ローヤルゼリー中に新たに見出された品質指標となるタンパク質:ロイヤラクチン

ミツバ チ科 学23(1):17-22 HoneybeeScience(2002)

ローヤルゼ リー中 に新 た に見 出 された品質指標 とな る

タ ンパ ク質 :ロイヤ ラクチ ン

鎌倉

呂樹

ローヤルゼ リー (RJ)は,働 き蜂が下咽頭腺 と大胆腺か ら分泌す る女王蜂の幼虫を成育 させ るための食物である.RJは, タンパ ク質, 糖 質,脂質, ア ミノ酸, ビタ ミン, ミネラルなど を主成分 とし(Takenaka,1982),他 に抗腫療 活性 や殺菌作用 を有 す る10-- イ ドロキ シー 2-デセ ン酸 (10-HDA)(Townsendeta1.,1959; Blum eta1.,1959) や抗菌作用を持っ分子量 5,500のペプチ ド (Fujiwaraeta1.,1990)な どの生理活性物質やプロテアーゼ (Funakoshi et alリ 1993), グ ル コ ー ス オ キ シ ダ ー ゼ

(Takenakaeta1.,1986), α-グル コシダーゼ (Kuboeta1.,1996)などの酵素 を含んでいる ことが報告 されている.また,RJは血圧降下作 用 (Shinodaeta1.,1978),抗炎症作用 (Fujii eta1.,1990),血 清 コ レステ ロール低下作用 (Nakajineta1.,1982)など様 々な薬理作用を 有す ることか ら,医薬品原料や栄養補助食品 と して幅広 く活用 されている. RJの物理 的性状や化学 成分 の組成 は,保存 条件 によ って容易 に変化 す る.RJを 5℃以下 の低温で保存 した場合, その成分含量 に殆 ど変 化 は見 られないが,室温 (約25℃)で保存 した 場合,粘度 ･酸度の上昇, メイラー ド反応の促 進などの物理的性状の変化,不溶性窒素量 の増 加,遊離 ア ミノ酸組成 の変化 な どが観察 され る.この様 な保存中の成分組成 の変化 は,RJの 品質の劣化 に影響 を与え るもの と考え られる. 従 って,RJの成分 に影響 を与 えない環境 で保 存す ることが, RJの品質管理 の上 で重要 な課 題 とな っている.しか し,RJの品質 の評価基準 や評価法 に未だ適切 な ものがないのが現状であ る.また,RJの品質 に及 ぼす保存条件の影響 に ついて も未だ明 らかにな っていない. そ こで本研究 で は,RJの品質 の評価基準 と な りうる指標物質 を兄 いだす ことを 目的 と し て,RJの保存 中 における成分組成 の変化 につ いて, またその成分組成 の変化が品質 に及ぼす 影響 について検討 した. その結果,品質指標物 質 (ロイヤ ラクチ ン)を発見 し,その生理活性 について も検討 した. 蓑 1 高温保存条件下におけるローヤルゼリー中の各種 ビタミンと 10--イドロキシー2-デセン酸 (10-HDA)の含有量の変化 4oC･7日間保存 40℃ ･7日間保存

mg/RJIOOg mg/RJIOOg 残存率 (%) ピタ ピタ ピタ ピタ ピタ B B B B C ン ン ン ノ ン ヽヽヽ ヽヽヽ ヽヽヽ ヽヽヽ ヽヽヽ 葉酸 パントテン酸 ビオ チ ン ナイアシン 10-HDA 0.34 0.85 037 検 出 されず 検 出 されず 27.0×10 3 8.46 17.4×10-3 4.73 1,67a) 0.32 94 0,83 98 0.33 89 検 出 されず 検 出 されず 検 出 されず 検 出 されず 23.0×10 3 85 7.70 91 17.4×103 100 4.83 102 1.70 102 a)10-HDA含量はローヤルゼリーに対する重量%で示 した

18

ローヤルゼ リーの鮮度を評価するための

指標物質の探索

RJは,保存条件 に依存 して品質が劣化す る. そ こで,RJの鮮度 を評価 す るための指標物質 を兄 いだす ことを 目的 と して,RJの成分組成 の変化 に及 ぼす保存条件 の影響 につ いて検討 し た.その結果,RJ中の有効成分 である 10-HDA などの脂肪酸 や9種類 の ビタ ミン類 は,40℃で 7日間保存 して もその含有量 に変化 が見 られな か った (表

1

)

.

しか し,RJの水溶性 タンパ ク質 をnative-PAGEで分析 した結果, 40℃の保存 条件下 で はroyaljelly protein-1 (R∫p-1) と royaljellyprotein-2(RJP-2)と命名 した 2種 類 の タンパ ク質 のみが特異 的 に分解 され ること を兄 いだ した (図

1

)

.

さ らに,RJを 4-50℃ の 範囲内の種 々の温度 で1-7日間保存 したサ ン プルを作成 し, RJタンパ ク質 の HPLC分析 を 行 った結果,RJP-1は保存温度 と保存期間 に比 例 して特異 的 に分 解 され て いた (図2A).一 方,R∫p-2は RJの保存温度 とは無関係 に分解 されて いた (図2B). これ らの結果か ら,RJ P-1はRJの鮮度 を評価 す るための指標物質 とな りうることが示唆 された.次 に,RJか らRJP-1 の分離精製 を行 い,諸性質 を調 べた結果,RJ P-1は等 電点 が5.1で あ る分子 サ イズ 57kDaの

A

1 1 0 0 0 ( 8 o o n lJ 叫 )軸 や 聖 ･d r tJ 0

1

2 3 4 5 6 7 保存期間(日) L l1 3 1 RJP-2■ -RJP-1一一崩 図1 Native-PAGEに よるローヤルゼ リータ ンパク質の分析 レーン1,-20℃ 保 存RJ; レー ン2, 40℃ ･1日間保存 RJ; レーン3,40℃ ･2 日間保存

R

J;レーン 4,40℃ ･7日間保存 RJ.RJP-1とRJP-2 の位置は矢印で示 し

+た

_

単 量 体 の 糖 タ ン パ ク 質 で あ っ た (図3, Kamakura,eta1.,2001a).57kDaタ ンパ ク 質 のア ミノ酸組成 を分析 した結果, これ までに 報告 され たRJ中の タ ンパ ク質 の中 には,同一 のア ミノ酸組成 を示す タンパ ク質 はなか った. さ らに,57kDaタ ンパ ク質 のN末端 ア ミノ酸 配列 を決定 した結果,米倉 によって報告 された RJ中 の 350kDaタ ンパ ク 質 (ア ピ シ ソ: Yonekura,M.1998) の N末端 ア ミノ酸配列 と5残基 まで一致 していた.しか し,57kDaタ ンパ ク質 に対す る抗体 を用 いたウェスタ ンブロ ッテ ィングを行 った ところ, 350kDaタ ンパ ク 質 は57kDaタ ンパ ク質 に対 す る抗体 によ り認 識 され なか った ことか ら,57kDaタ ンパ ク質 は,350kDaタンパ ク質 とは異 なる新規 なタ ン

B

0

1

2 3 4 5 6

7

保存期間(日) ､‖U ､U nU ･八つ 3 2 rl nU ハU (B o oT ｢ 巴

B

)

蛸

撫

和 N ･d r∝ 図2 様々な温度条件下で保存 したRJ中の RJP-1とRJP-2の含有量の変化 RJ中の (A)RJP-1含有量と(B)R∫p-2含有量を HPLC分析によって測定 した.RJサンプルは4℃ (●), 室温 (■),30

℃(

▲).40℃ (○),50℃ (□)で7日間保存 した.n-3

19 1 2 A IB 盟 94k- _ 67k-･ -細 一57kDa43k 30k --20k -14k

--+

57kDa 図3 精製 RJP-1の電気泳動による分析 RJと精製 RJP-1をnative-PAGE (A) とSDS-PAGE (B)により分析 した. レー ンM,マーカータンパク質;レーン1,3% (W/V)RJ溶液;レーン2,精製 RJP-1. RJP-1は分子サイズ57kDaの単量体のタ ンパク質であった. バ ク 質 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た (Kamakura,eta1.,2001C). ロー ヤ ル ゼ リー の 抗 疲 労 効 果 と 57kDaタ ンパ ク質 含 量 との 関 係 RJは滋養強壮 に効果 が あ る ことが知 られて いる. しか し, その滋養強壮効果や抗疲労効果 は,生化学的に明確 な評価 がなされていない. そ こで,RJの成分組成 の変化 が抗疲労効果 に 及 ぼす影響 を明 らか にす ることを 目的 と して, マ ウス運動量 測定流水槽 を用 い,RJの抗疲労 効果 につ いて検討 した. マ ウスを15分遊泳 さ せた後

,30

分間休息 させ,その後再度遊泳 させ た時の限界遊泳時間 と再度 15分遊泳 した後 の 運動性疲労 に関与す る生化学的パ ラメー ターを 測定 す る ことに よ って,抗 疲労 効 果 を評 価 し た. 投与 サ ンプルは, 藻取後-20℃で保存 した RJ(-20RJ),40℃で 7日間保存 した RJ( 40-7d RJ), RJと同等 の摂取 エネルギーになるよ うカゼイ ン, コー ンスターチ,大豆 油か ら調製 したサ ンプル (コン トロール) を用 いた. その 結果, -20RJ投与群 の遊泳時間 は コン トロール 群 や40-7dRJ投 与群 の遊 泳時間 よ り有意 に増 加 していた (図4). また,再度 15分間遊泳 し 0 5 0 5 0 5

0

3 2 2 1 1 ( 一 S 匡 皆 濃 渇 昧 誕 * † コントロール ー20RJ 40-7dRJ 図4 -20RJと40-7dRJのマウス限界遊泳時間 に対する効果 マウスは遊泳前の48時間,24時間,0.5時間前 にコントロール溶液 (カゼイン, コーンスター チ,大豆油から調製 したサンプル),-20RJ又は 40-7dRJを投与された. 15分遊泳後,30分休 息 し,再度遊泳 した時のマウスの限界遊泳時間 を測定 した.値は,7?8匹のマウスの平均値と標 準誤差を実測値で示 した.-20RJは-20℃で保存 したRJ,40-7dRJは40℃で7日間保存 したRJ を示す. コントロール群との有意差:*p<0.05. 40-7dRJ投与群との有意差 :Ip<0,05. た後 の生化学的パ ラメーターを測定 した結果, 血 中乳酸量 は-20RJ投与群 で,他 の 2群 よ り有 意 に低下 していた.誹腹筋 のグ リコーゲ ン濃度 ち-20RJ投与群 で他 の 2群 よ り有意 に高 く,血 糖値 は,40-7dRJ投与群 で他 の 2群 に比べ有意 に低 か った. これ らの結 果 か ら,高 品質 のRJ には抗疲労効果があ ることが明 らか とな った, 一万,40-7dRJにはこの抗疲労効果が見 られな か った.本実験 に使用 したRJサ ンプルの成分 分析 の結果, 57kDaタンパ ク質 は 40℃で 7日 間保存 す る問 にその90%が分解 されて いた. また, -20℃で保存 した RJは, RJP-2よ り 16 倍 (重量比) 高 く57kDaタ ンパ ク質 を含有 し ていた.さ らに,57kDaタ ンパ ク質 の含有量 の 異 な るRJを含 む粉 餌 で マ ウス を2週 間 飼 育 し, その期 間 内 の マ ウスの遊 泳 時 間 を測 定 し た.その結果,飼育2週間 目にお けるマ ウスの 遊泳時間の増加率 は,RJ中の 57kDaタンパ ク 質含量 に比例 した. これ らの結果か ら,57kDa タ ンパ ク質が抗疲労効果 につ いてのRJの品質 を評価す るための指標物質 にな りうることが示 唆 された (Kamakura,etalリ2001b).

(L･ 1 0 T X LtJ u !a T ︹ hd ぎ ＼ u J( l p) 唱 和 V N O **jE *** *** vp]_/)i BSA 剛 4017dRJ p57 trPy5p7sTn

H

C

F

ラ ッ ト初 代 培 養 肝 細 胞 に対 す る 57kDaタ ンパ ク質 の 増 殖 因 子 様 作 用 57kDaタ ンパ ク質 が特 異 的 に分 解 され て い る

R

Jが マ ウスの抗疲労効 果 を示 さなか った こ とか ら,RJ中の57kDaタ ンパ ク質 が疲労 に対 し何 らかの作用 を示 す ことが考 え られ る.通勤 中 に生成 した乳酸 は, コ リサイ クルで肝臓 に運 ばれて糖新生 によ って グル コースに変換 された 後,筋 肉 に運 ばれ る. この乳酸 の代謝 には肝臓 が重要 で あ る.上皮増殖 因子 (EGF)は肝臓 で の ピル ビン酸 キナーゼを不活性化 す ることによ り糖新生 を活性化 し, さ らにTCAサイ クル も 活 性 化 す る. ま た, RJは投 与 後 比 較 的 短 時

A

Jq 一 3 2 ( z u 3 J t､O T x ) 意 等 毒 せ

0

1 2 3 4 5 培養期間(R) 図5 ラット初代培養肝細胞に対する57kDaタンパ ク質のDNA合成促進作用

Contro】(無添加),BSA(牛血清アルブミン,1.5 mg/ml),RJ(ローヤルゼ リー,1.5mg/ml),40-7 dRJ(40℃･7日間保存RJ,1.5mg/ml),p57(精製 57kDaタ ンパ ク質,0.05mg/ml),p57+trypsin (37℃で6時間 トリプシン処理 した精製57kDaタン パク質,0.05mg/ml),HGF(肝細胞増殖因子,10 ng/ml).値は3回の実験の結果の平均値と標準誤差 を実測値で示 した. コントロールとの有意差: … p

<

0.001. 間で抗疲労作用 を示 した. これ らの ことか ら, RJ中 の57kDaタ ンパ ク質 は遊 泳 中 の マ ウス に対 しEGF様 の作用 を示 したので はな いか と 推測 され た.そ こで,57kDaタ ンパ ク質 の生理 機能 を明 らか にす ることを 目的 と して, ラ ッ ト 初代 培養 肝細胞 に対 す る57kDaタ ンパ ク質 の 影響 につ いて検討 した. ラ ッ ト初代培養肝細胞 を無血清条件下 で培養 した場合, 57kDaタ ンパ ク質 は肝細胞 のDNA 合成 を促進 した (図5).脱糖鎖 した57kDaタ ンパ ク質 はDNA合成促進 作用 を示 したが,57 kDaタ ンパ ク質 を トリプ シ ンで処理 した場 合 はその作用 を示 さなか った.さ らに,57kDaタ ンパ ク質 によ るDNA合成 促進作用 は濃度依存

B

1

0

0

80 京 60 糠 壮 =出 ･10 20

0

₀

1 2 3 4 5 培養期間(日) 図6 ラット初代培養肝細胞の生細胞数 ･生存率に対する57kDaタンパク質の影響 分離された肝細胞を無血清条件下で5日間培養 し,培養期間内の生細胞数 (A),生存率(B)を測 定 した.△,Control(無添加);◇,BSA(牛血清アルブミン,1.5mg/ml);口,RJ(ローヤルゼリ ー,1.5mg/ml);○,p57(精製57kDaタンパク質,0.5mg/ml).値は2[司の実験の結果の平均値を 実測値で示 した.各値の標準偏差は実測値の10%以下であった.

的に増加 した.これ らの結果か ら,57kDaタン パ ク質 が マ イ トジェ ン と して肝 細 胞 に対 し DNA合成促進作用 を示す ことが示唆 された. 57kDaタ ンパ ク質 によ るDNA合成促進作用 は, 肝細胞の細胞濃度が低濃度 (3×104cells/ cm2)の場合でよ り顕著であった.これは,肝再 生 を促進す る因子 と して知 られ るEGFや肝細 胞増殖因子 (HGF)で も見 られ る現象である. また,低細胞濃度で培養 された肝細胞 は部分切 除後 の再生肝 に相 当す る ことか ら,57kDaタ ンパ ク質 は肝再生 を促進す る可能性があると考 え られた. さらに,肝細胞 を5日間培養 した際 の生細胞数,生存率の変化 を測定 したところ, 57kDaタンパ ク質 によって肝細胞 の生細胞数, 生存率が維持 された (図 6).また,その培養期 間内で57kDaタ ンパ ク質 は肝機能 のマーカー であるアルブ ミンの分泌を促進 していた.従 っ て, 57kDaタ ンパ ク質 には肝機能 を向上 させ る作用 もあることが示唆 された. これ らの作用 は,EGFやHGFの肝細胞 に対す る作用 と同様 であった(Kamakura,etalリ2001

C

)

.

以上 の 結果 は,遊泳中のマウスに対 し,57kDa蛋 白質 がEGF様 の作用 を示 した ことを支持 す る結果 であると考え られ る. そ して, この57kDaタ ンパ ク質 をロイヤ ラクチ ン(royalactin:工9

ヱ坦

jelly-derived, hepatocyte-activating pr o-te垣)と命名 した. この様 に, ロイヤ ラクチ ンは

R

Jの鮮度指標 と して重要であるばか りでな く,品質 にとって も重要 な成分であることが分か った.今後, こ の ロイヤラクチ ンを用 いて品質管理 を行 うこと によ り,新鮮で品質 の高 いRJの生産 ･供給が 可能 になると思われ る. おわ リに 本研究 はすべてポーラ化成工業株式会社健康 科学研究所 にて行 った ものである.研究を遂行 するに当た り,良 き研究環境 をお与え下 さった 株式会社科薬 ･福島信様 (元 ポーラ化成工業株 式会社 ･健康科学研究所所長) に厚 く御礼 申 し 上 げる.本論文 は,著者 の博士論文 ｢ローヤル ゼ リーの品質指標物質 ロイヤラクチ ンの生物学 gI 的機能 に関す る研究｣の一部を掲載 した もので あ り,博士論文 を審査頂 いた京都大学大学院農 学研究科教授 ･伏木亨先生 に, また,学位 申請 に際 しご協力頂 いた同助教授 ･井上善晴先生, 同助手 ･井沢真吾先生 に心 よ り御礼 申 し上 げる (〒244-0812横 浜市戸塚 区柏尾町560 ポーラ化成工業株式会社中央研究所) 引用文献

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I_'二

In orderto ldentify amarkerthatcould be usedtoevaluatethequalityofroyaljelly(RJ),

the relationship between the composition,the physiologicalactlVlty and thefreshnessofRJ wasinvestlgated.FlrStOfall,thecomposition cllangeOfRJduring storagewasmvestlgated tofindamarkerforfreshnessofRJ.Thec on-tentsof10-hydroxy-2-decenoicacid,abioactjve

compollentOfRJ,andseveralvitalTlinsdidnot changeduringstorageat40oCf or7daysHow-ever,aspecificproteln,designated royaljelly protein-1 (R∫p-1), was gradually degraded during storageundervarlOuSCOnditions(from 4oC to 50℃ for up to 7 days).The specific degradatlOn OfR∫p-1wasproportionaltoboth storagetemperatureand storageperlOd R∫p-1 waspurified tohomogeneityandcharacterized asamonomericglycoprotein with amolecular massof57kDa.Next,theantHatigueeffectof RJonmaleStdddY micewasinvestlgated All micewereforcedtoswim for15minonce,and then themax一mum SWlmmlng timetofatigue wasmeasured aftera restperiod.The swi

m-ming enduranceoftheRJgroup slgnificantly increased compared with those of the other groups.The mice ln the RJ group showed significantly decreased accumulatlOn Ofserum lactate and serum ammonia and decreased

depletlOn Ofmuscleglycogen afterswimmlng comparedwiththeothergroups,whereasthere wasnosignificantdlfferencebetweenthe40-7d RJ(RJstoredat40oCfor7days)groupandthe controlgroup in theseparametersafterswユm一 ming.TheseresultssuggestthatRJcanamell O-ratethephysicalfatigueafterexercISeandthlS

anti-fatigue effectofRJ in miceseemsto be

associated with the freshness ofRJ,possibly with the contentof57-kDa protein Further -more, 57-kDa protein stimulated hepatocyte DNA synthesisandprqlongstheproliferatlOnOf hepatocytes,aswellasincreasingalbumlnPr o-duction.Therefore,57-kDaprotelnmaybesuit -able fora markerofRJ quality The author have named the 57-kDa protein royalactin (工9ヱ旦主_jelly-derlVed,hepatocyte一旦些1Vatlng Pr O-teln)