東北医科薬科大学
審査学位論文（博士）要旨
氏名（本籍） ｱﾗﾂ ﾕｳｽｹ
荒 津 佑 輔（福岡県）
学位の種類 博士（薬科学）
学位記番号 博薬科第10号
学位授与の日付 平成30年3月9日
学位授与の要件 学位規則第４条１項該当
学位論文題名 CYP3A4 誘導の新規分子メカニズムの解析に関する研究
論文審査委員
主査 教 授 永 田 清
副査 教 授 井ノ口 仁 一
副査 教 授 関 政 幸
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CYP3A4 誘 導 の 新 規 分 子 メ カ ニ ズ ム の 解 析 に 関 す る 研 究
東 北 医 科 薬 科 大 学 大 学 院 薬 学 研 究 科 機 能 病 態 分 子 学 教 室 荒 津 佑 輔
薬 物 代 謝 酵 素 チ ト ク ロ ー ム P450（ 以 下 CYP） は 医 薬 品 や 環 境 汚 染 物 質 の 代 謝 的 解 毒 化 あ る い は 活 性 化 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 酵 素 で あ る 。そ の 中 で も CYP3A4 は ヒ ト の 肝 臓 や 小 腸 に 発 現 す る 主 要 な 分 子 種 で あ り 、50%
以 上 の 治 療 薬 の 代 謝 に 関 与 す る 重 要 な 薬 物 代 謝 酵 素 で あ る 。現 在 の 薬 物 治 療 で は 多 剤 が 併 用 さ れ る ケ ー ス が 多 く 、薬 物 相 互 作 用 が 大 き な 問 題 の 1 つ と な っ て い る 。近 年 、健 康 の 維 持 増 進 の た め に 健 康 食 品 を 利 用 す る 人 が 増 え て お り 、健 康 食 品 に よ る 薬 剤 と の 薬 物 相 互 作 用 が 危 惧 さ れ て い る が 、実 際 に は St.
John's wort (SJW)に よ る CYP3A4 誘 導 な ど が 報 告 さ れ て い る の み で 、 そ の 報 告 数 は 少 な い 。
現 在 、医 薬 品 開 発 で は 薬 物 相 互 作 用 の リ ス ク が 低 い 薬 剤 を 開 発 す る た め に 探 索 段 階 か ら CYP 阻 害 お よ び 誘 導 の ス ク リ ー ニ ン グ を 行 う こ と で リ ス ク の 低 減 に 向 け た 取 り 組 み が 行 わ れ て い る 。CYP 阻 害 は メ カ ニ ズ ム も あ る 程 度 解 明 さ れ て お り 、医 薬 品 開 発 に お い て も 肝 ミ ク ロ ソ ー ム を 用 い た ス ク リ ー ニ ン グ 評 価 が 行 わ れ 、合 成 展 開 時 に 構 造 活 性 相 関 に よ り 阻 害 能 を 低 減 さ せ た 化 合 物 の 創 出 や physiologically based pharmacokinetic model を 用 い た 薬 物 相 互 作 用 リ ス ク の 予 測 も 行 わ れ て い る 。
一 方 、酵 素 誘 導 に 関 す る 研 究 も 数 多 く な さ れ て き て お り 、核 内 受 容 体 で あ る pregnane X receptor (PXR), constitutive androstane receptor や vitamin D receptor が CYP3A4 の 誘 導 に 関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 し か し な が ら 、CYP 誘 導 は そ の メ カ ニ ズ ム も ま だ 未 解 明 な 部 分 も 多 く 、定 量 的 な リ ス ク 予 測 は 難 し く 、 構 造 活 性 相 関 の 情 報 も 乏 し い の が 現 状 で あ る 。
PXR は CYP の み な ら ず そ の 他 の 薬 物 代 謝 酵 素 や ト ラ ン ス ポ ー タ ー な ど を 制 御 し て い る 主 要 な 核 内 受 容 体 で あ る 。ヒ ト の PXR は リ フ ァ ン ピ シ ン (RF) や フ ェ ニ ト イ ン や カ ル バ マ ゼ ピ ン な ど が 結 合 す る こ と で 核 内 に 移 行 し 、 retinoid X receptor (RXR)と ヘ テ ロ ダ イ マ ー を 形 成 し 、CYP3A4 遺 伝 子 に 結 合 す る こ と で 転 写 を 活 性 化 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 ま た 、 aryl hydrocarbon receptor (AhR)の リ ガ ン ド と し て 知 ら れ る polycyclic aromatic
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hydrocarbons (PAHs)な ど が PXR を 介 し て CYP3A4 を 誘 導 す る と い う 報 告 も あ る 。そ の 一 方 で 近 年 、新 た な メ カ ニ ズ ム と し て cyclin-dependent kinase 2 (CDK2)な ど の リ ン 酸 化 酵 素 が PXRの リ ン 酸 化 を 介 し て CYP3A4を 誘 導 こ と が 報 告 さ れ て い る 。ま た 、CYP3A4 遺 伝 子 に は 、TGA(A/C)CT に 代 表 さ れ る い く つ か の PXR 結 合 配 列 が 存 在 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。CYP3A4 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に は everted repeat separated by six nucleotides (ER-6)が 存 在 し 、 エ ン ハ ン サ ー 領 域 に は distal nuclear receptor binding element 1 (dNR-1)や essential distal nuclear receptor binding element for CYP3A4 induction (eNR3A4)が 存 在 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。
CYP3A4 誘 導 に よ る 薬 物 相 互 作 用 リ ス ク が 低 い 医 薬 品 を 開 発 す る た め に は 、誘 導 の 詳 細 な メ カ ニ ズ ム の 把 握 や 誘 導 能 を 低 減 さ せ た 化 合 物 を 創 出 す る た め の 構 造 活 性 相 関 の 情 報 が 重 要 と な っ て く る 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 CYP3A4 誘 導 分 子 メ カ ニ ズ ム を 解 析 す る と と も に 構 造 活 性 相 関 に つ い て も 検 証 す る こ と を 目 的 と し た 。
本 研 究 で は 、 第 1 章 に お い て ま ず 、 応 答 性 の 異 な る 2 つ の CYP3A4 レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 安 定 発 現 細 胞 株(3-1-10 お よ び 3-1-20 細 胞)を 用 い て 化 学 物 質 に よ る 誘 導 評 価 を 行 い 、CYP3A4 誘 導 を 示 す 化 学 物 質 の 構 造 活 性 相 関 を 解 析 し た 。そ の 結 果 、代 表 的 な CYP3A4 誘 導 剤 で あ る RF や ビ ス フ ェ ノ ー ル 類 と は 異 な る 新 た に PAHs 型 の 酵 素 誘 導 を 見 出 し 、従 来 と は 異 な る 誘 導 分 子 機 序 の 存 在 の 可 能 性 を 示 唆 し た 。ま た 、類 似 構 造 の 評 価 結 果 か ら 構 造 活 性 相 関 に 関 す る 情 報 と し て 、脂 溶 性 や 立 体 障 害 が 誘 導 の 強 弱 を 変 化 さ せ る ポ イ ン ト の １ つ で あ る こ と を 明 ら か と し た 。
第 2 章 に お い て 、 健 康 食 品 に よ る CYP3A4 誘 導 を 調 べ た と こ ろ 、SJW や Ginkgo biloba extract は RF 型 、Ban-Lan-Gen は PAHs 型 の CYP3A4 誘 導 を 示 す こ と を 見 出 し た 。Ban-Lan-Gen に 含 ま れ る 主 成 分 の 一 つ で あ る イ ン デ ィ ル ビ ン は PAHs と 同 様 に AhR を 活 性 化 し 、CYP1A1/1A2 を 強 く 誘 導 す る こ と が 知 ら れ て い る 。し か し な が ら 、イ ン デ ィ ル ビ ン は 、CYP1A1/1A2 を 誘 導 す る と 同 時 に PAHs 型 の CYP3A4 誘 導 を 引 き 起 こ し 、CYP3A4 誘 導 に AhR は 直 接 関 与 せ ず 、PXR が 強 く 関 与 す る こ と を 明 ら か と し た 。 ま た 、RF と イ ン デ ィ ル ビ ン で は CYP3A4誘 導 に 関 与 す る CYP3A4遺 伝 子 上 の PXR結 合 配 列 が 異 な る こ と が 示 唆 さ れ た 。
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そ こ で 、 第 3 章 で は 、RF 型 と PAHs 型 誘 導 の 分 子 機 序 の 違 い を 明 ら か と す る 一 環 と し て 、CYP3A4 遺 伝 子 の エ ン ハ ン サ ー 領 域 に 存 在 す る PXR 結 合 配 列 に 注 目 し て 検 証 を 行 っ た 。CYP3A4 遺 伝 子 上 の プ ロ モ ー タ ー お よ び エ ン ハ ン サ ー 領 域 に 存 在 す る PXR 結 合 配 列 に 変 異 や 欠 失 を 施 し た レ ポ ー タ ー プ ラ ス ミ ド を 作 製 し 、HepG2 に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し 、 レ ポ ー タ ー ア ッ セ イ に よ り 転 写 活 性 化 を 評 価 し た 。 そ の 結 果 、 誘 導 に 関 与 す る 遺 伝 子 領 域 が RF 型 と PAHs型 の 間 で は 異 な る こ と を 見 出 し た 。PAHs 型 誘 導 に は eNR3A4 遺 伝 子 領 域 が 必 須 で あ り 、RF 型 誘 導 に は こ の 領 域 の 5’上 流 域 の 14 塩 基 を 加 え た reNR3A4 遺 伝 子 領 域 が 必 須 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 し か し な が ら 、 PXR は こ の 領 域 の み で は CYP3A4 遺 伝 子 を 転 写 活 性 化 し な か っ た 。 そ の た め 、さ ら に 解 析 を 行 い 、reNR3A4 遺 伝 子 領 域 に 加 え 、5’上 流 の dNR-1 遺 伝 子 領 域 が 必 要 で あ る こ と も 明 ら か に し た 。そ の 一 方 で 、eNR3A4 を 通 じ た PAHs型 誘 導 に は PXRを 介 さ な い 別 の 経 路 も 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。
本 研 究 の 中 に お い てRF型 誘 導 で は3-1-10細 胞 に お い て 高 い 応 答 性 を 示 し た 一 方 で 、PAHs 型 誘 導 で は 3-1-20 細 胞 に お い て 高 い 応 答 性 を 示 し た 。ま た 、 3 章 に お い て PAHs 型 誘 導 に は PXR を 介 さ な い 経 路 が 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 そ こ で 、 第 4 章 で は RF 型 と PAHs 型 誘 導 を 示 す 化 合 物 を 用 い て 3-1-10 お よ び 3-1-20 細 胞 に お け る 転 写 因 子 の 違 い を マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 に よ り 検 証 し た 。 そ の 結 果 、3-1-20 細 胞 に お い て mitogen-activated protein kinase kinase 6 (MKK6, MAP2K6)の 発 現 が3-1-10細 胞 と 比 較 し て 多 か っ た 。 そ の た め 、MAP2K6 を 含 む 一 連 の path way が PAHs 型 誘 導 に 関 与 す る か に つ い て 、 関 連 酵 素 の siRNA を 用 い て 検 証 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、siRNA 処 理 に よ り 3-1-20 細 胞 に お け る PAHs 型 誘 導 は 抑 制 さ れ る 傾 向 に あ っ た 。 そ の 一 方 で RF 型 誘 導 に は 変 化 は 認 め ら れ な か っ た 。さ ら に 阻 害 剤 を 用 い て 確 認 行 っ た と こ ろ 、siRNA 処 理 と 同 様 の 傾 向 を 示 し た 。し か し な が ら 、今 回 検 証 し た siRNA や 阻 害 剤 の い ず れ に お い て も 転 写 活 性 化 の 抑 制 傾 向 が 認 め ら れ た も の の 、そ の 程 度 は 弱 く 、CYP3A4 誘 導 へ の 寄 与 率 は 明 ら か に 出 来 な か っ た 。 本 研 究 の CYP3A4 誘 導 に お け る リ ン 酸 化 酵 素 の 関 与 に つ い て は 、 今 後 さ ら な る 検 証 を 行 う 必 要 が あ る と 思 わ れ た 。
本 研 究 で は ビ ス フ ェ ノ ー ル や そ の 類 縁 体 の CYP3A4 の 転 写 活 性 化 を 評 価 す る こ と で 構 造 活 性 相 関 に つ い て 考 察 を 行 っ た 。そ の 結 果 、類 似 構 造 に 限 定
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す る と 脂 溶 性 と 転 写 活 性 化 に 正 の 相 関 が あ る こ と を 示 す こ と が で き た 。ま た 、 そ の 中 で 嵩 高 い 置 換 基 を 有 す る 化 合 物 は 同 じ 脂 溶 性 で も 転 写 活 性 化 能 は 低 か っ た 。こ れ ら の 結 果 は 、医 薬 品 開 発 の 探 索 段 階 に お け る 合 成 展 開 の 中 で 酵 素 誘 導 リ ス ク の 低 減 に む け た 構 造 活 性 相 関 に 有 用 な 情 報 の １ つ と な る と 思 わ れ る 。
代 表 的 なCYP3A4誘 導 剤 で あ るRFや ビ ス フ ェ ノ ー ル 類 と は 異 な る 新 た な PAHs 型 の 酵 素 誘 導 を 見 出 し 、 誘 導 に 関 与 す る 遺 伝 子 配 列 が RF 型 と PAHs 型 の 間 で は 異 な る こ と を 明 ら か に し た 。そ の 一 方 で 、eNR3A4 を 通 じ た PAHs 型 誘 導 に は PXR を 介 さ な い 別 の 経 路 が 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。PXR 以 外 の 経 路 に つ い て は リ ン 酸 化 酵 素 の 関 与 を 示 唆 す る こ と は で き た が 、寄 与 率 や 酵 素 の 同 定 な ど 詳 細 は 今 後 も 検 証 し て い く 必 要 が あ る と 思 わ れ た 。こ れ ら の 知 見 は CYP3A4 誘 導 の メ カ ニ ズ ム を 把 握 し 、 リ ス ク を 予 見 お よ び 考 察 し て い く 上 で 非 常 に 有 用 な 情 報 を 提 供 す る と 思 わ れ る 。
＜ 参 考 論 文 ＞ 主 論 文
「CYP3A4 induction mechanism of polycyclic aromatic hydrocarbons differs from that of rifampicin in PXR binding element」
Yusuke Aratsu, Reo Odagiri, Rie Shoji, Kouki Watanabe, Takeshi Kumagai, Sawako Shindo, Takamitsu Sasaki, Kiyoshi Nagata
Fundamental Toxicological Sciences (2017) vol.4 No.5 p.229-239
「 Indirubin, a component of Ban-Lan-Gen, activates CYP3A4 gene transcription through the human pregnane X receptor.」
Takeshi Kumagai, Yusuke Aratsu, Ryosuke Sugawara, Takamitsu Sasaki, Shinichi Miyairi, Kiyoshi Nagata
Drug Metabolism and Pharmacokinetics (2016) vol.31 No.2 p.139-145
