyclone） を 添 加 し ， DF5%CS 培 地 と し た ．

３ ） 無 血 清 培 地 の 調 整

DF 基 礎 栄 養 培 地 に ，human transferrin (5μ g/ml) (Sigma-Aldrich)， ヒ ト リ コ ン ビ ナ ン ト insulin (10 μ g/ml) (0105, KSK) ， 10µM 2-mercaptoethanol, 10µM 2-aminoethanol, 10nM sodium selenite (以 上 , 片 山 化 学 , 大 阪 )， oleic acid (4μ g/ml)（ oleic acid と fatty acid-free bovine serum albumin を 2:1 の モ ル 比 で 混 合 さ せ た FAF-BSA-oleic）(以 上 Sigma-Aldrich)の 6 種 類 の 因 子 (6F) を 加 え た

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無 血 清 培 地 を ， DF6F 培 地 と し た (Sato, et al, 1987; Myoken, et al, 1989)．

４ ） 細 胞 株 と 培 養 方 法

OSCC 由 来 細 胞 株 と し て ，著 者 の 所 属 す る 研 究 室 で 樹 立 し , 細 胞 バ ン ク に 登 録 さ れ て い る 以 下 の ２ 細 胞 株 を 用 い た ． UE (HO-1-U-1) 細 胞 株 （ Miyauchi, et al, 1985） , NA (HO-1-N-1) 細 胞 株 （ Miyauchi, et al, 1988）， を 用 い た ． 扁 平 上 皮 細 胞 株 と し て A431 外 陰 部 由 来 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 (Giard DJ, et al. 1973)を 用 い た ． こ れ ら の 細 胞 株 を DF6F 培 地 に て ， 100mm 径 培 養 皿 （ Beckton Dickinson Falcon, USA） 上 で ， 37℃ , 5%CO₂気 相 下 で 培 養 し た ．継 代 培 養 は 各 細 胞 の 増 殖 飽 和 前 に 以 下 の 方 法 で 行 っ た ． 細 胞 を 0.05% trypsin (Sigma-Aldrich)と 0.04% エ チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸 二 ナ ト リ ウ ム (EDTA ； 同 仁 化 学 ) を 含 む Dulbecco’ s Ca2 +_{, Mg}2 +_{-free phosphate-buffer saline (PBS(-))}

(Trypsin/EDTA) で 分 散 後 ， trypsin inhibitor (Sigma-Aldrich) で trypsin を 中 和 後 ， 継 代 培 養 を 行 っ た ． 第 ２ 節 各 細 胞 株 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 群 の 存 在 の 有 無 の 検 討 １ ）rBC2LCN-FITC に よ る フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー お よ び セ ル ソ ー テ ィ ン グ 各 細 胞 株 を 増 殖 飽 和 前 ま で 培 養 し ， 継 代 培 養 法 に 準 じ て Trypsin/EDTA に て 細 胞 を 分 散 後 ， Trypsin inhibitor で 中 和 し ， 単 一 細 胞 と し た ． こ れ ら の 細 胞 を Running buffer に 浮 遊 さ せ た ． Running

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buffer は PBS(-)に 0.5% BSA と EDTA(2mM)を 加 え 作 製 し た . 続 い て , 40µm 径 の フ ィ ル タ ー を 通 過 さ せ た 細 胞 懸 濁 液 に 1:100 の 濃 度 で rBC2LCN-FITC（ Wako Japan） 添 加 し ， 1 時 間 室 温 で イ ン キ ュ ベ ー ト し た ．生 細 胞 と 死 細 胞 を 判 定 す る た め propidium iodine（ PI）（ Invitrogen USA）を 2µg/ml で 添 加 し 30 分 室 温 で イ ン キ ュ ベ ー ト し た ．次 に , こ の 細 胞 懸 濁 液 を SH800 セ ル ソ ー タ ー （ SONY Japan） に て フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 及 び ， セ ル ソ ー テ ィ ン グ を 行 い , こ れ ら 癌 細 胞 株 に お い て も rBC2LCN が 認 識 す る 糖 鎖 を 発 現 し て い る か 否 か を 検 討 し た ． ２ ） rBC2LCN-FITC を 用 い た ラ イ ブ セ ル イ メ ー ジ ン グ セ ル ソ ー テ ィ ン グ に て , rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 ， 及 び 陰 性 細 胞 を 分 離 後 , そ れ ぞ れ 6cm 径 細 胞 培 養 皿 （ Beckton Dickinson Falcon, USA ） に DF6F 無 血 清 培 地 を 用 い て 播 種 し ， 約 60％ コ ン フ ル エ ン ト 状 態 ま で 37℃ , 5%CO2 気 相 下 で 培 養 し た . 続 い て , rBC2LCN-FITC（ Wako Japan）

を 1:1000 の 濃 度 で 加 え た DF6F 培 地 に 交 換 し ， １ 時 間 37℃ , 5%CO2気

相 下 で 培 養 後 ， 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 （ Carl Zeiss, LSM700, Jena, Germany） を 用 い て 観 察 し た ．

３ ） rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 の 無 血 清 単 層 培 養 系 に お け る 細 胞 増 殖 能 の 検 討

セ ル ソ ー テ ィ ン グ に よ り ， rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 を 分 離 し ，24 穴 マ ル チ プ レ ー ト（ 16mm 径 ）（ Beckton Dickinson Falcon USA） に ， 各 ウ ェ ル あ た り 2×103_{/ml の 細 胞 密 度 で DF６ F 無 血 清 培 地 を 用 い}

て 播 種 し 無 血 清 単 層 培 養 を 行 い ， 6 日 間 継 日 的 に コ ー ル タ ー カ ウ ン タ ー に て 細 胞 数 を 計 測 し , 細 胞 増 殖 能 を 検 討 し た ．

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４ ） rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 の 無 血 清 浮 遊 培 養 系 に お け る 浮 遊 細 胞 塊 （ sphere） 形 成 能 の 比 較

セ ル ソ ー テ ィ ン グ で 分 離 し た rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 を ， 超 親 水 性 処 理 低 吸 着 性 細 胞 培 養 皿 Prime Surface (Sumitomo Bakelite Japan) (35mm 径 )上 に 5.0×102_{/ml の 細 胞 密 度 で 2 ml の DF6F を 用 い}

て 播 種 し 培 養 し た ． 播 種 直 後 に 全 て の 細 胞 が 単 一 で あ る こ と を 確 認 し た . １ ，３ ，５ ，７ 日 後 に 位 相 差 顕 微 鏡 ECLIPSE TE300（ Nikon, Japan） 下 で sphere 数 お よ び sphere 形 態 を 計 測 ・ 評 価 し た ． さ ら に ２ 週 間 後 に rBC2LCN-FITC（ Wako Japan） を 1:1000 の 濃 度 で 加 え た DF6F 培 地 に 交 換 し ， １ 時 間 37℃ , 5%CO2 気 相 下 で 培 養 後 ， 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 （ Carl Zeiss）を 用 い て sphere 細 胞 塊 中 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 の 存 在 様 態 を 観 察 し た ． 第 ３ 節 DNA マ イ ク ロ ア レ イ に よ る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 及 び 陰 性 細 胞 に お け る 遺 伝 子 発 現 の 解 析 １ ） Total RNA の 抽 出 と 定 量 Ho-1-U-1 細 胞 株 よ り セ ル ソ ー タ ー を 用 い て rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 を そ れ ぞ れ 分 離 後 ，6cm 径 細 胞 培 養 皿（ Beckton Dickinson Falcon） に 播 種 し DF6F 無 血 清 培 養 に て 増 殖 飽 和 前 ま で 増 殖 さ せ た ． Total RNA は Trizol regent (Invitrogen USA) を 用 い て 抽 出 し ， 分 光 光 度 計（ NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer，㈱ エ ル・エ ス・エ ス ， 東 京 ） に て total RNA 量 を 定 量 し た ． さ ら に バ イ オ ア ナ ラ イ ザ ー

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（ Agilent USA） を 用 い て total RNA integrity number（ 分 解 程 度 ） を 確 認 ・ 評 価 し た ．

２ ）cRNA の ラ ベ ル 化 ，ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン ，ス キ ャ ン 及 び 定 量 化 Agilent ラ ベ ル 化 キ ッ ト （ Agilent USA） を 用 い て ラ ベ ル 化 cRNA を 合 成 し ， 56℃ , 17 時 間 ハ イ ブ リ ダ イ ズ さ せ た ． ス キ ャ ニ ン グ と 定 量 化 は agilent ス キ ャ ナ を 用 い て 行 っ た （ Agilent USA）． 得 ら れ た デ ー タ は Excel（ Microsoft USA） に て 解 析 し た ．

第 ４ 節 rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 に お け る IGF-2 発 現 の 定 量 と そ の 機 能 評 価

１ ） Droplet digital PCR 法 を 用 い た rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 お よ び 陰 性 細 胞 に お け る IGF-2 mRNA 発 現 量 の 定 量

第 ３ 節 （ １ ） に 準 じ て 精 製 し た total RNA を テ ン プ レ ー ト に , SuperScript® VILO（ Invitrogen USA） を 用 い て cDNA を 合 成 し た ． 得 ら れ た cDNA を 1:100 に Nuclease-Free water で 希 釈 し ， QX100™ Droplet Digital™ PCR System (Bio-Rad US)を 用 い た droplet digital PCR 法 に て IGF-2 mRNA の 発 現 を 絶 対 定 量 し た ． Droplet digital PCR は 以 下 の 方 法 で 行 っ た . QX100 droplet generator （ Bio-Rad USA） に よ り お よ そ 2 万 個 の droplet (21 l)に cDNA， IGF-2 特 異 配 列 プ ラ イ マ ー （ F: GCTGGCAGAGGAGTGTCC R:GATTCCCATTGGTGTCTGGA）， ユ ニ バ ー サ ル プ ロ ー ブ #10（ Roche Germany）， 2XddPCR master mix（ Bio-Rad USA） を 分 配 し た ． 続 い て , C1000 Touch™ Thermal Cycler （ Bio-Rad USA）

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に よ り ，デ ィ ネ イ チ ャ ー 94℃ , 30 秒 ，ア ニ ー リ ン グ 及 び 伸 長 反 応 54℃ , 1 分 30 秒 の サ イ ク ル を 40 サ イ ク ル 行 い ，droplet 中 で PCR 反 応 を 行 っ た ． 反 応 後 の droplet は , QX100 droplet リ ー ダ ー に て ポ ジ テ ィ ブ droplet と ネ ガ テ ィ ブ droplet 数 を 計 測 す る こ と で ， IGF-2 mRNA の コ ピ ー 数 を 定 量 し た ． 対 照 と し て , Universal Probe Library Human GAPD Gene Assay（ Roche Germany） キ ッ ト を 用 い て GAPDH mRNA コ ピ ー 数 を 測 定 し , IGF-2 mRNA コ ピ ー 数 ÷GAPDH mRNA コ ピ ー 数 に よ り ， IGF-2 の relative expression を 求 め た ． ２ ） ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 お よ び 陰 性 細 胞 に お け る IGF-2 発 現 の 検 討 セ ル ソ ー テ ィ ン グ に よ っ て 分 離 し た rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 を そ れ ぞ れ 60mm 径 細 胞 培 養 皿 に DF6F 無 血 清 培 地 を 用 い て 播 種 し 増 殖 飽 和 前 ま で 培 養 後 に , PBS(-)に て 3 回 洗 浄 し RIPA バ ッ フ ァ ー （ 20mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1％ TritonX-100, pH7.4 ） に protease inhibitor cocktail P8340（ Sigma-Aldrich USA） を 1:100 濃 度 で 添 加 し た cell lysis buffer で 細 胞 を 回 収 し た ． 続 い て ,遠 心 (13,000g, 10 分 間 ) 後 上 清 を 回 収 し ， Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific USA)に て タ ン パ ク 量 を 定 量 し た . 次 に , 10µg の 各 サ ン プ ル を 12％ SDS-PAGE 法 に て 電 気 泳 動 後 ，PVDF メ ン ブ レ ン （ Bio-Rad USA） 上 に 転 写 し た ． メ ン ブ レ ン を ５ ％ ス キ ム ミ ル ク （ 雪 印 , 群 馬 ） に て 室 温 30 分 浸 漬 し ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た ． 一 次 抗 体 と し て 抗 IGF-2 抗 体 0.125µg/ml（ ab9574 rabbit polyclonal, abcam ）， 抗 β -actin 抗 体 0.5µg/ml（ 017-24551 mouse monoclonal, Wako） を

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TBS-T wash buffer（ 0.1％ Tween20） に て 希 釈 し ， 4℃ 下 overnight 処 理 し た ． メ ン ブ レ ン を TBS-T wash buffer に て 5 分 間 , ３ 回 洗 浄 後 ， HRP ラ ベ ル 化 抗 ウ サ ギ IgG 抗 体 57.5ng/ml（ GTX221666-01 GeneTex）及 び HRP ラ ベ ル 化 マ ウ ス IgG 抗 体 0.2µg/ml（ GTX221667-01 GeneTex） を TBS-T wash buffer に て 希 釈 し 室 温 下 30 分 間 処 理 し た ． メ ン ブ レ ン を TBS-T wash buffer に て 5 分 間 , ３ 回 洗 浄 後 , ECL 試 薬（ Bio-Rad USA） を 用 い て 化 学 発 光 さ せ ， デ ジ タ ル 検 出 シ ス テ ム ChemiDoc Imaging System（ Bio-Rad USA） に て 検 出 し た ．

３ ） rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 に お け る Akt-Pathway 分 子 の リ ン 酸 化 の 検 討

レ ク チ ン 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 を DF6F 培 地 を 用 い て 培 養 後 ,

phosphatase 及 び protease inhibitor 含 有 RIPA cell lysis Buffer に て 細 胞 を 溶 解 し , 13,000g, 10 分 間 遠 心 後 ， 上 清 を 回 収 し た ． BCA Protein Assay Kit に よ り タ ン パ ク 濃 度 を 定 量 し た ． 総 タ ン パ ク 20g に IRS-1 (Ser636/Ser639) ， PTEN (Ser380) ， Akt (Ser473) ， GSK-3alpha/beta (Ser21/Ser9) ，BAD (Ser136)， mTOR (Ser2448)， p70 S6Kinase (Thr389) ， S6Ribosome Protein (Ser235/Ser236) の 各 リ ン 酸 化 認 識 抗 体 結 合 ビ ー ズ を 加 え ，16 時 間 室 温 下 反 応 さ せ た ．こ れ に ビ オ チ ン 化 標 識 検 出 抗 体 を 加 え 30 分 反 応 さ せ た 後 , さ ら に ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン 結 合 PE（ phycoerythrin）を 加 え , 10 分 間 反 応 さ せ ，BioPlex200 シ ス テ ム（ Bio-Rad USA）に て Akt-Pathway 分 子 の リ ン 酸 化 を 解 析 し た ．

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４ ） IGF-2 及 び IGF-2 中 和 抗 体 の rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 及 び 陰 性 細 胞 の sphere 形 成 能 に 及 ぼ す 影 響

第 ２ 節 （ ４ ） の 方 法 に 準 じ て , rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 及 び 陰 性 細 胞 を 分 離 後 ， 細 胞 低 吸 着 性 デ ィ ッ シ ュ (Sumitomo Bakelite Japan) (35mm 径 )へ 播 種 し ， ヒ ト リ コ ン ビ ナ ン ト IGF-2(rhIGF-2)（ R&D USA） を 0， 1， 5， 10， 50ng/ml の 各 濃 度 で 添 加 し , DF6F を 用 い て 無 血 清 浮 遊 培 養 を 行 い , sphere 形 成 能 を 評 価 し た . ま た , IGF-2 中 和 抗 体 （ ab9574 rabbit polyclonal, abcam UK）を 0，0.1，0.5，1.0，2.5µg/ml の 濃 度 で 添 加 後 , 同 様 に sphere 能 を 検 討 し た ．

５ ） IGF-2 及 び IGF-2 中 和 抗 体 の rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 及 び 陰 性 細 胞 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 の 発 現 に 及 ぼ す 影 響

各 細 胞 を rhIGF-2（ R&D USA） (0， 1， 5， 10， 50ng/ml)及 び IGF-2 中 和 抗 体 （ ab9574 rabbit polyclonal, abcam UK） (0， 0.1， 0.5， 1.0， 2.5µg/ml)を そ れ ぞ れ 含 む DF6F 培 地 で ， 48 時 間 37℃ , 5%CO2気 相 下 で

培 養 し た . 続 い て , 第 4 節 ２ ） の 方 法 に 準 じ て タ ン パ ク 抽 出 ， 定 量 を 行 い , 各 サ ン プ ル (10µg)を 10％ SDS-PAGE に よ り 電 気 泳 動 後 ， PVDF メ ン ブ レ ン に 転 写 し た . 次 に , 一 次 抗 体 と し て rBC2LCN-FITC(1:2000 濃 度 )（ Wako Japan）及 び 抗 β -actin 抗 体 (0.5µg/ml)（ 017-24551 mouse monoclonal, Wako） を TBS-T wash buffer に 希 釈 し ４ ℃ 下 overnight 処 理 し た ． 続 い て , TBS-T wash buffer で 洗 浄 し ， 二 次 抗 体 と し て HRP ラ ベ ル 化 抗 FITC 抗 体 （ 1:2000 濃 度 ）（ P5100 Dako Denmark） 及 び HRP ラ ベ ル 化 抗 マ ウ ス IgG 抗 体 （ 0.2µg/ml）（ GTX221667-01 GeneTex） を 30 分 間 , 室 温 で 処 理 し た ． TBS-T wash buffer で 洗 浄 後 ECL 試 薬 に よ

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り 化 学 発 光 さ せ ， デ ジ タ ル 検 出 シ ス テ ム ChemiDoc Imaging System （ Bio-Rad USA ） に て 検 出 し た ． バ ン ド の 強 度 は Bio-Rad Image Lab software（ Bio-Rad USA） を 用 い て 定 量 し ， rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 量 を β -actin 発 現 量 で 割 っ た も の を relative expression と し て 算 出 し た ．

第 ５ 節 rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 及 び 陰 性 細 胞 の 培 養 上 清 (conditioned medium:CM)か ら の exosome の 精 製 と そ の 評 価

１ ） 各 細 胞 株 の CM か ら の exosome の 精 製

A431， Ho-1-N-1， Ho-1-U-1 細 胞 株 を 100mm 径 細 胞 培 養 皿 （ Beckton Dickinson Falcon）に DF6F 培 地 を 用 い て 播 種 し ，増 殖 飽 和 状 態 の 細 胞 を PBS(-)に て ２ 回 洗 浄 後 ，DF 基 礎 栄 養 培 地 に 交 換 し た ．48 時 間 37℃ ， ５ ％ CO2気 相 下 で 培 養 し ， 培 養 上 清 を conditioned medium (CM)と し て

回 収 し た ． CM を 1800rpm, 15 分 間 遠 心 後 , 0.45um フ ィ ル タ ー で ろ 過 し た . 続 い て , total exosome isolation® kit（ invitrogen USA） を 用 い て CM 中 の exoxome を 精 製 し た . タ ン パ ク 定 量 は Qubit® Protein Assay Kit （ Themo Fisher Scientific） に て 測 定 し た ．

２ ） ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ る exosome の 品 質 評 価

Exosome( 1µg)を 10％ あ る い は 12％ SDS-PAGE に て 電 気 泳 動・分 離 後 ， PVDF メ ン ブ レ ン に 転 写 し た ． 5％ ス キ ム ミ ル ク に て ブ ロ ッ キ ン グ を 行 い ， 一 次 抗 体 と し て Cytochrome C（ 556433 mouse monoclonal, Becton Dickinson 0.5µg/ml ）， CD9 （ sc-59140 Santa Cruz 0.5µg/ml ）， CD63 （ 353013 mouse monoclonal, BioLegend 5µg/ml），CD81（ sc-23962 mouse monoclonal, Santa Cruz 1µg/ml） を 4℃ 下 , 一 昼 夜 処 理 し た ． TBS-T

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に て 洗 浄 後 ，2 次 抗 体 と し て HRP ラ ベ ル 化 抗 マ ウ ス IgG 抗 体（ 0.2µg/ml） （ GTX221667-01 GeneTex）を 処 理 し ，室 温 下 30 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た ．TBS-T に て 洗 浄 し ，ECL 試 薬 に て 化 学 発 光 さ せ ，デ ジ タ ル 検 出 シ ス テ ム ChemiDoc Imaging System（ Bio-Rad USA） に て 検 出 し た ．

３ ） 精 製 Exosome の 細 胞 内 再 取 り 込 み 能 の 検 討

第 ５ 節（ １ ）で 得 ら れ た exosome 10g を , 等 量 の PKH26（ mini26-1KT sigma-aldrich 4uM） と 混 和 し 5 分 間 室 温 に て 反 応 し , exosome を 標 識 し た ． 限 外 ろ 過 フ ィ ル タ ー Amicon Ultra 0.5ml 100K （ Merck USA ） (14000g, 2 分 間 ４ 回 遠 心 し て , 未 反 応 PKH26 を 除 去 後 , PBS(-)に 懸 濁 し ， PKH26 標 識 exosome と し た ． PKH26 標 識 exosome(PKH26-exosome) を 0 ， 250 ， 500 ， 1000ng/ml の 濃 度 で 培 養 細 胞 に 添 加 し . 同 時 に Hoechst33342（ H3570 invitrogen USA 1:100000） に て 核 染 色 を 行 っ て 上 で ． 12 時 間 37℃ , 5%CO2 気 相 下 で イ ン キ ュ ベ ー ト 後 ， 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 （ Carl Zeiss, LSM700, Jena, Germany） で 観 察 し た ．

４ ） 各 細 胞 由 来 exosome の sphere 形 成 に 及 ぼ す 影 響 rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 及 び 陰 性 細 胞 を 分 取 し ， 第 ５ 節 （ １ ） の 方 法 に 準 じ て CM か ら exosome を 精 製 し た ．第 ５ 節（ ２ ）の 方 法 に よ り CD9 発 現 評 価 を 行 い ， rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 に 陰 性 細 胞 由 来 exosome を ，陰 性 細 胞 に 陽 性 細 胞 由 来 exosome を ，0,250,500,1000 ng/ml 濃 度 条 件 で 添 加 し ， Sphere 形 成 能 を 第 ２ 節 （ ４ ）の 方 法 に 従 っ て 検 討 し た ．

15 ５ ） 各 細 胞 由 来 exosome の rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 に 及 ぼ す 影 響 rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 ， 陰 性 細 胞 を 分 取 し ， 第 ５ 節 （ １ ） 及 び （ ２ ） の 方 法 に 従 い exosome を 精 製 し , さ ら に CD9 発 現 の 評 価 を 行 っ た 後 ， rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 に 陰 性 細 胞 由 来 exosome を ， ま た 陰 性 細 胞 に 陽 性 細 胞 由 来 exosome を ， 0,250,500,1000 ng/ml の 濃 度 で 48 時 間 DF6F で 培 養 後 ，rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 に 及 ぼ す 各 exosome の 影 響 を 第 ４ 節 （ ５ ） の 方 法 に 準 じ て ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 で 検 討 し た ．

16 第 ３ 章 結 果 １ ． 各 細 胞 株 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 群 の 同 定 と そ の 細 胞 特 性 １ ） 各 種 癌 細 胞 株 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 の 存 在 と そ の 存 在 比

A431， Ho-1-U-1， Ho-1-N-1 細 胞 株 を DF5%CS 培 地 で の 培 養 条 件 下 で 維 持 培 養 し ， フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に て rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 の 存 在 の 有 無 を 検 討 し た ． そ の 結 果 , こ れ ら の 細 胞 株 に は rBC2LCN 認 識 糖 鎖 を 発 現 す る 陽 性 細 胞 が 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た ． ま た そ の 全 細 胞 中 に お け る 存 在 比 は , Ho-1-N-1 細 胞 株 で は 1.5%， Ho-1-U-1 株 で は 2.0％ ， A431 株 で は 1.3％ で あ っ た （ 図 ２ ） . ま た , こ れ ら の 細 胞 株 を DF６ F 無 血 清 培 地 を 用 い た 培 養 条 件 下 で 20 継 代 後 に フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に て rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 の 存 在 比 を 検 討 し た と こ ろ , A431 細 胞 株 ，Ho-1-U-1 細 胞 株 に お い て は 陽 性 細 胞 の 顕 著 な 増 加 を 認 め た ． 一 方 , Ho-1-N-1 細 胞 株 で は ほ と ん ど 差 を 認 め な か っ た （ 図 ３ ） . ２ ） ソ ー テ ィ ン グ 後 の rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 の ラ イ ブ セ ル イ メ ー ジ ン グ と 継 代 培 養 後 の 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 率 の 変 化 の 検 討 A431，Ho-1-U-1，Ho-1-N-1 細 胞 株 よ り セ ル ソ ー タ ー に よ っ て rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 の 分 離 を 行 い ， 無 血 清 単 層 培 養 状 態 で ラ イ ブ セ ル イ メ ー ジ ン グ に て rBC2LCN 認 識 糖 鎖 の 発 現 状 態 の 確 認 を 行 う と 陽 性 細 胞 は 陰 性 細 胞 と 比 較 し て 強 い 蛍 光 が 見 ら れ た ．（ 図 ４ ）

17 一 継 代 後 に , rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 率 を セ ル ソ ー タ ー を 用 い て 検 討 し た 結 果 ， わ ず か 一 継 代 で , 陽 性 細 胞 群 か ら は 陰 性 細 胞 群 が ， ま た 陰 性 細 胞 群 か ら は 陽 性 細 胞 群 が 出 現 し て い た （ 図 ５ ） . 3) rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 に お け る 無 血 清 単 層 培 養 系 で の 増 殖 能 Ho-1-U-1 細 胞 株 を rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 に 分 離 し ， DF6F を 用 い た 無 血 清 単 層 培 養 系 に て 増 殖 能 を 比 較 し た と こ ろ ，各 群 の 増 殖 能 に 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た （ 図 ６ ） . 4) rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 に お け る 無 血 清 浮 遊 培 養 系 で の sphere 形 成 能 rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 に お け る sphere 形 成 能 は 陰 性 細 胞 の そ れ と 比 較 し , 早 期 に 大 き な 多 数 の sphere を 形 成 し た （ 図 ７ ）． ま た , sphere 数 は 有 意 に 陽 性 細 胞 で 亢 進 し て い た （ 図 ８ ） . 5) Sphere 細 胞 塊 中 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 の 存 在 動 態 rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 及 び 陰 性 細 胞 由 来 sphere に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 を ， ラ イ ブ セ ル イ メ ー ジ ン グ で 検 討 し た 結 果 ,陽 性 細 胞 由 来 sphere 及 び 陰 性 細 胞 由 来 sphere の い ず れ に お い て も , rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 が 存 在 し て い る 事 が 明 ら か に な っ た（ 図 ９ ）.

18 ２ ． DNA マ イ ク ロ ア レ イ に よ る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 及 び 陰 性 細 胞 に お け る 遺 伝 子 発 現 及 び そ の 比 較 検 討 解 析 １ ） rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 に お け る DNA マ イ ク ロ ア レ イ に よ る 遺 伝 子 発 現 の 差 異 DNA マ イ ク ロ ア レ イ の 解 析 の 結 果 , rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 に お い て 陰 性 細 胞 と 比 較 し て ２ ０ 倍 以 上 の 発 現 亢 進 を 示 し た 遺 伝 子 は 7 種 類 認 め た . 中 で も IGF-2 の 発 現 は , 陽 性 細 胞 に お い て 陰 性 細 胞 と 比 較 し て 60 倍 以 上 亢 進 し て い た （ 表 １ ） . ３ ． rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 に お け る IGF-2 遺 伝 子 及 び タ ン パ ク 発 現 の 定 量

１ ） droplet digital PCR に よ る IGF-2 mRNA 発 現 量 の 定 量

Droplet digital PCR 法 に よ る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 に お け る IGF-2 mRNA 発 現 量 比 較 で は 陽 性 細 胞 は 陰 影 細 胞 に 比 較 し て 約 ２ ０ 倍 発 現 が 亢 進 し て い た ．（ 図 １ ０ ） ２ ） ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ る IGF-2 発 現 量 の 比 較 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ る 解 析 で は rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 で は 陰 性 細 胞 に 比 較 し て 細 胞 内 に お け る IGF-2 タ ン パ ク 発 現 量 が 亢 進 し て い た ．（ 図 １ ０ ）

19 ４ . rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 に お け る Akt-Pathway 分 子 の リ ン 酸 化 1) rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 に お け る Akt-Pathway リ ン 酸 化 の 検 討 結 果 rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 で は 陰 性 細 胞 と 比 較 し て IRS-1 (Ser636/Ser639) ， PTEN (Ser380)， Akt (Ser473）， GSK-3alpha/beta (Ser21/Ser9) ， BAD (Ser136 ）， mTOR (Ser2448 ）， p70 S6Kinase (Thr389) ， S6Ribosome Protein (Ser235/Ser236)リ ン 酸 化 サ イ ト で の リ ン 酸 化 が 亢 進 し て い た ．（ 図 １ １ ）

こ れ ら の 結 果 か ら rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 で は IGF-Akt Pathway の 機 能 亢 進 性 の リ ン 酸 化 亢 進 状 態 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た ．（ 図 １ ２ ）

５ . IGF-2 及 び IGF-2 中 和 抗 体 の 各 細 胞 に お け る sphere 形 成 及 び rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 に 及 ぼ す 影 響

1) IGF-2 及 び IGF-2 中 和 抗 体 の sphere 形 成 に 及 ぼ す 影 響

IGF-2 お よ び ，IGF-2 中 和 抗 体 の ，rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 の sphere 形 成 能 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た ． IGF-2 は 1,5,10,50ng/ml 濃 度 で 検 討 し た 結 果 , 濃 度 依 存 的 に 陰 性 細 胞 に お け る sphere 形 成 能 を 促 進 し た . 一 方 , IGF-2 中 和 抗 体 は 0.1,0.5,1.0,2.5µg/ml の 濃 度 で 検 討 し た 結 果 , で 陽 性 細 胞 の sphere 形 成 能 を 低 下 さ せ る こ と が 示 さ れ た （ 図 13） .

20 2) IGF-2 及 び IGF-2 中 和 抗 体 の rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 に 及 ぼ す 影 響 IGF-2 及 び IGF-2 中 和 抗 体 の 各 細 胞 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 へ の 影 響 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に て 検 討 し た ． IGF-2 は 1,10,50ng/ml 濃 度 で 検 討 し た 結 果 , 濃 度 依 存 的 に rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陰 性 細 胞 に お け る 糖 鎖 の 発 現 を 上 昇 さ せ た . 一 方 で , IGF-2 中 和 抗 体 は 0.5,1.0,2.5µg/ml の 濃 度 で , rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 に お け る 糖 鎖 発 現 を 低 下 さ せ た （ 図 14） . ６ ． rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 に お け る exosome の 細 胞 生 物 学 的 差 異 の 検 討 １ ） 各 細 胞 株 由 来 CM か ら の exosome 精 製 と そ の 評 価 A431，Ho-1-N-1,Ho-1-U-1 細 胞 株 由 来 CM か ら そ れ ぞ れ exosome を 精 製 し ， 評 価 し た ． 得 ら れ た exosome は , ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト に て cytochrome C の 発 現 を 認 め な か っ た こ と か ら , 細 胞 成 分 の コ ン タ ミ ネ ー シ ョ ン は 無 い こ と が 示 さ れ た （ 図 15） . さ ら に ， exosome マ ー カ ー と し て 知 ら れ て い る CD9， CD63,及 び CD81 の 精 製 exosome に お け る 発 現 を 検 討 し た 結 果 ， こ れ ら の マ ー カ ー は 細 胞 分 画 に お い て 発 現 を 認 め た が ， 精 製 exosome で は CD9 の み が 発 現 さ れ て い る 事 が 明 ら か と な っ た（ 図 15）. 精 製 exosome が 細 胞 に 再 取 り 込 み さ れ る か 否 か に つ い て , PKH26 に て 標 識 し た exosome を 用 い て 検 討 し た と こ ろ ，exosome の 濃 度 依 存 的 に 赤 色 の 蛍 光 小 胞 が 標 的 細 胞 内 に 確 認 さ れ た こ と か ら ， 精 製 exosome は 細 胞 内 へ の 再 取 り 込 み 能 を 有 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た （ 図 16） .

21 ２ ） rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 及 び 陰 性 細 胞 由 来 exosome の 各 細 胞 に お け る sphere 形 成 能 に 及 ぼ す 影 響 rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 由 来 exosome は , 陰 性 細 胞 の sphere 形 成 能 を 促 進 し , sphere 数 の 増 加 と 大 き さ の 著 し い 亢 進 が 認 め ら れ た . 特 に , 500， 1000ng/ml の 濃 度 で 有 意 に ス フ ェ ア 形 成 能 を 促 進 し た . ま た さ ら に ，陰 性 細 胞 由 来 の exosome は , 陽 性 細 胞 の sphere 形 成 能 を 抑 制 す る 傾 向 を 示 し , 、特 に 250ng/ml の exoxome 濃 度 で は 有 意 に ス フ ェ ア 形 成 を 低 下 さ せ た ．（ 図 17, 18） . ３ ） rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 及 び 陰 性 細 胞 由 来 exosome の 各 細 胞 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 に 及 ぼ す 影 響 （ ２ ）と 同 様 に , 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 由 来 exosome の , そ れ ぞ れ 陰 性 細 胞 及 び 陽 性 細 胞 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た 結 果 , 陽 性 細 胞 由 来 exosome は 濃 度 依 存 的 に 陰 性 細 胞 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 を 亢 進 さ せ た （ 図 19） .

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第 ４ 章 考 察

悪 性 腫 瘍 が 幹 細 胞 を 起 源 と す る 仮 説 は ， First formulated in 1875, Julius Cohnheim, proposed that stem cell misplaced during embryonal development were the source of tumors later in the life <embryonal-rest theory >, Bruce ら (Bruce, et al, 1963) が , 悪 性 腫 瘍 内 の 少 数 の 細 胞 の み が 腫 瘍 形 成 能 を 有 す る こ と か ら ， 悪 性 腫 瘍 は 自 己 複 製 能 を 有 す る 少 数 の 特 別 な 癌 細 胞 に よ り 維 持 さ れ て い る と い う 仮 説 を 報 告 し た こ と に 端 を 発 す る ． し か し な が ら ， こ の 仮 説 は 広 く 受 け 入 れ ら れ ず ， 悪 性 腫 瘍 は 均 一 な 癌 細 胞 集 団 と ， こ れ ら 細 胞 集 団 が 巻 き 込 ん だ 正 常 細 胞 か ら 構 成 さ れ る ヘ テ ロ 細 胞 集 団 と 考 え ら れ ， 悪 性 腫 瘍 の 大 部 分 を 占 め る い わ ゆ る 癌 細 胞 （ 非 癌 幹 細 胞 ） を 対 象 と し た 研 究 が 精 力 的 に 進 め ら れ て き た ．し か し 1994 年 に ，急 性 骨 髄 性 白 血 病（ AML） に お い て 癌 幹 細 胞 様 の 細 胞 集 団 が 同 定 さ れ (Lapidot, et al, 1994)， そ れ が 組 織 幹 細 胞 の 細 胞 生 物 学 的 特 性 と 類 似 し て お り ， CD34+CD38-の 表 現 型 を 持 つ 白 血 病 幹 細 胞 の み が 免 疫 不 全 マ ウ ス で の 造 腫 瘍 性 を 有 す る 事 が 示 さ れ ， 造 血 幹 細 胞 と し て の 表 現 型 と 類 似 し て い る こ と が 証 明 さ れ た ．以 来 ，さ ま ざ ま な 固 形 腫 瘍 に も 幹 細 胞 が 存 在 し ，腫 瘍 の 発 生 ・ 進 展 ・ 維 持 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 可 能 性 が 明 ら か に さ れ つ つ あ る ． つ ま り ， 癌 組 織 に は 自 己 複 製 能 を 有 し ， 半 永 久 的 に 娘 細 胞 を 生 み 続 け る 少 数 の 細 胞 群 と ， 高 い 増 殖 能 を 持 つ が ， 最 終 的 に は 分 化 や 老 化 に よ り 増 殖 能 を 失 う 大 多 数 の 細 胞 群 か ら な る こ と が 明 ら か に な っ て き た .こ の こ と は ，正 常 の 組 織 幹 細 胞 と そ れ か ら 生 じ た 分 化 細 胞 の よ う な 関 係 が 癌 組 織 に も 存 在 し て い る こ と を 示 唆 し て い る ． こ の よ う な 幹 細

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胞 様 の 癌 細 胞 つ ま り 癌 幹 細 胞 は , 放 射 線 や 抗 癌 剤 に 対 す る 抵 抗 性 も 高 い こ と が 予 想 さ れ て い る . 事 実 , 化 学 療 法 , 放 射 線 療 法 や 手 術 療 法 後 , 臨 床 的 に CR を 示 し た 症 例 が 数 年 後 に 再 発 す る 事 は よ く 経 験 す る が ,こ れ ら 治 療 抵 抗 性 や 再 発 例 に 癌 幹 細 胞 が 関 与 し て い る と 考 え ら れ る ． (Dalerba, et al, 2007; Trumpp, et al, 2008; Visvader, et al, 2008; Jones, et al, 2009) 癌 幹 細 胞 は ， 正 常 組 織 幹 細 胞 そ の も の に 遺 伝 子 変 化 が 蓄 積 し た 細 胞 な の か ，あ る い は 正 常 幹 細 胞 か ら 分 化 方 向 へ ト ラ ン ジ ッ ト 中 の 細 胞 に 遺 伝 子 変 化 が 蓄 積 し 癌 化 し た 細 胞 な の か ，あ る い は 変 異 が 蓄 積 し た ト ラ ン ジ ッ ト 細 胞 に 何 ら か の リ プ ロ グ ラ ミ ン グ が 起 こ り 幹 細 胞 機 能 を 再 獲 得 し た 細 胞 な の か 不 明 で あ る が ， 癌 の 起 源 と な る 細 胞 と 考 え ら れ て お り ， 癌 幹 細 胞 と 組 織 幹 細 胞 と の 間 に は ， そ の 自 己 複 製 能 や 分 化 能 の 制 御 機 構 に 多 く の 共 通 性 が あ る こ と が 予 想 さ れ る ．（ Lessard,J ら 2003， Barker ら 2009） 人 工 多 能 性 幹 （ iPS） 細 胞 は （ Takahashi ら 2007）， エ ピ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク な 変 化 が 起 こ っ て い る 分 化 し た 体 性 細 胞 に , oct3/4, sox2, klf4, c-Myc の 4 種 類 の 遺 伝 子 を 導 入 す る こ と に よ り ， 自 己 複 製 能 と 多 分 化 能 を 再 獲 得 し た 細 胞 で あ る が ， こ れ ら 遺 伝 子 の う ち ， c-myc は 癌 遺 伝 子 で あ り klf4 は 癌 遺 伝 子 あ る い は 癌 抑 制 遺 伝 子 と し て も 機 能 す る こ と か ら ， iPS 細 胞 の 誘 導 機 構 に 類 似 し た 機 構 が 癌 幹 細 胞 の 誘 導 に も 関 与 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ て い る ． 一 方 ， 組 織 幹 細 胞 な ど の 正 常 幹 細 胞 が 未 分 化 性 と 多 分 化 能 を 維 持 す る た め に は ， そ れ を 可 能 に す る 微 小 環 境 (ニ ッ チ )が 必 要 と 考 え ら れ て お り ， ニ ッ チ 内 で 幹 細 胞 の 数 や 細 胞 分 裂 ， 分 化 が 制 御 さ れ て い る 可 能 性 が 高 い ． し た が っ て ， 癌 幹 細 胞 に お い て も ， 正 常 組 織 幹 細 胞 と 類 似 し た 自 己 複 製 能 と 分 化 能 を 維 持 す

24 る 機 構 す な わ ち ニ ッ チ が 存 在 し て い る 可 能 性 が 高 い （ 図 1） . そ こ で 私 は ，ES/iPS 細 胞 な ど の 未 分 化 な 多 能 性 幹 細 胞 が 特 異 的 に 発 現 す る 糖 鎖 構 造 を 認 識 す る レ ク チ ン で あ る rBC2LCN の 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 の 幹 細 胞 マ ー カ ー と し て の 可 能 性 を 検 討 し ， そ の 腫 瘍 形 成 の メ カ ニ ズ ム と が ん 微 小 環 境 （ ニ ッ チ ） の 維 持 メ カ ニ ズ ム を 解 明 し ， 放 射 線 感 受 性 や 腫 瘍 発 生 メ カ ニ ズ ム を 明 ら か に す る こ と を 目 指 し た ． rBC2LCN 認 識 糖 鎖 は 未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 の 細 胞 表 面 上 に 発 現 す る 糖 タ ン パ ク の ポ ド カ リ ク シ ン に 付 加 さ れ る 特 異 的 な 糖 鎖 構 造 を 認 識 し て い る と 考 え ら れ て い る （ Tateno ら 2013）. こ の 糖 鎖 抗 原 は ES 細 胞 や iPS 細 胞 な ど の 未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 に の み 発 現 し ， ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 分 化 し た 細 胞 や 体 性 細 胞 で は 発 現 し な い（ Tateno ら 2013）．糖 鎖 発 現 状 態 は 糖 転 位 酵 素 に よ り コ ン ト ロ ー ル さ れ て い る と 考 え ら れ て い る が ， そ の 詳 細 な メ カ ニ ズ ム に つ い て は 未 だ 不 明 な 点 が 多 い （ Kizuka ら 2014） . rBC2LCN 認 識 糖 鎖 は 機 能 的 な 側 面 は 未 だ 不 明 で あ る が ， 未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 に お け る 機 能 維 持 に 関 連 し て 発 現 し て い る も の と 考 え ら れ て い る （ Tateno ら 2013） . rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 細 胞 は 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 Ho-1-U-1 細 胞 株 及 び Ho-1-N-1 細 胞 株 で そ れ ぞ れ 2.0％ 及 び 1.5％ 存 在 し た .ま た , 外 陰 部 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 で あ る A431 細 胞 株 に お い て も 1.3%の 陽 性 細 胞 の 存 在 が 認 め ら れ た ． こ れ ら 細 胞 は 無 血 清 浮 遊 培 養 系 で 陰 性 細 胞 に 比 較 し て 高 い sphere 形 成 能 を 示 し た こ と か ら , 癌 幹 細 胞 と し て の 特 徴 を 持 つ こ と が 明 ら か と な っ た ． こ の こ と か ら ， 未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 に 特 異 的 な 糖 鎖 抗 原 と ， 癌 幹 細 胞 に お け る 糖 鎖 抗 原 の 発 現 が 共 通 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ． 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 の 特 性 を 明 ら か に す る た め に ,各 細 胞 を セ ル ソ

25 ー タ ー に よ り 分 離 し ， 無 血 清 単 層 培 養 系 で 継 代 を す る と ， わ ず か １ 継 代 後 で も 陽 性 細 胞 群 か ら 陰 性 細 胞 群 が ， 陰 性 細 胞 群 か ら 陽 性 細 胞 が 出 現 し た こ と ， さ ら に ， 陽 性 細 胞 由 来 sphere 及 び 陰 性 由 来 sphere の い ず れ に も 陽 性 細 胞 が 含 ま れ て い た こ と か ら ， 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 は 互 い に ト ラ ン ジ ッ ト す る 関 係 に あ る と 考 え ら れ た ． さ ら に ， 血 清 培 養 系 か ら 無 血 清 培 養 系 へ の 変 更 に よ っ て こ れ ら の 変 化 が 生 じ た こ と か ら , こ れ ら の 発 現 は ， 何 ら か の 因 子 に よ っ て 制 御 さ れ て い る 事 が 強 く 示 唆 さ れ た ． DNA マ イ ク ロ ア レ イ を 用 い た 解 析 で は 陽 性 細 胞 に お い て 陰 性 細 胞 と 比 較 し IGF-2 の 発 現 が 60 倍 以 上 亢 進 し て お り ， droplet digital PCR 及 び ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト の 結 果 か ら も ， 陽 性 細 胞 に お い て IGF-2 の mRNA と タ ン パ ク レ ベ ル で の 発 現 亢 進 が 認 め ら れ る 事 が 明 ら か に な っ た ． こ の こ と か ら , 陽 性 細 胞 の 機 能 維 持 に お い て IGF-2 が 重 要 な 機 能 を 担 っ て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た ． 各 細 胞 に お け る IGF-2 に 関 わ る 細 胞 シ グ ナ ル 伝 達 pathway を 明 ら か に す る た め , IGF-Akt pathway 分 子 の リ ン 酸 化 に つ い て 検 討 し た と こ ろ ， 陽 性 細 胞 で は 陰 性 細 胞 に 比 較 し て , 一 様 に Akt-Pathway 分 子 の リ ン 酸 化 が 促 進 し て い る 事 が 明 ら か に な っ た ． Akt-Pathway は 細 胞 の 生 存 ， 増 殖 ， 分 化 ， 糖 代 謝 ， タ ン パ ク 質 合 成 の 機 能 を 担 う 重 要 な シ グ ナ ル 伝 達 系 で あ り ， 癌 幹 細 胞 と し て の 機 能 維 持 に 重 要 な 機 能 を 果 た し て い る と 考 え ら れ た ． IGF-2 が 糖 鎖 発 現 に 重 要 な 機 能 を 果 た し て い る 可 能 性 は , リ コ ン ビ ナ ン ト IGF-2 が 陰 性 細 胞 の sphere 形 成 能 を 濃 度 依 存 的 に 促 進 し た こ と ， ま た rBC2LCN 認 識 糖 鎖 の 発 現 を 亢 進 し た 事 , さ ら に は IGF-2 中 和 抗 体 が 陽 性 細 胞 の sphere 形 成 や rBC2LCN 認 識 糖 鎖 の 発 現 を 低 下 さ せ た こ と か ら も 強 く 裏 付 け ら れ た ．

26 近 年 , IGF-2 及 び そ の シ グ ナ ル 分 子 を タ ー ゲ ッ ト と し た 分 子 標 的 治 療 薬 の い く つ か が 臨 床 試 験 段 階 に あ る こ と が 報 告 さ れ て い る （ Helen ら 2013） . こ れ ら は IGF-2 を タ ー ゲ ッ ト と し た 中 和 抗 体 ， IGF-2 の レ セ プ タ ー で あ る IGF-1R に 対 す る 競 合 抗 体 ， IGF-1R の チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 活 性 阻 害 剤 等 で あ る ． こ れ ら 薬 剤 を 用 い る こ と で ， 本 研 究 に お い て 明 ら か に な っ た 幹 細 胞 に お け る 機 能 維 持 に 重 要 な IGF-2 の 機 能 阻 害 を 行 う と い う ， 癌 幹 細 胞 を タ ー ゲ ッ ト と し た 治 療 戦 略 の 展 開 が 期 待 さ れ る （ 図 20） . rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 に お け る exosome の 生 物 活 性 の 差 異 を 検 討 す る こ と で ， 各 細 胞 間 の 相 互 作 用 ， ニ ッ チ 形 成 に つ い て の メ カ ニ ズ ム を 明 ら か に し た ． Exosome は 直 径 40nm～ 150nm 程 度 の 細 胞 外 小 胞 で あ り ，Johnstone ら に よ り 命 名 さ れ た（ Johnstone ら 1983）. Exosome 小 胞 中 に は タ ン パ ク 質 ，mRNA, miRNA 等 の 情 報 伝 達 物 質 が 内 包 さ れ て い る ． こ の た め ， 細 胞 間 の 情 報 伝 達 に 関 わ り ， 形 質 の 伝 播 や 癌 細 胞 ニ ッ チ 形 成 に 関 わ っ て い る こ と が 考 え ら れ る ． 本 研 究 で は ま ず ， 扁 平 上 皮 細 胞 株 A431，Ho-1-N-1，Ho-1-U-1 細 胞 株 よ り ポ リ マ ー 沈 殿 法 に て exosome の 精 製 を 行 っ た ． 精 製 し た exosome に は ミ ト コ ン ド リ ア 内 膜 成 分 で あ る cytochrome C は 検 出 さ れ ず ，細 胞 成 分 の コ ン タ ミ ネ ー シ ョ ン が 無 い こ と が 確 認 さ れ た ． ま た ， 本 精 製 exosome は exosome マ ー カ ー と し て テ ト ラ ス パ ニ ン フ ァ ミ リ ー で あ る CD9 を 発 現 し て い る 事 が 明 ら か に な っ た ． CD9 は 肺 が ん 細 胞 由 来 exosome 等 に お い て も 発 現 の 見 ら れ る exosome マ ー カ ー で あ る （ Yoshioka ら 2013 ） . ま た ， exosome は 精 製 過 程 で exosome の 細 胞 再 取 り 込 み 機 能 が 低 下 す る 可 能 性 が 報 告 さ れ て い る た め ， PKH26 標 識 exosome に よ る 細 胞 内 再 取 り 込 み 能 を 検 討 し た 結 果 , 濃 度 依 存 的 に exosome の 細 胞 内 取 り 込 み が 確 認

27 さ れ た こ と か ら , 本 精 製 exosome の ク オ リ テ ィ ー が 担 保 さ れ て い る こ と が 確 認 さ れ た ．今 回 , 無 血 清 培 養 系 で 長 期 間 培 養 し て い る 細 胞 の CM か ら 精 製 し た 精 製 し た exoxome は CD9 の み を 発 現 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た .腫 瘍 細 胞 由 来 exoxsome で は , CD9 に 加 え て CD63 及 び CD81 が 発 現 さ れ て い る こ と が 報 告 さ れ て い る （ Yoshioka ら 2013） . こ れ は exosome の 精 製 方 法 に も 依 存 し て い る 可 能 性 は 否 定 で き な い も の の , こ れ ら の 報 告 は 血 清 添 加 培 地 を 用 い て 培 養 し た 細 胞 か ら 精 製 し た exoxome の 解 析 で あ る こ と か ら , CD63 や CD81 発 現 exosome は 血 清 由 来 の も の で あ る 可 能 性 が 考 え ら れ た . rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 の CM か ら 精 製 し た exosome を , そ れ ぞ れ 陰 性 細 胞 及 び 陽 性 細 胞 に 0,250,500,1000ng/ml の 濃 度 で 処 理 し , rBC2LCN 認 識 糖 鎖 の 発 現 及 び sphere 形 成 能 を 検 討 し た と こ ろ ， 陽 性 細 胞 由 来 の exosome は 陰 性 細 胞 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 の 発 現 及 び sphere 形 成 能 を 濃 度 依 存 的 に 亢 進 し た ． 一 方 , 陰 性 細 胞 由 来 exosome は 陽 性 細 胞 に お け る sphere 形 成 能 を 低 下 さ せ る 傾 向 を 認 め , 250ng/ml の 濃 度 で は 有 意 に 低 下 さ せ た ．こ の こ と か ら ，陽 性 細 胞 由 来 の exosome に は 陰 性 細 胞 を 陽 性 細 胞 へ ト ラ ン ジ ッ ト さ せ る 活 性 を 有 し て い る 事 が 考 え ら れ た ． こ の こ と は ， 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 は exosome を 介 し て communicate し ， 癌 細 胞 ニ ッ チ 形 成 に お い て 重 要 な 機 能 を 果 た し て い る と 考 え ら れ た ． 陽 性 細 胞 由 来 exosome が , 陰 性 細 胞 か ら 陽 性 細 胞 へ の ト ラ ン ジ シ ョ ン を 引 き 起 こ す 機 構 は 不 明 で あ る が ，exosome 内 に 含 ま れ る 細 胞 増 殖 因 子 , miRNA や そ の 他 の 活 性 物 質 の 存 在 が 単 独 あ る い は 連 携 し て そ の 機 能 を 果 た し て い る も の と 考 え ら れ た ． し た が っ て ， rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 由 来 exosome は , 癌 幹 細 胞 を 含 む 扁 平 上 皮 癌 の 診 断 ・ 治 療 の タ ー ゲ ッ ト と な り 得 る 可 能 性 が 示 さ れ た （ 図

28 21） . Tateno ら , 及 び Hirabayashi ら は , 細 胞 障 害 性 毒 素 結 合 rBC2LCN を 用 い て ，ES 細 胞 や iPS 細 胞 由 来 分 化 細 胞 に よ る 再 生 医 療 時 に お い て 発 が ん 性 な ど の 問 題 と な る 残 存 し た 未 分 化 幹 細 胞 を 効 果 的 に 除 去 す る こ と が で き る こ と を 報 告 し て い る （ Tateno ら 2015 ， Hirabayashi ら 2015） . 本 研 究 で は 未 分 化 多 能 性 幹 細 胞 に 発 現 し rBC2LCN に 認 識 さ れ る 糖 鎖 抗 原 が 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 に お い て も 発 現 し ， か つ 癌 幹 細 胞 と し て の 特 徴 を 有 し て い た こ と か ら ， 同 様 の 戦 略 に よ り ， 選 択 的 ・ 効 果 的 に rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 癌 幹 細 胞 を 殺 滅 で き る 可 能 性 が 考 え ら れ た ． 以 上 の こ と か ら ，未 分 化 な ES/iPS 細 胞 が 特 異 的 に 発 現 す る , rBC2LCN レ ク チ ン で 認 識 さ れ る 糖 鎖 構 造 を 有 す る 細 胞 が , 各 種 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 に お い て も 存 在 し , 同 細 胞 が 癌 幹 細 胞 と し て 機 能 し て い る 可 能 性 が 示 さ れ た こ と か ら , 糖 鎖 発 現 細 胞 は 癌 化 に 深 く 関 わ っ て い る こ と が 考 え ら れ た ． ま た , IGF-2 及 び exosome は 癌 幹 細 胞 ニ ッ チ の 機 能 維 持 に 重 要 な 機 能 を 果 た し て い る こ と が 考 え ら れ , rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 細 胞 ， IGF-Akt Pathway 及 び exosome を 標 的 と し た 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 の 診 断 ・ 治 療 へ の 応 用 が 考 え ら れ た ．

29 総 括 本 研 究 で は ， ヒ ト 口 腔 扁 平 上 皮 癌 に お け る 癌 幹 細 胞 を 標 的 と し た 新 し い 診 断 ・ 治 療 法 を 開 発 す る こ と を 目 指 し ， ヒ ト 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 よ り 分 離 し た rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 群 の 細 胞 ・ 分 子 生 物 学 的 特 性 解 析 を ， 無 血 清 培 養 系 を 用 い て 行 っ た ． そ の 結 果 以 下 の 事 が 明 ら か と な っ た ． １ ） rBC2LCN が 認 識 す る , 未 分 化 な ES/iPS 細 胞 が 特 異 的 に 発 現 す る 糖 鎖 構 造 を 有 す る 細 胞 が , 各 種 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 に お い て も 存 在 し て い る こ と が 明 ら か と な り , そ の 存 在 比 率 は 1.5% ～ 2.0 ％ で あ っ た ２ ） rBC2LCN 認 識 糖 鎖 を 発 現 す る 扁 平 上 皮 癌 細 胞（ レ ク チ ン 陽 性 細 胞 ） は が ん 幹 細 胞 と し て の 性 質 を 有 し て い る 可 能 性 が 示 さ れ た ３ ） レ ク チ ン 陽 性 細 胞 で は 陰 性 細 胞 と 比 較 し て , IGF-2 遺 伝 子 ・ タ ン パ ク 発 現 の 亢 進 , 及 び IGF-Akt pathway の 活 性 化 を 認 め , IGF-2 は 陰 性 細 胞 の 陽 性 細 胞 へ の ト ラ ン ジ ッ ト を 促 進 し た ． ４ ） 陽 性 細 胞 由 来 exosome は 陰 性 細 胞 の 陽 性 細 胞 へ の ト ラ ン ジ ッ ト を 促 進 し た 以 上 の こ と か ら ，未 分 化 な ES/iPS 細 胞 が 特 異 的 に 発 現 す る 糖 鎖 構 造 を 有 す る 細 胞 が , 各 種 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 に お い て も 存 在 し , 同 細 胞 が 幹 細 胞 と し て 機 能 し て い る 可 能 性 が 示 さ れ た こ と か ら , 糖 鎖 発 現 細 胞 は 癌 化 に 深 く 関 わ っ て い る こ と が 考 え ら れ た ． IGF-2 及 び exosome は が ん 幹 細 胞 ニ ッ チ の 機 能 維 持 に 重 要 な 機 能 を 果 た し て い る こ と が 考 え ら れ , rBC2LCN 認 識 糖 鎖 発 現 細 胞 ， IGF-Akt

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Pathway 及 び exosome を 標 的 と し た 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 の 診 断 ・ 治 療 へ の 応 用 が 考 え ら れ た ．

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参 考 文 献

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図 ３ ： 無 血 清 培 養 下 に お け る 各 種 癌 細 胞 株 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 存 在 率

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図 ４ ： rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 ソ ー テ ィ ン グ 後 に ラ イ ブ セ ル イ メ ー ジ ン グ に て rBC2LCN 認 識 糖 鎖 の 発 現 状 態 を 検 討

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図 ５ ： rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 を ソ ー テ ィ ン グ 後 に 一 継 代 し た 際 の rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 存 在 比 の 検 討

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図 ６ ： rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 の 無 血 清 単 層 培 養 系 に お け る 増 殖 能

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図 ７：rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 細 胞 に お け る sphere 形 成 能 検 討

図 ８ ：

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図 ９ ： rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 由 来 sphere 中 に お け る rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 存 在 動 態

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表 １ ： DNA マ イ ク ロ ア レ イ に よ り rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 に お い て 陰 性 細 胞 に 比 較 し て ２ ０ 倍 以 上 発 現 亢 進 の 見 ら れ た 遺 伝 子 群

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図 １ ０ ： rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 と 陰 性 に お け る IGF-2 発 現 の 検 討 （ 左 ： droplet digital PCR 法 に よ る 解 析 ， 右 ： ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト

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図 １ １ ： rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 お よ び 陰 性 細 胞 に お け る IGF-Akt pathway の リ ン 酸 化 状 態 評 価

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図 １ ２ ： rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 細 胞 お よ び 陰 性 細 胞 に お け る IGF-Akt pathway の リ ン 酸 化 状 態 評 価

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図 １ ３ ： IGF-2 及 び IGF-2 中 和 抗 体 の rBC2LCN 認 識 糖 鎖 陽 性 及 び 陰 性 細 胞 の sphere 形 成 数 に 及 ぼ す 影 響