博士論文審査報告書

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博 士 論 文 審 査 報 告 書

論 文 題 目

フラボノイド系化合物の体内時計に対する インビトロ評価と作用機序の解明

Evaluation of flavonoid-based compounds on biological clock in vitro and elucidation of the

action mechanism

申 請 者

篠崎 綾子

Ayako SHINOZAKI

電気・情報生命専攻 薬理学研究

2018 年 2 月

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ヒ ト を 含 む 哺 乳 動 物 の 体 内 時 計 は 、 脳 の 脳 視 床 下 部 に あ る 視 交 叉 上 核

（S u p r a c h i a s m a t i c n u c l e u s , S C N） が 主 時 計 と し て 働 き 、 末 梢 臓 器 の 時 計 が 末 梢 時 計 と し て 働 き 、 こ の 両 時 計 の 調 和 が 生 体 全 体 と し て の 体 内 時 計 の 維 持 に 重 要 で あ る 。 1 9 9 7 年 に 哺 乳 動 物 か ら 最 初 の 時 計 遺 伝 子 C l o c k が 発 見 さ れ 、 同 年 に P e r 1、

B m a l 1 遺 伝 子 が 発 見 さ れ た 。 こ れ ら 時 計 遺 伝 子 は 、 約 2 4 時 間 の 周 期 的 な 発 現 を 示

し 、 サ ー カ デ ィ ア ン リ ズ ム の 中 核 を 担 っ て い る 。 体 内 時 計 遺 伝 子 の 転 写 翻 訳 は 外 的 刺 激 が 加 わ る と そ れ に 伴 い 変 化 す る が 、 影 響 す る 外 的 刺 激 は 様 々 で あ る 。 摂 食 活 動 も 体 内 リ ズ ム の 調 節 要 素 の 一 つ で あ り 、 主 に イ ン ス リ ン を 介 し て 末 梢 組 織 に お い て 体 内 リ ズ ム の 調 節 を 促 す こ と な ど が 分 か っ て い る 。 日 内 リ ズ ム が 大 き く 乱 れ る と 肥 満 、 糖 尿 病 、 高 血 圧 な ど の 生 活 習 慣 病 や ア レ ル ギ ー 疾 患 な ど の リ ス ク を 上 昇 さ せ る 。 す な わ ち 、 規 則 正 し い 生 活 リ ズ ム は こ れ ら 疾 患 の リ ス ク を 低 下 さ せ る 。

近 年 、 生 活 習 慣 病 や 疾 患 の 予 防 の 手 段 の 一 つ と し て 機 能 性 表 示 食 品 が 注 目 を 浴 び て い る 。 例 と し て 、 魚 油 に 多 く 含 ま れ る 不 飽 和 脂 肪 酸 の 一 つ ド コ サ ヘ キ サ エ ン

酸 （D H A）、 ア ミ ノ 酸 L -テ ア ニ ン な ど が ア ル ツ ハ イ マ ー な ど の 認 知 症 予 防 効 果 や

高 血 圧 を 緩 和 す る 作 用 が あ る な ど 、 機 能 性 表 示 食 品 の 体 内 へ の 効 果 に 対 す る 報 告 が 増 え て き て い る 。 一 方 で 、 生 活 リ ズ ム を 調 和 さ せ る よ う な 機 能 性 表 示 食 品 は ま だ 現 存 し な い 。 し た が っ て 生 活 習 慣 の 乱 れ 、 特 に 1 日 の リ ズ ム の 乱 れ を 補 正 す る よ う な 機 能 性 食 品 成 分 が 見 つ か り 、 そ の 作 用 機 序 を 理 解 し 、 使 い 分 け る こ と が 可 能 に な れ ば 、 生 活 習 慣 病 の 予 防 等 に 大 変 有 意 義 で あ る と 考 え た 。

本 博 士 論 文 は 第 1 章 の 緒 言 か ら 第 4 章 の 総 括 ま で の 全 4 章 か ら な る 。第 1 章 の 緒 言 で は 、 申 請 者 は 背 景 と 導 入 と し て 体 内 時 計 、 体 内 時 計 の 乱 れ か ら 生 じ る 既 知 の 生 活 習 慣 病 や 疾 患 の 研 究 報 告 、 機 能 性 表 示 食 品 と 生 活 習 慣 病 や 疾 患 に 対 す る 既 知 の 報 告 な ど を 記 し た 。 ポ リ フ ェ ノ ー ル 、 そ の 中 で も フ ラ ボ ノ イ ド は 野 菜 等 に 多 く 含 ま れ 日 常 の 摂 取 機 会 が 多 い の で 、 本 研 究 で は 、 フ ラ ボ ノ イ ド が 体 内 時 計 に ど の 様 に 作 用 す る か に 着 目 し 、 体 内 時 計 と 機 能 性 食 品 成 分 の 関 連 を 調 べ る 研 究 を 企 画 し た 。 第 2 章 で は 、 主 な 実 験 手 法 と し て 体 内 時 計 遺 伝 子 P e r 2 の 配 列 の 後 方 に ホ タ ル の 発 光 酵 素 を コ ー ド す る ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 を 導 入 し た 遺 伝 子 操 作 マ ウ ス P E R 2 : : L U C I F E R A S E（P E R 2 : : L U C） 由 来 の 胎 児 線 維 芽 細 胞 （M E F 細 胞 ） を 培 養 し 、生 物 発 光 リ ズ ム を 指 標 と し て 、P E R 2 : : L U C 発 現 リ ズ ム に 影 響 を 及 ぼ す フ ラ ボ ノ イ ド 系 化 合 物 の 検 索 を 行 っ た 。 こ の 第 2 章 で は 、 ま ず M E F 細 胞 に お け る フ ラ ボ ノ イ ド 継 続 的 添 加 作 用 の 検 証 、 次 に フ ラ ボ ノ イ ド の 一 時 的 添 加 作 用 の 検 証 、 さ ら に マ ウ ス 肝 臓 切 片 へ の ノ ビ レ チ ン 継 続 的 及 び 一 時 的 添 加 作 用 の 検 証 を 行 っ た 。

申 請 者 は フ ラ ボ ノ イ ド に 属 す る フ ラ ボ ン （ f l a v o n e 、 5 - O H - f l a v o n e 、 7 - O H - f l a v o n e） を M E F 細 胞 に 継 続 的 添 加 作 用 さ せ て 、 振 幅 、 周 期 、 位 相 変 動 を 観 測 し た 。 そ の 結 果 、 組 成 式 や 構 造 式 が 大 変 類 似 し て い る 化 合 物 で も そ れ ぞ れ が

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P E R 2 : : L U C の 振 幅 や 周 期 、位 相 変 動 に 与 え る 影 響 は 同 様 で は な い こ と が 示 さ れ た 。 次 に 申 請 者 は 、 各 フ ラ ボ ノ イ ド を 幾 つ か の 異 な る 濃 度 で 継 続 的 に 添 加 作 用 さ せ て 振 幅 、 周 期 へ の 影 響 を 調 べ 、 フ ラ ボ ノ イ ド に 属 す る フ ラ ボ ン 、 フ ラ ボ ノ ー ル 、 イ ソ フ ラ ボ ン 、 カ テ キ ン 、 ポ リ メ ト キ シ フ ラ ボ ン の 間 で 様 々 な 結 果 を 得 た 。 同 じ フ ラ ボ ン に 属 す る 化 合 物 で あ っ て も f l a v o n e、5 - O H - f l a v o n e、7 - O H - f l a v o n e、 ク リ シ ン 、 バ イ カ レ イ ン 、 ア ピ ゲ ニ ン 、 ル テ オ リ ン の 7 種 の ほ ぼ 全 て に お い て 添 加 濃 度 に 対 す る リ ズ ム へ の 影 響 が 、 そ れ ぞ れ 異 な る と い う こ と を 観 測 し た 。 ヒ ド ロ キ シ ル 基 の 部 位 が メ チ ル 化 さ れ て い る ポ リ メ ト キ シ フ ラ ボ ン に 関 し て は 先 行 研 究 の 報 告 と 同 様 に P E R 2 : : L U C リ ズ ム の 振 幅 増 強 効 果 が 確 認 さ れ た 。 振 幅 と 周 期 延 長 の 相 関 で ま と め る と 、 フ ラ ボ ノ ー ル 、 イ ソ フ ラ ボ ン で は 負 の 相 関 を 示 し 、 周 期 延 長 時 に 細 胞 間 の 脱 同 調 が 起 こ っ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 一 方 、 ポ リ メ ト キ シ フ ラ ボ ン で は 正 の 相 関 を 示 し 、 ポ リ メ ト キ シ フ ラ ボ ン は 振 幅 と 周 期 を 同 時 に 増 大 さ せ た 。

次 に 、 申 請 者 は 一 時 的 に M E F 細 胞 に フ ラ ボ ノ イ ド を 添 加 し て フ ラ ボ ノ イ ド の 体 内 時 計 リ セ ッ ト 作 用 を 調 べ た 。P E R 2 : : L U C リ ズ ム を 観 察 モ ニ タ ー し な が ら 、頂 点 （ ピ ー ク ） か ら 約 2 時 間 過 ぎ た タ イ ミ ン グ で 3 0 分 間 の み 化 合 物 を 一 時 的 に 添 加 作 用 さ せ 、 そ の 後 洗 浄 し 、 元 に 戻 し た 。 こ の 実 験 で 申 請 者 は 特 に ポ リ メ ト キ シ フ ラ ボ ン が P E R 2 : : L U C リ ズ ム を リ セ ッ ト し 、 大 き な 位 相 後 退 を 引 き 起 こ す こ と を 明 ら か に し た 。 フ ラ ボ ン 類 の 一 時 的 添 加 に よ る P E R 2 : : L U C リ ズ ム へ の リ セ ッ ト 反 応 に お い て も 明 ら か な 構 造 別 の 統 一 性 は 見 出 せ な か っ た 。 継 続 的 に 作 用 さ せ る か 一 時 的 に 作 用 さ せ る か と い う 添 加 作 用 の 違 い が 細 胞 内 で の 反 応 に 対 し て も 異 な る で あ ろ う こ と 、 継 続 的 添 加 作 用 で 議 論 し た 振 幅 と 周 期 延 長 や 一 時 的 添 加 作 用 で 議 論 し た 位 相 変 化 に 関 し て シ グ ナ ル 経 路 や 反 応 速 度 の 相 違 に よ り フ ラ ボ ン 類 の 構 造 類 似 性 は 見 ら れ な か っ た も の と 判 断 し た 。 次 に 、 申 請 者 は M E F 細 胞 の み で な く 、 生 体 で も ノ ビ レ チ ン の 効 果 が 見 ら れ る か 否 か を 確 か る た め に 、 ノ ビ レ チ ン を 肝 臓 組 織 に 添 加 し 作 用 を 調 べ た 。P E R 2 : : L U C k n o c k - i n マ ウ ス の 肝 臓 切 片 に 継 続 的 に 添 加 作 用 さ せ る と 、 濃 度 依 存 的 な 周 期 の 延 長 傾 向 が 見 ら れ た 。 ま た 、 ノ ビ レ チ ン を 一 時 的 に 添 加 作 用 さ せ る と 、 一 時 的 添 加 後 の 次 の ピ ー ク に お い て 位 相 の 顕 著 な 後 退 が 観 測 さ れ た 。M E F 細 胞 で の 実 験 結 果 と 肝 臓 組 織 培 養 に お け る 実 験 と を 比 較 し て 、P E R 2 : : L U C の リ ズ ム は そ れ ぞ れ 同 様 の 振 幅 増 強 作 用 、周 期 延 長 作 用 が 得 ら れ る こ と を 示 し た 。

第3章 に お い て 、 ポ リ メ ト キ シ フ ラ ボ ン に 属 す る ノ ビ レ チ ン に よ るP E R 2 : : L U C リ ズ ム の 位 相 変 化 が 起 こ る 作 用 機 序 に つ い て 調 べ た 。 継 代 細 胞 で 各 種 刺 激 薬 の リ セ ッ ト 効 果 にE R Kの リ ン 酸 化 が 重 要 で あ る と い う 報 告 に 基 づ き 、申 請 者 はM E F細 胞 で ノ ビ レ チ ン のE R Kリ ン 酸 化 作 用 を 調 べ た 。 リ ン 酸 化 の 有 無 は ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 に よ り 検 証 し た 。M E F細 胞 に ノ ビ レ チ ン を 終 濃 度5 0 µ Mで 添 加 し 、

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1 5分 ま た は6 0分 間 作 用 さ せ て 細 胞 を 回 収 し た 。そ の 後 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 を 行 っ てE R Kが リ ン 酸 化 さ れ て い る か ど う か を 確 認 し た と こ ろ 、 全 体 的 に リ ン 酸 化E R Kが 多 く 検 出 さ れ る 傾 向 が 見 ら れ た 。特 に4 2 k D aのE R Kは 有 意 に リ ン 酸 化 さ れ て い る た め ノ ビ レ チ ン の 作 用 に よ る 位 相 変 動 にE R Kの リ ン 酸 化 が 関 与 し て い る 可 能 性 を 示 唆 し た 。

次 に 、申 請 者 はE R Kリ ン 酸 化 阻 害 薬 に よ るP E R 2 : : L U Cリ ズ ム 変 動 へ の 効 果 検 証 を 行 っ た 。E R Kの 阻 害 剤U 0 1 2 6を ノ ビ レ チ ン と 同 時 添 加 で 作 用 さ せ 、 ノ ビ レ チ ン の 位 相 変 動 作 用 が ブ ロ ッ ク さ れ る か ど う か 調 べ た 。 コ ン ト ロ ー ル 、U 0 1 2 6、 ノ ビ レ チ ン 、 ノ ビ レ チ ン ＋U 0 1 2 6 の4群 を 用 意 し た 。U 0 1 2 6は ノ ビ レ チ ン の3 0分 間 添 加 の1 0分 前 か ら あ ら か じ め 添 加 し て お い た 。 ノ ビ レ チ ン の み 添 加 し た 場 合 は 有 意 な 位 相 後 退 を 示 し た が 、 ノ ビ レ チ ン ＋U 0 1 2 6添 加 作 用 群 で は 、 位 相 は 後 退 し な か っ た 。 こ の 結 果 か ら 、 ノ ビ レ チ ン を 添 加 作 用 さ せ て 生 じ る 位 相 の 後 退 現 象 に は

E R Kの リ ン 酸 化 を 介 す る シ グ ナ ル 経 路 も 含 ま れ て い る と 考 え た 。

第 4 章 の 総 括 で は 、 第 2 章 と 第 3 章 の 結 果 と 考 察 を ま と め 、 既 知 の 研 究 報 告 と 比 較 し な が ら 、 総 合 討 論 を 記 載 し た 。 ノ ビ レ チ ン の 周 期 延 長 作 用 は 時 計 遺 伝 子 産 物 で あ る R O R が 作 用 す る 部 位 に ア ゴ ニ ス ト と し て 作 用 し 、B m a l 1 遺 伝 子 発 現 を 増 大 さ せ る と い う 論 文 が あ り 、 今 回 の 位 相 同 調 作 用 も 同 様 の メ カ ニ ズ ム で 説 明 で き る 可 能 性 を 論 じ た 。 ま た 、 ノ ビ レ チ ン は c A M P を 増 大 さ せ る 作 用 も 報 告 さ れ て お り 、E R K シ グ ナ ル だ け で は な く 、P K A（ プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ A） を 介 す る シ グ ナ ル も 協 調 的 に 作 用 し て い る 可 能 性 も 議 論 し た 。 以 上 、 本 論 文 は フ ラ ボ ノ イ ド 類 か ら 機 能 性 食 品 の ノ ビ レ チ ン が 体 内 時 計 の 周 期 ・ 振 幅 ・ 位 相 に 対 し て 作 用 す る と い う 新 た な 発 見 を し 、 こ の こ と が 体 内 時 計 調 整 食 品 と い う 機 能 性 食 品 の 新 規 分 野 の 開 拓 に つ な が る 可 能 性 を 提 案 し た 。 最 近 、 体 内 時 計 の 研 究 は ヒ ト の 生 活 や 健 康 に も か か わ る 側 面 も 新 た な 研 究 対 象 と な っ て お り 、 本 研 究 の 当 該 領 域 へ の 貢 献 は 大 き い と 考 え ら れ る 。 し た が っ て 、 本 論 文 は 博 士 ( 理 学 ) の 学 位 論 文 と し て 、 十 分 価 値 の あ る も の で あ る と 判 断 で き る 。

2 0 1 8 年 2 月 審 査 員

主 査 早 稲 田 大 学 教 授 薬 学 博 士 (九 州 大 学) 柴 田 重 信

年 月 日 早 稲 田 大 学 教 授 博 士 (理 学) 東 京 工 業 大 学 高 松 敦 子

年 月 日 早 稲 田 大 学 教 授 博 士 (理 学) 名 古 屋 大 学 岩 崎 秀 雄

年 月 日