博士 （ 医学） 陳 学 位 論文 題 名
HIV − 1 の複製に必要な宿主因子の解析
― HIV −1 感染ラット細胞とヒト細胞の融合実験による検討一
学位論文内容の要旨
」ヨ．ー 日日
ヒ 卜免 疫不 全ウ イ ルス1型(human immunodeficiency virus−1：HIVー1）は後天性免疫不全症 候群(acquired immunodef iciency syndrome：AIDS)の原因ウイルスであり，CD4およびchemokine receptorで あ るCXCR4ま た はCCR5を感 染受 容体 とし て ，こ れら の分 子を も つヒ トT細胞 およ び 単球 ノマ クロ フ ァー ジ系 細胞 に 感染 する ．げっ歯類のCD4やchemokine receptorはHIV←1と 親和性がな く，マウスやラットはHIV―1感染に対して抵抗性である ことが知られている，最近，
ヒ トCD4とCXCR4ま た はCCR5を 導 入 し た ラ ッ ト 細 胞 で はHIV−1感 染 が 成 立 し ， さ らに ヒト cyclin Tlを 遺伝子導入することにより ，同細胞内でHIV−1が複製さ れる可能性が報告された．
し かし なが ら， そ の複製レベルはヒト 細胞に比べて極めて低く， ラット細胞内でHIV―1が大量 に 増 殖 す る に は 細 胞 表 面 の 感 染 受 容 体 とcyclin Tl以 外の ヒ 卜因 子も 必要 と考 え られ た，
HIV−1複 製 の 過 程 に はcyclin Tl，CDK9，CRM1，ICAMー3，NFにB，HP68，CIITAなど 多数 の 宿主 因子 が関 与 していると考えられ ているが，これまで，それ らの因子がどのような細胞に 分 布し てい るか ， あるいは，それらの うちのどの因子がより重要 な役割を果たしているかにつ い ては 明ら かで は なか った ．本 研 究で はヒ トCD4お よびCXCR4を 強制 発現させたラット線維芽 細 胞(W31/D4R4)を 用い ，HIV−1を その 細胞 に感 染さ せ た，HIV−1に 感染したW31/D4R4細胞と 種 々の ヒト 細胞 株 を融合し，各融合細 胞の培養上清ならびに細胞 溶解液中のHIV−1蛋白の発現 について，p24 Gag濃度を測定した．さ らに，ヒト細胞株およびラッ 卜一ヒト融合細胞における ヒ トcyclin TI，CDK9，CRM1，ICAM一3，NFにB，HP68，CIITAの遺 伝子 発 現変 化をRT−PCR 法 で検 討し た． こ れらの検討により，HIVー1の複製に必要なヒト 因子について解析を行った．
樹 立 さ れ た ラ ッ 卜W31/D4R4細 胞にHIV−1を 感 染さ せ，3ケ 月間 継代 培養 し た細 胞か らDNAと RNAを 抽出 して ，プ ロウ イ ルス の組 み込 みな らびにウイルス遺伝 子の発現をPCRおよびRT−PCR 法で検索し た． HIV―1感染受容体遺伝 子を導入したラット細胞にHIVー1を感染させることによ り，宿主ゲ ノム内へのプ口ウイルスの組 み込みが確認された． RT―PCRでもHIV―1のLTR，gag pol，vif，tat，envの 各 遺伝 子発 現が 検出 さ れた ．W31/D4R4細胞 にHIVー1を感 染 後， 経時 的 に培 養上 清と 細 胞溶 解液 を採 取 し，p24 Gag蛋白 の発 現をELISA法 で解析した．細胞上清中 のp24濃度 は感 染後2日 目お よび4日 目は1，000 pg/ml前 後検 出 され たが ，時 間が 経 過す ると と もに 急速 に減 少 し，28日 後に は ほと んど 検出されなくなった． 細胞溶解液中のp24は感染後 2日 目 お よ び4日 目 は10 ng/ml以上 の値 を検 出 した が， その 後 ，経 時的 に徐 々に 減 少し ，28 日 後 の 検 出 濃 度 は84 pg/mlで あっ た， 感染 後30月 経過 した 時 点に おい て，RT‑PCR法に よル ウ イル ス遺 伝子 の 発現 が観 察さ れ たが ，こ のとき，p24 Gag蛋白 の発現は細胞の培養上清には 検出されず ，また，細胞溶解液中におい ても12 pg/mlと微量であっ た．以上のことから，HIV−1 に 感染 した ラッ ト 線維芽細胞内におい てはウイルス遺伝子発現が あっても微量か，もしくはウ イ ルス の構 成や 細 胞外への放出機構に なんらかの障害がある可能 性が考えられた．融合実験に はHIV−1感 染 後30月 聞 継 代 維 持 し たW31/D4R4細 胞 を 用い た． このW31/D4R4細 胞と ヒ卜T細
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胞腫瘍株HUT78，マクロファージ系腫瘍株U937，GIなどのB細胞腫瘍株，癌細胞株PCI−6およ びHuh−7の融合細胞における細胞溶解液中のp24の濃度は4―10倍に増加した．しかし，ヒトT 細胞腫瘍株Jurkatと融合したときにはp24の有意な増加は確認されなかった，また，ヒ卜卵 巣癌株HTOAとの融合細胞においてもその増加はごく軽度であった．なお，今回の検討ではほ とんどの融合細胞の上清中に明らかなp24の増加は確認されなかったが，ヒトB細胞腫瘍株 WT46との融合細胞の培養上清中においては10 pg/mlのごく少量のp24が検出された，Jurkat やHTOAを螢光標識レ，W31/D4R4細胞と融合レたときの螢光発現率に，他の細胞との有意差は なかったので，単に細胞融合の成否が結果に影響している訳ではないと考えられる，Jurkatお よびHTOAの各細胞とW31/D4R4細胞の融合細胞でp24発現の誘導がおこらなかった原因を追究 するために，実験に用いた各種ヒ卜細胞株およびW31/D4R4細胞との融合細胞を用いて，これ までにHIV―1複製に係わる・ことが示唆されているcyclin Tl，CDK9，CRM1，ICAMー3，NFだB， HP68，CIITAの7つのヒト遺伝子についてRT−PCR法でその発現を検討した．ヒトT細胞腫瘍 株HUT78とJurkatにHIV―1を感染させ，28日間継代培養したときの細胞溶解液中のp24 Gag 蛋白の濃度はいずれも100 ng/ml以上である（著者，未発表デ一夕）．これに対し，HIV−1感染 W31/D4R4細胞とHUT78を融合したときの濃度は1/1，000以下の値となっている，このことは，
cyclin Tl，CDK9，CRM1，ICAM一3，NF cB，HP68などHIV―1の複製に重要な役割を果たす ヒト遺伝子の発現が融合細胞中では欠落していることと関連している可能性が高い．一方，こ れらの遺伝子がすべて検出されなかったHUT78融合細胞およびSwei融合細胞においても細胞 溶解液中に非融合ラット細胞より有意に高いp24が検出されたことから，今回検索した遺伝子 以外にもHIV‑1複製に有利に働くヒト因子が存在する可能性がある，HIJT78では融合前に発現 していたCIITA遺伝子が，融合後は検出されなかった．これに対し，Jurkatでは，融合前には 検出されなかったCIITA遺伝子がラット細胞との融合により発現誘導されていた．Jurkat融合 細胞において有意のp24増加が観察されなかった原因とレて，融合操作によりCJITA遺伝子の 発現が誘導されたこととの関連が推測される．CIITAは感染初期においてTatの働きを代替す ることにより，HIV一1の複製に対して有利に働くと報告されたが，その後，過剰なCIITAはTat と競合的に働くとの実験結果も示されている，今回検討したlO種類のヒト細胞株のうち，
Jurkat同様p24の増加が 得られなかったHTOAにおいても，融合前は検出されなかったCIITA が融合後に発現誘導されており，本結果からもCIITAはHIV−1複製に対して抑制的に働くと考 えられる．そのほか，細胞融合前後でCIITAが発現誘導された細胞としてPC1一6とHuh一7があ るが，PCI―6においてはcyclin TIとCDK9の発現が細胞融合後も維持されており，また，Huh−7 においてはICAM−3の発現が融合後に発現誘導されており，CIITAによる抑制作用が相殺された 可能性が考えられる．今回の検討ではほとんどの融合細胞の上清中に明らかなp24の増加は確 認されなかったが，ヒトB細胞腫瘍株WT46との融合細胞の培養上清中においてはごく少量の p24が検出された．WT46融合細胞では，他の融合細胞で検出されなかったHP68が検出されて いる．HP68はHIVー1キャプシドが形成される際，宿主細胞の細胞膜に沿ってHIV−1Gag (p55) ボリベプチドが集合するときに使用される宿主因子である．酵母やマウスではHIV―1キャプシ ドの形成が認められないことが知られており，ヒ卜以外の動物細胞に感染性のH1¥rウイルスを 産生 放出 させ るた めに は， ヒ卜HP68遺伝 子導 入が不可欠である可能性も考 えられる．
本研究ではヒトCD4とCXCR4を発現するラット線維芽細胞W31/D4R4を用いて，この細胞にHIV−1 を感染させ，さらに各種ヒト細胞株と融合することによりHIV一1の複製に係わるヒ卜因子を解 析した，以上の結果から、今回検討したcyclin Tl，CDK9，CRM1，ICAM―3，NFだB，HP68， CIITA以外にもHIV−1複製に有利に働くヒト因子は存在すると考えられた，ヒトT細胞腫瘍株 Jurkatと卵巣癌株HTOAとの融合ではp24の増加は誘導されなかった．これらの融合細胞では，
融合操作により発現誘導されたCllTAがHIV―1複製に対して抑制的に働いた可能性が示唆され た．HJV―1複製には，それに対して有利に働く宿主因子と不利に働く宿主因子が複合的に関与 していると考えられた．
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
HIV ―1 の複製に必要な宿主因子の解析
― HIV ―1 感染ラット細胞とヒト細胞の融合実験による検討一
HIV−1はAIDSの 原因 ウ イ ルス で あ り，HIV−1複 製 には 多 数 の宿 主 因子が関 与し て い る と 考 え ら れ て いる ． ヒ 卜CD4/CXCR4を 発 現 する ラ ッ ト線 維 芽 細胞W31/D4R4 はHIVー1に 感 染 し， プ ロ ウ イル スDNAが 細 胞ゲ ノ ム ヘ組 み 込 まれ る こ とが ， 趙 に より報 告されて いる． しかしな がら， 継代を重ねるにしたがい，HIV―1感染W31/D4R4 細 胞 の 培 養 上 清 中 にHIV―1p24蛋 白は 検 出 され な く なり ， 細 胞溶 解 液 中に お い て も その 濃 度 は微 量 と なっ た ． この こ と から ， ラ ット 線 維 芽 細胞 内 ではHIV―1の複 製 が十 分 に おこ ら ず ，細 胞 外 にHIV―1は ほ とん ど 放 出 され な い と考 えられ た．そ こ で， 本 研 究で は ，HIV―1感 染W31/D4R4細 胞 と各 種 ヒ 卜細 胞 を 融合 し，HIV―1の 複 製に 必 要 なヒ ト因子に ついて 解析を行 った． その結果 ，ヒトT細胞 腫瘍株Hut78． マ ク 口 フ ァ ー ジ 系 腫 瘍株U937，Rajiな ど のB細 胞 腫瘍 株 ，PCI−6な ど の 癌 細胞 株 等 多 く の ヒ 卜 細 胞 と 融合 し た と き， 融 合 細胞 溶 解 液中 のHIV―lp24濃 度は 融 合 前 の4―10倍に 増 加 した ． し たが っ て ，HIV―1の複製に 有利に働 くヒト 因子は， これ ら の 細 胞 種 に よ ら ず 発現 し て い ると 考 え られ た ． 一方 ，T細胞 腫 瘍 株Jurkatま た は 卵 巣 癌 株HTOAを融 合 し た 場合 はp24の 有 意な 増 加 は確 認 さ れな か っ た． 融 合 前 後 の細 胞 を 用い て，HIV‑1の複製 に関与す るとの 報告があ るヒトcyclin Tl，CDK9， CRM1，ICAM―3，NFだB，HP68，CIITAの 遺 伝 子 発 現 を 調 べ た と こ ろ ，Jurkatと HTOAと の 融 合 細 胞で は 融 合 後に 誘 導 され たCIITAがHIV−1複 製 に対 し て 抑 制的 に 働 い た 可 能 性 が 示 唆 され た ． ま た， 唯 一 培養 上 清 中にp24が 検 出 され たWT46融 合 細 胞で はHP68の 遺伝 子 発 現が 確 認 され ，HIV―1の 細胞 外 放 出に ヒ トHP68が 重要な 役割を 果たして いると いう報告 に矛盾 しない結 果であっ た．
発 表 の 後， ま ず ，副 査 守 内哲 也 教 授よ り 感 染実 験 を 行 った 場 所 につい て質問が あ った ． 申 請者 は ，HIVー1感 染 実 験はP3実験 室 で 行 う必 要 が ある こ と，その ため 中 棟1階 の 感 染 対 策 剖検 室 をP3実 験 室 とし て 申 請し ， 病 原性 微 生 物等 安 全 委員 会 の 承認 を 受 けた こ と を回 答 し た． ま た ，守 内 教 授よ り ， 本 論文 で は融 合細胞の ヒ 卜 遺伝 子 変 化の み検討し ており ，HIV―1複製 におけ るラット 遺伝子 の作用に っいて
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主 副
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不明であるとの指摘があった．申請者は，今回の検討では融合細胞のラット遺伝 子の発現変化は検討しておらず，HIV―1複製に対するラット遺伝子の作用について は今後の重要な検討課題であることを回答した．次に，副査長嶋和郎教授より，
HIV−1感染ヒト細胞のp24産生量について質問があった．申請者はHIV−1に感染し たヒトT細胞株およびマク口ファージ株の培養上清と細胞溶解液中のp24濃度は，
1 ng/ml以上と高かったことを自らの実験結果に基づき回答した，これに対し，長 嶋教授より，ヒ卜細胞とラット細胞を融合したときの値はそれに比べて極めて低 いが，なぜかという質問があった．これに対し，申請者は，融合操作により，多 くのHIV‑1複製に関与しているヒト遺伝子が消失したことがその原因と考えられ ると回答した．さらにf長嶋教授より，融合細胞においてヒト遺伝子が欠落する 現象は一般的なことかについて質問があった．これに対して，申請者は，一般に ラットとヒト細胞を融合する場合にはヒト染色体が消失し，ラットとマウス細胞 を融合する場合にはラット染色体が消失することが文献的に知られていると回答 した．最後に主査笠原正典教授より融合実験の再現性についての質問があった．
申請者は，融合操作は複数回行い，特にJurkatについては繰り返し実験を行って 結果が再現されることを確認したと回答した．いずれの質問に対しても申請者は 現在までのHIV―1感染，複製と融合細胞に対する知見や関連する論文報告などを 引用し，申請者自身の考察を交えて概ね妥当に応答した．この論文は高く評価さ れ，HIV等の増殖の分子機構の解明並びに新たなウイルス治療法の開発にも役立つ ものであると期待される．
審査員一同は，これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑚や取得単 位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと 判定した．
