東北薬科大学 審査学位論文（博士）要旨

東北薬科大学

審査学位論文（博士）要旨

氏名（本籍） ﾏﾂﾔﾏ ﾜｶﾅ

松山 和佳奈（青森県）

学位の種類 博士（薬科学）

学位記番号 博薬科第

4

学位授与の日付 平成

28

3

10

学位授与の要件 学位規則第４条１項該当

学位論文題名 肥満モデルマウスにおけるスフィンゴ糖脂質の発現および 構造の変化

論文審査委員

主査 教 授 顧 建 国

副査 教 授 永 田 清

副査 教 授 井ノ口 仁一

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肥 満 モ デ ル マ ウ ス に お け る ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 発 現 お よ び 構 造 の 変 化

東 北 薬 科 大 学 大 学 院 薬 学 研 究 科 機 能 病 態 分 子 学 教 室 松 山 和 佳 奈

【 緒 言 】

肥 満 は 、脂 肪 細 胞 に 過 剰 な 脂 質 が 蓄 積 し た 状 態 で あ り 、複 数 の 遺 伝 的 要 因 に 加 え 、加 齢 や 過 食・高 脂 肪 食・運 動 不 足・ス ト レ ス な ど の 環 境 因 子 や 、様 々 な 危 険 因 子 が 複 合 的 に 作 用 す る こ と で 、生 活 習 慣 病 の 一 つ で あ る 糖 尿 病 へ と 発 展 す る 。

ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 は 、 ス フ ィ ン ゴ シ ン と 脂 肪 酸 か ら な る セ ラ ミ ド （ Cer）

が 、グ ル コ ー ス 、ガ ラ ク ト ー ス 、N-ア セ チ ル ガ ラ ク ト サ ミ ン 、N-ア セ チ ル グ ル コ サ ミ ン 、 シ ア ル 酸 な ど の 糖 や 硫 酸 基 の 段 階 的 付 加 を 受 け た 分 子 で あ り 、 主 に 細 胞 膜 外 層 に 発 現 し て い る 。な か で も 、一 つ も し く は 複 数 の シ ア ル 酸 を 糖 鎖 部 分 に 持 つ ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 を 総 称 し て 、 ガ ン グ リ オ シ ド と 呼 ぶ

（ Fig.1）。当 研 究 室 で は 、TNF-α 刺 激 に よ っ て 、肥 満 に 伴 う 慢 性 炎 症 状 態 を 模 倣 し て 、イ ン ス リ ン 抵 抗 性 を 誘 導 し た 3T3-L1 脂 肪 細 胞 に お い て 、GM3 合 成 酵 素 遺 伝 子 の 発 現 亢 進 に よ り 、ガ ン グ リ オ シ ド の 1 つ で あ る GM3 の 合 成 量 が 増 加 す る こ と を 見 い だ し て い る 。さ ら に 増 加 し た GM3 と イ ン ス リ ン 受 容 体 間 の 静 電 的 相 互 作 用 に よ っ て 、シ グ ナ ル 伝 達 の 場 で あ る カ ベ オ ラ か ら イ ン ス リ ン 受 容 体 が 解 離 し 、下 流 の シ グ ナ ル 伝 達 が 阻 害 さ れ る と い う 、新 し い イ ン ス リ ン 抵 抗 性 発 症 機 構 の 存 在 を 示 し て い る 。そ の 他 の イ ン ス リ ン 感 受 性 組 織 で あ る 肝 臓 や 筋 肉 で も 、イ ン ス リ ン 抵 抗 性 に ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 が 関 与 し て い る こ と を 示 唆 す る 研 究 が い く つ か 報 告 さ れ て い る 。し た が っ て 、ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 発 現 量 と 糖 尿 病 と の 関 係 性 を 明 ら か に し 、そ の 原 因 と な る ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 発 現 を 制 御 で き れ ば 、糖 尿 病 の 新 た な 治 療 戦 略 と な り う る 。こ れ ま で の 糖 尿 病 モ デ ル の ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 解 析 報 告 で は 、各 報 告 で 用 い る 動 物 の 違 い 、 肥 満 ・ イ ン ス リ ン 抵 抗 性 惹 起 法 の 違 い 、 ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 解 析 法 、 ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 分 子 種 解 析 対 象 の 違 い が あ り 、肥 満 時・イ ン ス リ ン 抵 抗 性 発 症 時 の 各 組 織 に お け る ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 発 現 変 化 の 全 体 像 は い ま だ 不 明

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な 点 が 多 い 。 本 研 究 で は 、 各 イ ン ス リ ン 感 受 性 組 織 の ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 が 、 肥 満・糖 尿 病 発 症 時 に ど の よ う に 変 化 し 、病 態 と ど の よ う な 関 係 性 が あ る か 明 ら か に す る こ と を 目 的 に 実 験 を 行 っ た 。本 研 究 で は 、環 境 因 子（ 生 活 習 慣 の 不 良 ）に よ っ て 、前 糖 尿 病 を 発 症 す る 高 脂 肪 食 餌 誘 発 性 肥 満 モ デ ル マ ウ ス と 、進 行 度 の 異 な る 2 型 糖 尿 病 モ デ ル マ ウ ス を 用 い て 、イ ン ス リ ン 標 的 臓 器 お よ び 血 清 中 の ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 構 造 と 発 現 変 化 を 調 べ 、糖 尿 病 発 症 過 程 に お け る ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 変 化 と 糖 尿 病 病 態 の 関 連 性 を 検 討 し た 。

【 実 験 方 法 】

本 実 験 で は 、C57BL/6 系 雄 性 マ ウ ス と 2 型 糖 尿 病 モ デ ル マ ウ ス（ KK, KKAy）

を 用 い た 。 高 脂 肪 食 餌 誘 発 性 肥 満 モ デ ル と す る た め 、 C57BL/6 系 雄 性 マ ウ ス に は コ ン ト ロ ー ル 飼 料 （ 普 通 食 ） ま た は 高 脂 肪 食 飼 料 を 10 週 間 与 え た 。 2 型 糖 尿 病 モ デ ル マ ウ ス は 8 週 齢 の も の を 用 い た 。各 期 間 後 、肝 臓 、筋 肉（ 下 肢 の 骨 格 筋 ）、脂 肪 組 織（ 精 巣 上 体 脂 肪 組 織 ）、膵 臓 、血 液 を 採 取 し 、各 組 織 か ら ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 精 製 を 行 い 、TLC 解 析 お よ び LC-MS/MS 解 析 を 用 い て 、 ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 発 現 量 の 増 減 お よ び 分 子 種 変 化 を 調 べ た 。

【 実 験 結 果 ・ 考 察 】

前 糖 尿 病 モ デ ル で あ る 高 脂 肪 食 群 の 肝 臓 、 血 清 で は GM2、 筋 肉 と 脂 肪 組 織 で は GM3、 膵 体 頭 部 で は GM1 の TLC 上 で の 移 動 度 が 、 普 通 食 群 に 比 べ て 低 い 傾 向 に あ っ た 。 こ の TLC 上 で の 酸 性 ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 移 動 度 低 下 は 、 LC-MS/MS に よ る グ ル コ シ ル セ ラ ミ ド（ GlcCer）の 解 析 の 結 果 か ら 、短 い ア シ ル 鎖 、水 酸 化 し た ア シ ル 鎖 、不 飽 和 ア シ ル 鎖 を 持 っ た 分 子 種 の 増 加 が 原 因 と 考 え ら れ る（ Fig.2）。し か し 、重 度 の 2 型 糖 尿 病 モ デ ル マ ウ ス の 各 組 織 で は 、 病 態 進 行 に 伴 い 、 量 の 増 加 は 見 ら れ た も の の 、 酸 性 ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の TLC 上 で の 移 動 度 の 差 に 変 化 は 確 認 さ れ な か っ た こ と か ら 、ア シ ル 鎖 変 化 は 糖 尿 病 の 初 期 に 起 こ る も の と 考 え ら れ た 。今 回 、高 脂 肪 食 に よ っ て TLC 上 で の 移 動 度 が 変 化 す る 顕 著 な 差 が 見 ら れ た 酸 性 ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 は 、ガ ン グ リ オ シ リ ー ズ に 属 し て お り 、GlcCer を 前 駆 体 と し て 生 合 成 さ れ る（ Fig.1）。LC-MS/MS に よ る ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 解 析 で 、高 脂 肪 食 負 荷 に よ っ て 短 鎖 、水 酸 化 も し く は 二 重 結 合 を 有 す る ア シ ル 鎖 を 含 ん だ GlcCer 分 子 種 の 増 加 が 確 認 さ れ た

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が 、酸 性 ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 に も 同 様 の ア シ ル 鎖 変 化 が 起 こ っ て い る と 考 え ら れ る 。こ れ が TLC 上 で の 移 動 度 変 化 の 原 因 で あ る と 考 え ら れ 、今 後 、各 酸 性 ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の LC-MS/MS に よ る 詳 細 な 構 造 解 析 ・ 定 量 が 必 要 で あ る 。 ま た 、当 研 究 室 で は 、ヒ ト 糖 尿 病 患 者 の 血 清 の 酸 性 ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 に お い て も 、今 回 見 い だ し た 高 脂 肪 食 負 荷 マ ウ ス と 同 様 の 変 化 が 検 出 さ れ る こ と を 見 い だ し て い る 。以 上 の こ と か ら 、肥 満 に 伴 う ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の ア シ ル 鎖 の 水 酸 基 や 二 重 結 合 の 導 入 は 、糖 尿 病 の 増 悪 因 子 と な る 可 能 性 が あ る 。ま た 、 今 回 得 ら れ た 肝 臓 、血 清 、脂 肪 組 織 で 見 い だ し た 、肥 満 に 伴 う も う ひ と つ の 変 化 は 、GlcCer の ア シ ル 鎖 C16:0 の 分 子 種 の 発 現 の 増 加 で あ っ た 。高 脂 肪 食 負 荷 に よ っ て 、 C16:0 Cer の 合 成 酵 素 の 一 つ で あ る セ ラ ミ ド シ ン タ ー ゼ 6

（ CerS6） の 発 現 量 が 選 択 的 に 増 加 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 今 回 、 各 臓 器 で C16:0 の GlcCer が 増 加 し た 原 因 は 、 こ の CerS6 の 発 現 増 加 と 、 セ ラ ミ ド 合 成 酵 素（ CerS）の 基 質 で あ る パ ル ミ チ ン 酸 の 供 給 が 増 加 し た た め で あ る と 考 え ら れ る 。 こ れ ま で 、 CerS6 ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス は 、 高 脂 肪 食 負 荷 に よ る イ ン ス リ ン 抵 抗 性 を 起 こ し に く い こ と 、 CerS2 の ヘ テ ロ ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス は 、長 鎖 ア シ ル 鎖 の 合 成 が 減 少 し 、代 償 的 に C16:0 の Cer が 増 加 し 、重 篤 な 肝 障 害 を 起 こ す と い う 報 告 が あ る 。 し た が っ て 、 C16:0 の Cer か ら つ く ら れ る 各 ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 分 子 種 が 、イ ン ス リ ン 抵 抗 性 の 原 因 の ひ と つ に な っ て い る 可 能 性 が あ る 。更 に 今 後 は 、今 回 見 い だ し た ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 構 造 変 化 に よ り 、イ ン ス リ ン シ グ ナ ル に ど の よ う な 影 響 が 見 ら れ る か ど う か を 検 討 し て い き 、ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 と イ ン ス リ ン シ グ ナ ル の 関 係 性 を 明 ら か に す る 。ま た 、膵 臓 に お い て も 高 脂 肪 食 負 荷 に よ っ て 変 化 が 見 ら れ た こ と か ら 、 イ ン ス リ ン 分 泌 能 に も ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 が 関 与 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。上 記 各 組 織 に 加 え 、膵 臓 機 能 と ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 変 化 の 関 係 性 を 明 ら か に す る こ と に よ っ て 、糖 尿 病 と ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 関 係 性 の 全 体 像 が 明 ら か に な る と 考 え ら れ る 。加 え て 、今 回 の TLC 解 析 の 結 果 か ら 、高 脂 肪 食 マ ウ ス の 肝 臓 と 血 清 に お い て ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 発 現 分 子 種・組 成 比 、高 脂 肪 食 負 荷 時 の 変 動 は ほ ぼ 同 じ で あ っ た 。肝 細 胞 特 異 的 グ ル コ シ ル セ ラ ミ ド 合 成 酵 素 遺 伝 子 ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス の 肝 臓 で は 、GlcCer 以 降 の ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 発 現 が ほ と ん ど 消 失 す る が 、 附 随 し て 、 血 清 の GlcCer 以 降 の ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 も ほ と ん ど 消 失 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。し た が っ て 、血 清 の ス フ ィ ン

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ゴ 糖 脂 質 は 、 肝 臓 か ら 主 と し て 分 泌 さ れ て い る と 考 え ら れ る 。 こ の 報 告 は 、 今 回 得 ら れ た 、マ ウ ス 肝 臓 と 血 清 中 の ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 発 現 分 子 種 お よ び そ の 発 現 変 動 は 相 関 す る 、と い う 結 果 を 支 持 し て い る と 考 え ら れ る 。し た が っ て 、血 清 の ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 を 測 定 す る こ と で 、肝 臓 の ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 変 化 を 把 握 す る こ と が で き る と 考 え ら れ る 。

【 結 論 】

今 回 、高 脂 肪 食 餌 誘 発 性 肥 満 モ デ ル マ ウ ス の 各 組 織 お よ び 血 清 で 、ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の ア シ ル 鎖 構 造 が 変 化 す る こ と を 見 出 し た 。 今 後 、 2 型 糖 尿 病 モ デ ル マ ウ ス の ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 分 子 種 解 析 も 並 行 し て 行 い 、イ ン ス リ ン 抵 抗 性 に 深 く 関 与 す る 分 子 種 を 同 定 す る こ と が で き れ ば 、血 清 中 の ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 測 定 を 糖 尿 病 の 早 期 診 断 に 応 用 で き る 可 能 性 が あ る 。

Ceramide

Glycosylceramide

Lactosylceramide

Fig.1 Biosynthetic pathway of Glycosphingolipids (GSLs).

GSLs are based on ceramide (Cer) and glycan moiety, and have structural diversity in both ceramide (in its sphingosine and acyl chain structure) and glycan portion. Major classification have traditionally been based on the glycan. Gangliosides are a group of glycosphingolipids with one or more sialic acids in their glycan portion.

GM3 GM2

Gb3 Gb4

Ganglio-series Globo-series

isoGlobo-series Lacto-or neoLacto-series Asialo-series Sulfo-series Sphingomyelin GM1

Cer S Acyl CoA＋Sphinganine

3-keto-Sphinganine Palmitoyl-CoA＋L-Serine

GlcCer S Galactosylceramide

SM4

Fig.2 Structure of GlcCer.

R = Alkyl chain

H₂C

OH

NH H

CH₂O Glc R

O CH₃(CH₂)₁₀

Sphingosine d18:1

Alkyl chain

【 主 論 文 （ 原 著 論 文 ）】

1. 松 山 和 佳 奈 、郷 慎 司 、Lucas Veillon、稲 森 啓 一 郎 、井 ノ 口 仁 一（ 2015）

高 脂 肪 食 餌 誘 発 性 肥 満 モ デ ル マ ウ ス に お け る ス フ ィ ン ゴ 糖 脂 質 の 発 現 お よ び 構 造 の 変 化 . 東 北 薬 科 大 学 研 究 誌 , 第 62 号 .

2. Veillon, L., Go, S., Matsuyama, W., Suzuki, A., Nagasaki, M., Yatomi, Y., and Inokuchi, J. (2015) Identification of Ganglioside GM3 Molecular Species in Human Serum Associated with Risk Factors of Metabolic Syndrome. PLOS ONE, DOI:10. 1371 / journal. pone. 0129645.