子として同定され 前立腺癌をはじめとした癌細胞や不死化細胞で著しい発現低下が認められ 癌抑制遺伝子として発見された Dkk-3 は前立腺癌以外にも膵臓癌 乳癌 子宮内膜癌 大腸癌 脳腫瘍 子宮頸癌など様々な癌で発現が低下し 癌抑制遺伝子としてアポトーシス促進的に働くと考えられている 先行研究では ヒ

学位論文の内容の要旨

論 文 提 出 者 氏 名 髙田 愛子

論 文 審 査 担 当 者 主 査 北川 昌伸

副 査 山岡 昇司、清水 重臣

論 文 題 目 Dkk-3 induces apoptosis through mitochondrial and Fas death receptor pathways in human mucinous ovarian cancer cells

（論文内容の要旨）

＜要旨＞

Wntシグナルの阻害因子Dickkopf-3（Dkk-3）はヒトの様々な癌で発現が低下し、癌抑制遺伝 子として細胞増殖を抑制し、アポトーシス促進的に働くと考えられている。本研究では、ヒト卵 巣癌細胞株でDkk-3の作用に関する検討を行った。Western blot法により、卵巣癌細胞株の大部 分でDkk-3が発現していることを確認した。WST1法及びBrdU法により、Dkk-3を発現して いない明細胞腺癌JHOC5細胞株の方がDkk-3を発現している明細胞腺癌RMG1細胞株よりも 細胞増殖が亢進することを見出した。Dkk-3を発現している粘液性腺癌MCAS細胞では、siRNA でDkk-3をノックダウンした細胞（si Dkk-3）の方が対照細胞（si control）よりも細胞増殖が亢 進することがMTT法により明らかとなった。以上の結果から、Dkk-3は細胞増殖抑制因子であ ると判断した。また、DNA ladder法により、MCAS細胞のsi controlでは断片化DNAを検出 したのに対し、si Dkk-3では断片化DNAを検出しなかった。Western blot法により、si control に比べてsi Dkk-3ではCaspase-3やactivated Caspase-9、Bax、p53、activated Caspase-8、

Fas/CD95の発現が低下し、Bcl-2の発現が上昇した。以上の結果から、ヒト卵巣癌細胞株におい

てDkk-3はミトコンドリア経路とFas-デスレセプター経路を介してアポトーシスを誘導するこ

とが本研究で初めて解明された。

＜緒言＞

ヒト上皮性卵巣癌は婦人科癌の中でも死亡率の高い疾患であり、本邦では卵巣癌の罹患率が増 加傾向にある。卵巣癌は顕著な初期症状が少ないことや解剖学的な位置関係により、早期発見が 困難であり、進行した状態で発見されることが多い。そのため、卵巣癌の発生段階における分子 機構を解明することは卵巣癌を早期に発見して予後を改善するためにも重要となってくる。

Wntシグナル伝達経路は胚発生や細胞増殖、分化、生存に重要な役割を担っており、欠損する と腫瘍形成を誘発することが報告されている。WntシグナルはDkk-1,2,3,4の4種類があり、癌 細胞ではDkk-1,2,4は細胞増殖を抑制することが報告され、Wnt/β-catenin経路に関連している

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子として同定され、前立腺癌をはじめとした癌細胞や不死化細胞で著しい発現低下が認められ、

癌抑制遺伝子として発見された。Dkk-3は前立腺癌以外にも膵臓癌、乳癌、子宮内膜癌、大腸癌、

脳腫瘍、子宮頸癌など様々な癌で発現が低下し、癌抑制遺伝子としてアポトーシス促進的に働く と考えられている。先行研究では、ヒト卵巣癌ではDkk-3の発現低下は癌発生の初期段階に必須 であることや、Dkk-3の蛋白質発現は進行した卵巣癌の診断指標となる可能性があると示唆され ている。ただし、卵巣癌におけるDkk-3の詳細な分子機構については未だ明らかとされていない ことから、本研究で初めてDkk-3の分子機構を解明した。

＜方法＞

卵巣粘液性腺癌及び明細胞腺癌の細胞株を用いて、Dkk-3の蛋白質発現をWestern Blot法に より評価した。細胞増殖の評価を行うために、WST1法とBrdU法により、明細胞腺癌RMG1

細胞株とJHOC5細胞株で細胞生存率の変化を確認した。粘液性腺癌MCAS細胞株のDkk-3を

siRNAを用いてノックダウンし、MTT法により、si controlとsi Dkk-3で細胞生存率に対する 効果を評価した。 次に、Dkk-3の増殖抑制のメカニズムを推定するため、アポトーシスの評価 をおこなった。DNA ladder法により、抗癌剤Actinomycin D（Act-D）をPositive controlとし て、MCAS細胞株のsi control とsi Dkk-3で断片化DNAの検出を評価した。Western Blot法 により、si controlとsi Dkk-3を用いてアポトーシス実行因子Caspase-3やその上流に存在する activated Caspase-9、Bax、Bcl-2、activated Caspase-8、p53、Fas/CD95、JNK、β-catenin の発現を評価した。また、

pcDNA3.1-Dkk-3

＜結果＞

癌細胞でDkk-3の発現が抑制されるといったこれまでの報告とは異なり、本研究により、6種

類のヒト卵巣癌細胞株のうち、5種類の細胞株でDkk-3を発現する結果を得た。細胞増殖の評価 系では、Dkk-3を発現しない明細胞腺癌JHOC5細胞株の方がDkk-3を発現する明細胞腺癌 RMG1細胞株よりも細胞生存率が有意に大きかった（t検定、p<0.01）。粘液性腺癌MCAS細胞 株ではsi Dkk-3の方がsi controlよりも細胞生存率が有意に大きかった（t検定、p<0.01）。 こ のことから、Dkk-3は細胞増殖抑制因子であると判断した。

次に、アポトーシスの評価系では、DNA ladder法により、MCAS細胞株ではPositive control であるAct-Dやsi controlでは断片化DNAを検出したのに対し、 si Dkk-3では断片化DNAを 検出しなかった。Western Blot法により、si controlに比べてsi Dkk-3ではアポトーシス実行因 子Caspase-3やその上流にあるactivated Caspase-9、Bax、activated Caspase-8、p53、

Fas/CD95、JNKの発現が低下し、Bcl-2の発現が上昇した。ただし、β-catenin に関してはsi controlとsi Dkk-3で発現が見られ、両者で顕著な発現変化は起きなかった。また、MCAS細胞 株に

pcDNA3.1-Dkk-3

＜考察＞

本研究により、これまでの報告とは異なり、6種類のヒト卵巣癌細胞株のうち、5種類の細胞

株でDkk-3を発現する結果を得た。細胞増殖とアポトーシスの観点で研究を行い、Dkk-3は細胞

増殖抑制因子で、ミトコンドリア経路とFas‐デスレセプター経路を介してアポトーシスを誘導 することを初めて明らかにした。

Dkk-3の分子機構についてはこれまで様々な癌で報告されている。癌細胞ではDkk-3の発現は

低下し、Dkk-3は細胞増殖を抑制し、アポトーシスを促進することを明らかにしている。一方で、

骨肉腫や肺癌ではDkk-3はアポトーシスを誘導しないことも明らかとされ、このことは癌細胞の 種類によってDkk-3の働きが異なることを示唆する。婦人科癌では乳癌、子宮内膜癌、子宮頸癌

でDkk-3の先行研究が報告され、これらの癌細胞ではDkk-3の発現は低下し、アポトーシスを

誘導することが明らかとなっている。

Dkk-3と卵巣癌についての先行報告は三つある。一つ目は、Dkk-3は悪性度に関係なく発現が

低下し、Dkk-3発現低下は癌発生の初期段階で必要であること、二つ目は、卵巣癌患者は一般健 常者よりもDkk-3の血清レベルが低下し、Dkk-3の血清レベルは卵巣癌の診断指標となる可能性 を示唆していること、三つ目は、末期の卵巣癌患者は初期の卵巣癌患者よりもDkk-3の発現がわ ずかに低下していることを報告している。

これまでにヒトの様々な癌で、Dkk-3は様々なシグナル伝達経路を介して、アポトーシスを誘 導していることが報告されている。本研究では、si controlに比べてsi Dkk-3でアポトーシス実 行因子Caspase-3やその上流に存在するactivated Caspase-9、Baxの発現が低下し、Bcl-2の発 現が上昇し、ミトコンドリア経路を介してアポトーシスを誘導することを明らかにした。これま でに大腸癌や脳腫瘍でもミトコンドリア経路を介してアポトーシスを誘導することが報告されて いる。また、本研究により、Dkk-3はactivated Caspase-8、p53、Fas/CD95の発現も低下し、

Fas-デスレセプター経路を介することも明らかにした。我々が知る限りでは、この経路を介した 先行報告はなく、Dkk-3がFas-デスレセプター経路を介してアポトーシスを誘導することを見出 したのは本研究が初めてである。ただし、

pcDNA3.1-Dkk-3

Dkk-3は卵巣癌に一定以上存在すれば、アポトーシスが更に促進されることはないと判断した。

先行研究では、前立腺癌でDkk-3のアポトーシス誘導にJNKが主な役割を担っていることが 明らかにされている。本研究においても、JNKの発現を評価したところ、si controlと比べてsi Dkk-3でJNKの発現が低下し、Dkk-3誘導性アポトーシスにJNK経路が関与している可能性が 示唆された。また、大腸癌や子宮頸癌、骨肉腫、膵臓癌、脳腫瘍でDkk-3を強制発現させると β-cateninの発現が低下する先行研究が多々見られ、様々な癌でDkk-3はWnt/β-catenin経路に 関与していることが明らかにされている。しかし、本研究ではこれらの先行研究とは異なり、si controlとsi Dkk-3でβ-cateninが発現し、両者で顕著な発現変化は見られなかった。このこと から、卵巣癌ではDkk-3誘導性アポトーシスにWnt/β-catenin経路は関与していないと判断した。

一方で、癌細胞におけるDkk-3発現の低下は悪性度に関連していると指摘する報告もあり、頭

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無で細胞増殖の変化が起きたことから、Dkk-3はヒト卵巣癌細胞株において悪性度や転移に関連 している可能性が示唆される。

＜結論＞

本研究により、Dkk-3はヒト卵巣癌細胞に対する細胞増殖抑制因子であり、ミトコンドリア経

路とFas-デスレセプター経路を介してアポトーシスを誘導することが初めて明らかとなった。

論文審査の要旨および担当者

報 告 番 号 甲 第 4735 号 髙田 愛子

論文審査担当者 主 査 北川 昌伸

副 査 山岡 昇司、清水 重臣

（論文審査の要旨）

１． 論文内容

本論文は、ヒト卵巣癌細胞における癌抑制遺伝子Dickkopf-3（Dkk-3）の作用についての論文 である。

２． 論文審査

１） 研究目的の先駆性・独創性

Wntシグナルの阻害因子Dkk-3はヒトの様々な癌で発現が低下し、癌抑制遺伝子として細 胞増殖を抑制し、アポトーシス促進的に働くと考えられているが、卵巣癌における作用機序は 解明されていない。このような背景の下、申請者は卵巣癌細胞株を用いた遺伝子発現解析と制 御実験によりこの遺伝子とアポトーシスの関連について解析を行っており、その着眼点は評価 に値するものである。

２） 社会的意義

本研究で得られた主な結果は以下のとおりである。

1．卵巣癌細胞株の大部分でDkk-3が発現していることを確認した。

2．Dkk-3を発現していない明細胞腺癌JHOC5細胞株の方がDkk-3を発現している明細胞腺 癌RMG1細胞株よりも細胞増殖が亢進することを見出した。

3．Dkk-3を発現している粘液性腺癌MCAS細胞では、siRNAでDkk-3をノックダウンした 細胞（si Dkk-3）の方が対照細胞（si control）よりも細胞増殖が亢進することがMTT法に より明らかとなった。

以上のように申請者は、ヒト卵巣癌細胞株 Dkk-3 はミトコンドリア経路と Fas-デスレセプ ター経路を介してアポトーシスを誘導することを明らかにしている。これは卵巣癌の病態解明 や治療法開発を考える上で極めて重要な研究成果であるといえる。

３） 研究方法・倫理観

研究ではWestern blot法による蛋白発現解析、WST1法及びBrdU法による細胞増殖能の評 価、siRNAによるノックダウン法による蛋白発現制御が行われている。これらの手法は十分な 生理学的および分子生物学的知識の裏付けのもとに遂行されており、申請者の研究方法に対す る知識と技術力が十分に高いことが示されると同時に、本研究が極めて周到な準備の上に行わ れてきたことが窺われる。

( 2 ) ４） 考察・今後の発展性

さらに申請者は、本研究結果について Dkk-3 はミトコンドリア経路と Fas-デスレセプター経 路を介してアポトーシスを誘導すると考察している。これは先行研究と照らし合わせても極め て妥当な考察であり、今後の研究にてさらに発展することが期待される。

３． その他

最終試験はセミナー形式で行われ、申請者のプレゼンテーションの後、本研究に関する背景と 目的、実験方法、結果の解釈、本研究の意義や今後の課題などに関する質疑として、各々の実験 に適切なコントロールを設定するにはどうすべきか、現象の背景にあるメカニズムはどのように 考えるか、非処理細胞において細胞死マーカーが陽性である点など本実験結果で不自然な部分に ついてどのように理解するかについて、質問を行った。申請者の回答は、理解が不明確な点があ ったのでレポートの提出を課し、さらに追加の質問を行って確認を行った。その結果、全体とし て申請者の理解は十分な学識に裏打ちされた適切なものと考えられ、自立した研究者としての見 識を示した。

４． 審査結果

副査の山岡教授、清水教授と協議の上、申請者は博士（医学）の学位授与に値する学識を有す るものと判断した。