ヒト関節滑膜細胞に対する機械的伸展刺激が

博 士 （ 歯 学 ） 安 東 真 毅

学 位 論 文 題 名

ヒト関節滑膜細胞に対する機械的伸展刺激が      破骨細胞分化に及ぼす影響

学位論文内容の要旨

【 緒 言 】

  歯 科 矯 正 臨 床 に お い て 多 様 な 顎 関 節 症 状 を 呈 す る 不 正 咬合 患者 が存 在し てお り、

中 に は 病 態 の 進 行 に 伴 っ てX線 写 真 で 下 顎 頭 の 骨 吸 収 が 認 め ら れ る 場 合 も あ り 、 咬 合 異 常 や 口 腔 習 癖 な ど に よ る 顎 関 節 に 対 す る 過 度 の メ カ二 カル スト レス がそ の一 因 と し て 重 要 視 さ れ て い る 。 矯 正 治 療 中 に 下 顎 頭 が 骨 吸 収な どの 退行 性器 質変 化を お こ す と 、 顎 位 の 変 化 を き た し 、 そ の 後 の 治 療 で 対 応 に 苦慮 する こと が多 い。 従っ て 、 こ の よ う な 顎 関 節 の 骨 吸 収 メ カ ニ ズ ム を 明 ら か に す るこ とは 、臨 床に おけ る治 療 や 病 態 進 行 の 予 防 に 大 き く 寄 与 す る と 推 測 さ れ る 。

  顎 関 節 症 患 者 の 多 く で は 、 関 節 滑 膜 炎 を 発 症 し て い る こと から 、炎 症の 過程 で滑 膜 細 胞 か ら 産 生 さ れ る 各 種 ケ ミ カ ル メ デ ィ エ ー タ ー 、 特 にサ イト カイ ンな どの 生理 的 活 性 因 子 が 疼 痛 発 現 や 関 節 破 壊 に 影 響 す る と 考 え ら れ てい る。 しか し、 滑膜 細胞 に 対 す る メ カ 二 カ ル ス ト レ ス の 細 胞 機 能 へ の 影 響 は 未 だ 不 明 な 点 が 多 い 。   一 方 、 細 胞 の メ カ 二 カ ル ス ト レ ス に 対 す る 応 答 の ー っ とし て、 アデ ノシ ン三 リン 酸(ATP)が 細 胞 外 へ 放 出 さ れ 、 細 胞 表 面 のATP受 容 体 を 介 し て 細 胞 機 能 を 調 節 し て い る こ と が 知 ら れ て い る 。 骨 に お い て も 、ATPに よ り 骨 芽 細 胞 や 破 骨 細 胞 内 の 情 報 伝 達 系 が 活 性 化 さ れ 、 骨 の り モ デ リ ン グ に 影 響 を 与え ると いう 報告 があ る。

し か し 、 こ れ ま で に メ カ ニ カ ル ス 卜 レ ス に よ る 滑 膜 細 胞 か ら のATP放 出 や そ の 意 義 に 関 す る 報 告 は 少 な い 。

  本 研 究 で は 、 関 節 の 骨 吸 収 メ カ ニ ズ ム の 一 端 を 明 ら か にす るこ とを 目的 とし て滑 膜 細 胞 に 対 す る 機 械 的 伸 展 刺 激 が 破 骨 細 胞 分 化 に 与 え る 影 響 を 検 討 し た 。

【 材 料 と 方 法 】

  ヒ ト 線 維 芽 細 胞 様 関 節 滑 膜 細 胞 を コ ン フ ル エ ン ス ま で 培 養 後 、ATP分 解 酵 素 阻 害 薬 ス ラ ミ ン を 最 終 濃 度200ルM添 加 し てFlexcell社 製FX−3000TTM System を 用 い て 滑 膜 細 胞 に 機 械 的 伸 展 刺 激 を 負 荷 し た 。 伸 展 刺 激は 伸展 率を 一定 とし 、周

波 数(0.5 Hzあ る い は1.0 Hz)と 刺 激 時 間(24お よ び48時 間） を 変え て 刺 激を 加えた。一方、対照群には伸展刺激を加えず、培養したものを用いた。刺激後、回 収 し た 滑膜 細 胞培 養 上 清中 の 放出ATP量を 東洋イン キ社製AI、P発光キッ トにて 測 定 し 、 放 出 サ イ ト カ イ ン をPanomics社 製 のTranSignalrM human cytokine antibody arrayにて検出した。

  一 方、4週 齢 マウ ス の 大腿 骨 中か ら採取 した骨髄 細胞と骨 芽細胞様MC3T3―El 細 胞(El細胞） の共存培 養系を用いた破骨細胞誘導系では、24穴プレー卜上にてEl 細 胞 をコ ンフルエ ンスまで培 養し、採 取した骨 髄細胞を 最終濃度10 nMの活性型 ビ タ ミ ンDと100 nMのデ キ サ ヌタ ゾ ン含 有 培 養液 に 懸濁 し て 播種 した。 さらに 培 養 液 に は 最 終 濃 度250お よ び500 nM A'I、Pあ る い は 滑 膜 細 胞 培 養 上 清 を conditioned mediumと し て1/8あ る い は1/4の 割合 で 培 養液 中 に 添加 し て6日 間 培 養 した 後 、2核以 上 の 酒石 酸 抵抗 性 酸 性ホ ス ファ タ ー ゼ(TRAP)陽性 多核細 胞(TPMC)数 を 光 学 顕 微 鏡 下 で 計 測 し た 。 ま た 、 骨髄 細 胞 をSephadexG−10カ ラムに浸透させ十分静置後、得られた非付着性骨髄細胞（破骨細胞前駆細胞を含む）

を 最 終 濃 度20 ng/mlの マ ク口 フ ァ ージ コ 口二 ー 刺 激因 子(M―CSF)と30 ng/ml の 破 骨細 胞分化誘 導因子（RANKIー ）を添加 した培養 液で懸濁 して24穴プ レート に 播 種 し た 。 さ ら に 最 終 濃 度250お よ び500nMATPあ る い は滑 膜 細胞 培 養 上清 をconditionedmediumと し て1/8あ る い は1/4の 割 合 で 培 養 液 中 に 添 加 し て 6日間培養し、TPMC数を計測した。

【結果と考察】

  滑膜細胞に機械的伸展刺激を与えるとその代謝系が変化し、何らかの破骨細胞分 化 促進因子 を産生し ていると 推測し、骨 髄細胞とE1細胞の共存培養系に、滑膜細 胞 に1．0Hzで48時間 機 械 的伸 展 刺激 を負荷し て培養し た培養上 清を添加 し、破 骨 細 胞誘 導能を検 討した。そ の結果、 刺激を加 えた培養 上清を1/8添 加した場 合 と 比 較 し て1/4添 加 した 場 合、TPMC数 は 増加 し た。 ま た 、培 養 上清 を1/4添加 し た 場 合、TPMC数 は無 刺 激 で48時間 培養した 上清を添 加した対 照群と比 較して 有 意 に 増加 し た。 こ の 結果 は 、TPMCの誘導 に滑膜細 胞に対す る機械的 伸展刺激 が影響することを示唆していた。また、共存培養系では刺激を与えた滑膜細胞の培 養 上清中の 因子が骨 髄細胞とE1細胞のいず れに作用 しているのかが不明なため、

骨髄細胞をカラムに通し、付着性骨髄細胞を取り除いた後の非付着性骨髄細胞を用 い て 、 破 骨 細 胞 分 化に 不 可欠 と さ れるM−CSFとR气NKLを 添 加し て 培養 し た 。 そ の結果、1．0Hzで48時間 刺激を与えた滑膜細胞培養上清を添加、した場合、1/8 添 加 し た 場 合 と 比 較し て1/4添 加 し た場 合 、TPMC数 は 増 加し た 。ま た 、1/4添 加 し た 場合 で はTPMC数 は 無 刺激 の 対照群と 比較して 有意に増 加した。 以上の結 果から、機械的伸展刺激を与えた滑膜細胞の培養上清中の因子は、破骨細胞前駆細

胞に直接作用している可能性を示唆していた。

一方、ス卜レスに対する応答として細胞外に放出されるATP が、破骨細胞分化・

活性化に対しても重要な役割を果たしている可能性が推測された。そこで、機械的 伸展 刺激による滑膜細胞のATP 放出量を測定した。その結果、ATP 放出量は1.0 Hz で刺 激した場合、刺激後24 、48 時間とも対照群と比較して有意に増加していた。

さら に、

ある いは

で

時間培養した場合、周波数が高くなるとATP 放出量は増加していた。以上の結果から、他の細胞と同様に滑膜細胞も機械的伸展 刺激でATP が放出され、放出量が周波数とともに増加することが明らかになった。

また 、刺 激時間

時 間と

時 間を 比較してA1 丶P 放出量はわずかに増加するもの の有意な差はなく、刺激時間依存性は認められなかった。

機 械的 伸展刺 激に よる 滑膜 細胞 から のATP 放出 が明 らか とな ったので、ATP の 破骨 細胞 分化に 与え る影 響を 調べ るために、培養液中にATP を添加して骨髄細胞 と

細胞 を 共 存 培 養 し

数 を 計 測 し た 。 そ の結 果、対 照群 と比 較し てTPMC 数 は 濃度 依 存 的 な 増加 傾向を 示し 、TPMC の 誘導 にATP が促 進的 に作 用す るこ と が 示 唆さ れ た 。 さ らに 、ATP の作 用が 骨髄 細胞 とEl 細胞の どち らに 作用 して い る か を 検 討 す る た め 、 破 骨 細 胞 前 駆 細 胞 を

なら び に

―

と

添 加 培 養 液で 培 養 し 、

数 を 計 測 し た 。 そ の 結 果、 対照群 と比 較し てTPMC 数 は

、

に対して濃度依存的増加傾向を示した。以上の結果は、ATP が破骨細胞前駆 細胞に直接作用して分化を促進することを示唆していた。

機 械的刺激により滑膜細胞から放出されるパrP 以外の因子として骨吸収に重要 な役割を果たすとされているサイトカインの培養上清中への放出を検出した。1 ．0

で 刺激 した滑 膜細 胞培 養上 清で

ー

およ びRAM 丶

の 放出 が時間依存的に増 加し 、48 時間刺激後の放出量は無刺激で培養した場合と比較して明らかに増加し てい た。IL −8 やRANT 、ES はサイトカインのうちケモカインに属し、特にIL ′8 は 自血 球走 化性の みな らず

細 胞の 走化活性も有していることが知られている。最 近 の 研究 で

細 胞が

气

を 発現 する との 報告 もあ り、こ れら のサ イ卜 カイ ン も関節における破骨細胞の分化に重要な役割を果たしている可能性が推測された。

【結論】

本研 究に おい て、 関節 滑膜 細胞 は機 械的伸展刺激によりATP を細胞外へ放出し ていることが示された。また、細胞外」゜rrP は破骨細胞前駆細胞に作用して破骨細 胞分化を促進させることが示唆された。さらに機械的伸展刺激により滑膜細胞から

−

や

の 放 出が 認 めら れ、 破骨 細胞 分化に 影響 を与 える 可能 性が 示唆 された。以上の結果から、関節腔においてヌカ二カルストレスを受けた滑膜細胞が 放 出 す る

や

、RANTES な どの サイ トカ インが 破骨 細胞 の誘 導を 促進 し、

関節の骨吸収に関与する可能性が示唆された。

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学 位論文審 査の要旨 主査

副査 副査 副査

教 授    飯 教 授    鈴 教 授    田 助教授   出

田順一郎 木 邦 明 村 正 人 山 義 昭

学 位 論 文 題 名

ヒト関 節滑膜細 胞に対す る機械的伸展刺激が      破 骨細胞分 化に及ぼ す影響

審 査 は 審 査 委 員 が 一 同 に 会 して 、口 頭試 問の 形式 によ っ て行 われ た。 まず 申請 者に 論文 の概 要の 説明 を求 めるとともに適宜解説 を求め、次いでその内容および関連分野について試問し た。

申請 者か ら、 まず 以下 のよ う な説 明が なさ れた 。

  歯 科矯 正臨 床で 顎関 節症 状を 有す る患 者の 中に は下 顎 頭の 骨吸 収を 認める場合があり、過 度 のメカニカルストレスがその一因とされる。下顎頭が骨 吸収等の退行性変化をおこすと、顎位や顔 貌の変化によりその後の矯正治療で対応に苦慮すること が多く、そのメカニズムを解明することは 治療や病態進行の予防に寄与すると推測される。

顎関 節症 患者 では 関節滑膜炎を発症し ており、炎症で産生されるサイトカイン等の生理的活性 因 子が症状の発現や増悪に影響すると考えられている。しかし、滑膜細胞に対するメカニカルストレス の細 胞機 能へ の影 響は未だ不明な点が 多い。一方、ストレス負荷時の細胞の応答のーっとして 、 細 胞 外 ヘ 放 出 さ れ る ア デ ノ シ ン 三 リ ン 酸(ATP)が 細 胞 機 能 を 調 節 す る と さ れ て い る 。 本研 究で は、 関節 の骨 吸収 メカ ニズ ムの 一端 を解 明す る ため に滑 膜細 胞に対する機械的伸展 刺 激が破骨細胞分化に与える影響を検討しt:o

関節 滑膜 細胞 を周 波数(0.5 Hz，1.0 Hz)と刺 激時間(24，48時間）を変えて伸展刺激を加え、 滑 膜 細 胞 培 養 上 清 中 の 放 出ATP量 の 測定 およ び放 出サ イト カイ ンの 検出 を行 った 。一 方、4週齢 マウ スか ら採 取し た骨 髄細 胞と 骨芽 細胞 様MC3T3ーEl細 胞(El細胞 ）の 共存培養系に、最終濃 度 250お よ び500 nM ATPあ る い はconditioned mediumと し て1/8お よび1/4の 割合 で滑 膜細 胞培 養 上 清を 培養 液中 に添 加し て6日 間培 養し 、酒 石酸 抵抗 性酸 性 ホス ファ ター ゼ(TRAP)陽性 多核 細胞(TPMC)数 を計 測し た。 また 、骨 髄細 胞をSephadexG―10カラムに浸透させて得られた非付 着 性 骨 髄細 胞（ 破骨 細胞 前駆 細胞 を 含む ）を 共存 培養 系の 場合 と同 様にATPあ るい は滑 膜細 胞培 養上清を培養液中に添加して培養し、TPMC数を計測した 。

滑 膜 細 胞に 伸 展 刺激 を 与 えると何 らかの 破骨細胞 分化促 進因子を 放出す ると推測 し、骨髄 細胞 とEl細胞 の 共 存培 養 系 に滑 膜細胞 培養上清 を添加し て培養 したとこ ろ、培 養上清添 加量依 存的 にTPMC数 は 増 加 し た 。 また 、1/4添 加 した 場 合 のTPMC数 は 無 刺激 で 培 養 した 上 清 を添 加 し た 対 照群と比 較して有意に増加し、TPMCの誘導に伸展刺激が影響することを示唆していた。しかし、

刺 激 に よる 放 出 因子 が 骨 髄細胞とEl細胞の いずれに 作用し ているか 不明な ため、滑 膜細胞 培養 上 清を添加 した培 養液で非 付着性骨 髄細胞 を培養し たとこ ろ共存培 養系と同様の結果を得た。こ の こ と は 放 出 因 子 が 破 骨 細 胞 前 駆 細 胞 に 作 用 す る 可 能 性 を 示 唆 し て い た 。 次 に 伸 展刺 激 に より 細 胞 外ヘ 放 出 され るATPが 破 骨 細胞分 化に対し ても作 用する可 能性を 推測 し 、伸展刺 激によ る滑膜細 胞のATP放出量 を測定し たとこ ろ、それ ぞれの 刺激時間 で無刺激 の場 合 と 比 較 し て 有 意 に 増 加 し 、 ま た 刺 激 の 周 波 数 と と も に 有 意 に 増 加 し て い た 。 伸 展 刺 激に よ るATP放 出が 明 ら かに な っ たの で 、ATPの 破 骨細 胞 分 化に 与 え る影 響を調 べるた め に 、 骨髄 細 胞 とEl細 胞の 共 存 培養 系 にATPを 各 濃度 で 添 加し 培 養 した と こ ろ、TPMC数はATP の 濃度依存 的増加 傾向を示 し、ATPの分化 に対する 促進作 用が示唆 された 。さらに 非付着性 骨髄 細 胞 をATP添 加培 養 液 で培 養 す ると 同 様 の傾 向 を 示 し、ATPが 破 骨 細胞 前 駆 細胞 に作用 して分 化を促進する可能性が示唆された。

ATP以外の因子として、機械的刺激により放出されるサイトカイン検出したところ、ケモカインに属 す るIL―8お よびRANTESの放 出 が 時間 依 存 的 に増 加 した 。IL―8は白血 球走化性 のみな らずT細 胞 走 化 性も 有 す ると さ れ 、最 近T細胞 が 破 骨細 胞 分 化 促進 因 子 であ るRANKLを発 現する との報 告 もあるた め、今 回検出し たサイト カイン が顎関節 におけ る破骨細 胞分化に重要な役割を果たす 可能性が推測された。

以 上 の 結果 か ら 、メ カ ニ カルスト レスを 受けた滑 膜細胞 が放出す るATPやIL―8、RANTESなど の サ イ 卜 カ イ ン は 破 骨 細 胞 分 化 を 促 進 し 、 下 顎頭 の 骨 吸収 に 関 与す る 可 能性 が 示 唆 され た 。

以 上の論 述に引き 続き以下の項目を中心に口頭試問を行った。

1．滑膜 細胞、 使用した 細胞の 特徴 2．ATP放出の 機序

3．得ら れた結 果の重要 性 4．今後 の研究 の方向性

こ れ ら の試 問に 対して申 請者は明 快な回 答、説明 を行っ た。

本 研究 は 歯 科 領域 に お ける 病 態 とし て 不 明な 点 の 多い 変 形 性顎 関 節 症 の、 発生機 序の一端 を 薬理 学的に検 討したも のであ り、関節 滑膜細 胞に対す る機械 的刺激から生じ骨吸収にいたる一連 の反 応を明ら かにした 。中で もそこに 出現す るATPが 破骨細 胞前駆細 胞に作用 して破 骨細胞分化 を促進すること、また滑膜細胞が機械的刺激によりIL―8、RANTESを発現することを明らかにしたこと は、新たな重要な情報を提供したものと高く評価できる。更に、試問の内容から、学位申請者は、関 連分 野にも幅 広い学識 を有し ていると 認めら れたと同 時に、 今後も更に詳細な解析の準備を進め ており、将来性についても評価された。

よっ て審査担当者全員は、申請者は博士（歯学）の学位を授与される資格を有するものと認めた。