LAK細胞誘導に及ぼす各種mitogenの影響に関する検討 -- 特に健常者, 消化器癌(肝細胞癌, 大腸癌)症例におけるLAK細胞の増殖能, 細胞障害活性およびリンパ球細胞表面マーカーに及ぼす影響について

Title

LAK細胞誘導に及ぼす各種mitogenの影響に関する検討 -- 特

に健常者, 消化器癌(肝細胞癌, 大腸癌)症例におけるLAK細

胞の増殖能, 細胞障害活性およびリンパ球細胞表面マーカー

に及ぼす影響について( 内容の要旨(Summary) )

Author(s)

杉浦, 淳策

Report No.(Doctoral

Degree)

博士（医学）乙 第1099号

Issue Date

1997-01-16

Type

博士論文

Version

publisher

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/15176

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氏名 (本籍) ′学位の 種類 学位'授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位藷文題■目 審 査 委 員 杉 浦 淳 策(岐阜県) 博 _{士･(医学)} 乙第1099 号■ 平成 9 年1月 ね一日 学位規則第4条第2項該当 LAK細胞誘導に及ぼす各種mitogenの影響に関する検討 一特に健常者,消化器病(肝細胞軋大腸癌)症例におけるLAK細姫の 増額能l細胞庫害活性および貞ンパ球細胞表面マーカーに及ぼす影響につい

,(主査)教授'武藤∫泰敏

(副査)教授 高 見 剛 教授 _野 間 昭 夫 論 文 内 容 の _要 旨 妻子免疫療法(AIT)が初めて報告されて以来,そめ有用性が注目を集め,以後さまざまな臨床治験が試みら

れ亡きたが,1当初期待された程の治療効東は縛ら.れてい寧｣､?カ率挟であ畠｡今後;′臨床的な海療効東を改善す

るたあに鱒,ゆ自己あ腫瘍細胞に対する痔異的ぬり撃力な細胞睡善活性を有するkille坤胞をい⇒ゝにす◆れば誘

導することカよできるれ②臨床的な効果を得るたあに轟底限必要とされ右1 01憫もd大量申effect占r細胞を,全 身状態の不良な進行癌患者から生如こ過剰な負担を掛け`争ことな く亡､かにして効率よこく採取革導ナるやゝ■云､③生

体内での轟時間にも

た一る活瞳の維持が由如ki鮎r細胞衷心かたれはよぅ効率良く鹿瘍の高所ぺ到達さヰる

ことができるか,などの問題点を解決する必要がある｡ √′くミ

そtで申請者はさ七れら■の線題あぅち,第二の問題点iこ対する解決策のiっとして,末梢血単核球(p?ヰbぬ1

bloodふono血C■1ear':､扇1;以下PBMcと略す)1から1手元phokin■奄孟ctivよtedkill占i云elI'(以下LA正純臓と略ナ)

を誘導す

る際iこ,*0も占inphytohem車頑中tinih(以下PHAiPと略す

)･′COnCやavalin-A(以下Con-Aと醸す)･

mbtasbdiu*Peri6date地下ぬIO一と略す)め3如mitokenを併掬し･そ汀らの細胞増殖薮細胞障害活性

およびkilfer細胞のph品otypeに及ばす影軌ごっ_し†での嶺鹿的換討Li:.行`った｡ 1.如象および方畠 1‥ 主ず,緬す扇肩A二P.血n二Aの添加至適濃度を決定する目的モ:ご健常套5名を対象細々ゐ添加鹿渡別の 経時的細胞塵廃能とi拍尚療養後め姦終細胞増殖率より轟加重鹿浜度を疾走い喜pBMCiま感奮者15名,ニ畔準患 者11例,守夫腸癌患者7例よ り嶺放した6･癌症例は仝例,抗癌剤の投与繭たPB扇Cの採取を待ったふP白MCの分酪 にはFicbllCらnrみ比重遠心法右痛心た｡･T活性化キラー細胞の誘導方法として;､LAK細胞初誘導はPBL4C(5k

lO5/血1)

'に700Japan'Ref品e逼

Uhitも(Jku)/mla5re車bi占去nt′inte;1占u'kin:21(IL二L2)を添加痩毒し誘

導した｡軸A-P･壷d壷edLAK(P-LAK)iは五×10S/,hlに調製した由MCた前述の基礎実験にて設定した6.1 %p(v占1/vol)';.pHA-Pを添加し3^自問培養後,700JRU/mibIIj;2妄添加した培地たて培毒した｡C6n-A (1ectin)ind読占dLAk∴(LトLAK)は5×105/ml-に調製したPBMcに前途め基鹿実験に七設定した6.1FLg/ml のC｡n-Aを添加し3日間培養乱700JRU/mlのIL-2右添加しrた寓触こて培重したムSらdiu-.d-p&i｡dよt占iムdLced LAK(PI-L阜K)は5×10S/mlに調節したPBMCに0.1FLM NaIO4を添加し37℃で10分間培養後,700JRU/ml のIL-2を添加した培地にて培養を維持し長0一以釦廃軸舶c82んキュベ｢タ一により5%CO2･95%air･ 37℃の条件下た14日間とし,t培地交換は3日毎に行いその都度∴細胞増殖率右算出した■ふPBMCおよび培養後の 各種LAK細胞の細胞障害活性はG,immらのsh6ttLt｡rm｡hE,ら.Liふ血r占1ease-a岳Say法に準じ■て知恵し一i=｡i･標的紆 胞に50∼100fLCiの放射性クロム酸ナトリウム(1mCi/ml)を加え,2時間培養標識し,i.0長165/ml七魂重 した｡エフェクター細胞は2,0×106/mlに調整しeffector/targetratio=20とした｡標的細胞としては,natural killer(NK)感受性をもつ赤白血病由来の細胞株であるK-562と,NK細胞抵抗性で,nOn-Hodgkin'slymPboma 由来の細胞株であるDaudi細胞を剛､た｡4時間の培養後遠心分離し1年ンマ,丁線用オート?ェルシ空ヒ｢㌢声

ンカウ,㌢タ｢でt._2分間硬射括性車瞬､し.キ｡測即すべてtri.蕪中表で行_い,卿包睡害碍性,軌塵車下記の

-lT ■■_ ■､･､･.二 l■' ･･, ■I■｢ ■■ ▲ _ l ､.≡ 5 ､､二 ■-■･､ 丁■ ■･-: 式により算出したこ 蔓 細胞障害活性(%)=(実験解離cpm一自然解離cpm)/(東大廊離cpm一自然薩鮎bム) 一117-▼ ■′ ×100

総LAK活性=LAK細胞増殖率×Daudi細胞に対するLAK活性/PBMCのDaudi細胞に対する細胞障害活性 リンパ球細胞表面マーカーの解析には,CD3,CD4,CD8,CDllc.CD16,CD2与,Leu一.7,.､Leu-HLA-DR のモノクローナル抗体を使用し,それらの組み合わせによる解析をdoublやCOlorのflowLCytOrTl牢yにて行った｡ 増殖率,Phenotype,細胞障害活性,総LAK活性の統計学的解析はDunnett'st-teS咋より行?.キ0 2.結果

①Mitogenの添加至適濠質草畢零す号碑甲A阜Con一昨準零別錦華後車纏殖率を即したoPHA-pでは0.1%￠痺叩畢度で上納印度高培癌重力滞ら布■ミC品-A号敵1壷/血ゆ添加濃度掬70倍ゐ最高増殖

率が得ら-れた｡,‥以上め結果た耕,ヰ極占め至適添加濃度を抽細瑚妬囁三Aは0･1〟g/mlと設定した0

■ . -･ ■■

ノ②Mit｡g昌n細胞増殖率た東する劫東の検討翫,Ⅰ立郎癖童顔め案舶醜率ば健膏対照琴,肝癌症例,.大腸

癌症例とも,P-LA沼田胞とLI-LAK細昭がLAK細胞に封寂しそ有意に高がった'(P<0･001)｡∴一方.PI-LAK細 胞ではLAK捌包と有意差を認めなふ_?た｡ ③LAK細胞subpopulationに及ぼす影響をみると,健常対照群,肝癌症臥大腸癌症例とも,P-LAK細胞LI-LAK細胞においてCD8(+),HLA-DR(+),CDll(-)や活性化cytotoxicT細胞が増殖していたo PI-LA K細胞では有意差を認めなかった｡ ご｣ @細胞障害活性は曜革者では阜種L阜K細胞甲叩p与り､皐強力坤胞障軍活性毛示〔二_キザ･細鱒増殖率とは

対照鱒にP-L坤由血.廿LA坤胞の細胞噂害活性鞋皐瑚転埠づ右重た底やゝった｡_桝A毎甲胞ゐ障害宿性

はL明細胞と比べ有意孝を認めなかった?,まキ･.肝癌症例と大腸壌症例で嘩aud脚町こ対するP-L､AK活性の

有意年硬少草野いて.各坤K細胞の細晦睡寄宿性の有意孝を翠輿中ノつ_ち｡前述画筆和よって算出草れる1

4日間の培養に皐∴つて革牽き笹た鱒LAK蒔性はす′ヂての群でPr埴琴細鞄が最も高くJ.-?与ご､で叶LAK細胞であり･

両者ともLAK細胞との間に有意差を革めキ｡_PI-I,AK細晦とLAK細昭0)問ドは有意葦は認め-1r ヽ ら叫なかった｡叶

養子免疫療韓の抗腫瘍鱒畢中林十分で奉る1?甲琴卸商床印に克郎細胞数?増殖力海鱒で奉ると小う点

が挙げら｢れ阜隼この問題を解決す-る坤,J.これまでも血tpg9nを用いた･､き享ざまな試卑が甘されてきキ｡今

回の衰験≠/叩A-P,Con-A,N鱒IO.?早?やmit9q叫;ついて嘩常乱L肝痺玩軌木喝癌症例甲畢.なろ3群に

串け声P寧MCからg)hAK細晦の誘導効果を比較検討した｡その帯革･Pf!A:叩細晦増殖率,t総LAK宿性甲南方 で最も高し拗果を示した｡Con-AもまたLAK細胞誘導効果草示したが,NaIP一_は有草な効果は認められなかった0 さらに,申請者は健常対照群と同等に進行癌対照群におしJても十分な総LAK活性を誘導する｡ことが可能でちる こ･≒季示しキ｡誘導されたk主鵬r細胞や奉画マ丁･カ｢の検討では･■CP8.(+)▼qD壬1(｣_細胞障害活性丁細胞 の増叫はすべての群でP-t,AK細掛こ特徴的であり,･･CD16(十)･PLeu7(十)/ヒ(㌻)q)N卵胞はP-LAKtlLト トAK細胞で減少していた｡▲阜!Tは通常101咽以阜のLAK細胞が必要とさ葬るが,今回の実験にヰりPヰAK細胞を 晦床応用可熊な享でに誘導すiるこ≒ができれlギギざく_少量のPBMCから充分な細鱒障害活性,(鱒L卵滞性){を 得るこキが可能となりt〉･従来の木量の含血考要する.1甲kapheresisでほ臨床上実施困難であ?た全身状態の不良

な末鱒癌患劃ヰ､て牟臨鱒にその和琴ザ鱒得でき卑可熊笹を示した0一雄ら叫厘enの麺の師効果は

すでにいくつか報告されており,申請者昼腹水から分離し,PHA-Pく≒IL･2で培養し七_ワン′ア坪を即､たAITを 行い,癌性綾里準全に哨琴:L,,t､2症例卑琴験している9･今後tmitogen誘導キラー細胞の臨床効果甲検討によ り,AITにより摩したmitogenが見い出され各キとが期待される｡ 論文吾李の結果の要旨 申覇者｡杉挿浮策は..養子免疫療法にお-1才る各嘩薫itpgenPlymphQkine瓢Ctiv紬dkill町(LAK).細雌q)増 姐総LAK宿性甲誘導に及ばす影響とその有物性を実験的に明らかにした｡∴〔れら甲軒知見撞桓床脛瞑免疫学 の進歩に少なからず寄与すごるもゃと､認やろ｡ }･亨主き [主論文公表誌] 一二i-_ノ＼_･･ さ｣ ■･L - ---･1｡▲ - ▲. - ----■モー 1)LAK鱒嘩誘導に及ばす各種mitogenP影響拉関する検鱒 二､.

⊥掛こ健常者.消化器癌(8芋細胞癌,大鹿癌)症例た如るLAK細胞の増殖能∴細胞腐害宿世串ネび'リン

パ球細胞表面マーカーに及ぼす影響について 平成9年1月発行予定り嘆阜木医紀｡J45(1).‥ _J一考`ノ ゝ一っ