学位論文内容の要旨
AnnexinA4isinvolvedinprolifEration,chemoresistance
andmigrationandilwasioninovarianclearcell
adenccarcinDmacells
(AnnexinA4は，卵巣明細胞腺癌細胞株の増殖，抗癌剤抵抗性，
運動能・浸潤能に関連している）
TaeMogami
最上多恵
Obstetric8andGynecology
CityUniversityGraduateSchoo1
Ybkohama ofMedicine横浜市立大学大学院医学研究科医科学専攻産婦人科学
DoctoralSupervisor；FumikiHirahara,Pro企ssor〉
（指導教員：平原史樹教授）
（
学位論文内容の要旨
AnnexinA4isinvclvedinprolifbraticn,chemoresistance
andmigraticnandinvasioninovarianclearcell
adenocarcincmacells
(AnnexinA4は，卵巣明細胞腺癌細胞株の増殖，抗癌剤抵抗性，運動能。浸潤能
に関連している） http:"wvvwbplcsoneoorE/article/infb:doi/10.1371月ournaLbone､0080359 序論 卵巣癌は,先進国における婦人科臓器発生悪性腫瘍の中で死亡原因の第一位を占める疾患で ある（IARC’2008)．上皮性卵巣癌は，漿液性腺癌，明細胞腺癌，類内膜癌，粘液性腺癌の４ つの組織型に分類されるが，日本を含めたアジアにおいて，明細胞腺癌の発生が他地域に比較 して多いことが指摘されている。 卵巣明細胞腺癌は，上皮性卵巣癌の標準的化学療法に抵抗性であり，進行癌では他組織型に 比較して予後不良である個別的な早期診断方法，有効な治療法を確立すべく，特に癌進展や 化学療法抵抗性に関わ愚メカニズムの解明は急務である。 我々の研究グループは，２次元電気泳動と質量分析を行い，卵巣明細胞腺癌におけるタンパ ク発現の網羅的解析を行った．この中で，他の組織型に比較して特に明細胞腺癌で発現が上昇 しているタンパクの一つとしてannexinA4を,最初に見出し報告した(MoritaetaL2006)。 AnnexinA4は，現在までに，遺伝子発現解析からも，タンパク発現解析からも，卵巣明細胞腺癌での発現冗進が指摘されているタンパクである（Ｋｉｍｅｔａ1.,20Q9;MarquezetaL,2005；
Ｍｉａｏｅｔａｌｏ，2,09；ＳｃｈｗａｒｔｚｅｔａＬ，20,2；Ｔｂｙａｍａｅｔａ1.,2012；Tsuchiyaeta1.,2003； YHmaguchietaL,2010;ＺｍｍｅｔａＬ,2005)． アネキシンは,カルシウムイオン結合部位を構成する共通のドメインをＣ末端側に複数もっ たタンパク群で，Ｎ末端側ドメインが他のタンパクとの相互作用を行い，その機能を発揮すると考えられている主な機能としては，endo-，exocytosis，membranescaEfblding，Ga2÷
signalingなどがあげられる。AnnexinA4の個別の機能については不明な点が多い．Annexin
A4は，腎細胞癌，胃癌，子宮内膜癌，卵巣明細胞腺癌などで発現の冗進が認められている．強制発現によって細胞運動能（Zimmermanneta1.,2004)，抗癌剤抵抗性（HanetaL,2000；
Kimeta1.,2009）の冗進を認めたとの報告が存在するが，卵巣明細胞腺癌細胞株を用いた報告は，調べ得た限り存在しない。また，annexinA4には２次元電気泳動で異なる等電点を示す２ つのサブタイプが存在することを我々のグループが見出しているが，その成因は不明であ駄 本研究に用いた細胞株では，OVTDKDが酸性型優位，OVI8Eが塩基性型優位のannexinA4 発現パターンである。 以上より，本研究⑳目的を，予後不良な組織型である卵巣明細胞腺癌で高頻度に高発現して いるannexinA4に着目し，annexinA4の卵巣明細胞腺癌の進展，化学療法抵抗性との関連を 調べることと，annexinA4の等電点の異なる２つのサブタイプの構造的，機能的な差異を調 べること，とした。 実験材料と方法
卵巣明細胞腺癌細胞株OVTOKQOVISEを用いた。ShorthailpinRNA（shRNA）を発
現するプラスミドベクターを遺伝子導入し，annexinA4恒常発現抑制株を作製した。コントロ ールには，非認識ランダム配列のｓｈＲＮＡを用いた。臨床検体は，横浜市立大学の倫理委員会 の承認を得て，同意のある症例を対象とし，手術による切除検体を用いた。細胞増殖能と抗癌剤感受性の検討は，細胞のviabilityをWSIL1assayによって測定して行
った｡細胞運動能と浸潤能は,チヤンパー法によるtranswellassayで評価した｡AnnexinA4，
LMP2，ＲＨＡＩＶｍの発現はウエスタン・ブロッテイングで調べた．臨床検体におiﾅるannexm A4の発現は，免疫組織染色を行い，染色範囲と染色強度をそれぞれＯから３の４段階に分類 してその合計値をIHDスコアとして評価した。ＡｎｎｅｘｍＡ４のサブタイプは，２次元電気泳動 で分離し，ウエスタン・プロッテイングで検出した．翻訳後修飾による変化は，リン酸化の可 能性をphosphataseで，カルシウムイオン結合をＥｍＡで，リジン残基アセチル化をヒスト ン脱アセチル化酵素阻害剤で処理することによって検討した。 結果と考察 臨床検体の免疫組織染色の結果,本研究に用いた52例全ての卵巣明細胞腺癌組織でELnnexm A4は高度に発現していた、それに対し，漿液性腺癌の９３％（１３例／１４例）ではａｎｎｅｍｎＡ４ 陰性であった．正常卵巣はannexinA4陰性であった．細胞増殖能は，０VＴＯＫＯでは，annexinA4の発現抑制によって著明に抑制され，細胞の倍
加時間は約２．５倍に延長した。０VISBでも同様の傾向を認めたが，コントロール株③うちの１ つで，同様の増殖抑制を認めた。抗癌剤感受性は，annexinA4発現抑制によって，OVTOKGでカルボプラチン，ＯⅥＳＥで
パクリタキセルに対して，改善を示した．カルボプラチンに対するＯＷ１ＯＫＯの５０％阻害濃度 は，コントロール株に比較して４０％以下に低下した。OVIＳＥでは，２つのコントロール株で 感受性が異なったために結論には至らなかった． 細胞運動能と浸潤能は,DVIＳＥでのみ,annexinA4発現抑制で有意に抑制された.ａｌｍＢ慈竹A４強制発現によってＲＨＡＭＭ（hyaluronan-mediatedmotilityreceptor)，ＬＡＭＰ２
（lysosome-associatedmembraneprotem2）の発現冗進を認めたとの報告がある（LinetaL，
2012)。ＲＨＡＭＭは，細胞運動能に（FoleyetaL,２口12;HanetaL,1994)，ＬＡＭＰ２は，浸潤。 転移に関連する（SarafianetaL,1998)。我々の細胞株のどちらも，ＲＨＡＭＭ発現はわずかで あったが，ＬＡn匹２はＯｗＳＥで相当量の発現を認め，annexinA4発現抑制によってＬＡＭＰ２ の発現は著明に低下した｡GVISEは,その運動能,浸潤能をＬＡＭ[Ｐ２に依存しており，annexm A4がその発現量の調節に関連しているた鐘に，DVISIBで⑳みannexinA4発現抑制によって 運動能，浸潤能の低下を認途たとも考えられた． サブタイプの成因を翻訳後修飾と仮説し，薬剤処理後にサブタイプの発現比率が異なるかを 調べたが，変化を認釣なかった．さらに，臨床検体でも２つのサブタイプが様々な比率で発現 していることを確認し，これを病期，予後，化学療法奏効性や，細胞内局在と関連するか調べ たが，有意な傾向は認めなかった． 本研究で我均は，卵巣明細胞腺癌細胞株を用いた発現抑制系においても，aImexinA4は細 胞増殖，抗癌剤抵抗性，運動能，浸潤能に関与していることを明らかにした。そして，異なる 等電点をもつ２つ②サブタイプが，異なる細胞生理学的機能をもちうる可能性を提示した。今 後のさらなるサブタイプ成因の解明は，卵巣明細胞腺癌の診断。治療、予後鰯改善に寄与しう るannexinA4の､さらなる理解を促すと考える．引用文献 ＦｏｌｅｙＪＲＬａｍＤ,ＪｉａｎｇＨ,ＬｉａＭ,DheongN,McDevittTM,ＺａｍａｎＡ,VVrightJR,and SavaniRC.(2,12).Tbll-likerGceptor2(TLR2),transfbrmillggrowth歯ctor-β,hyaluronan (HA),andreceptorfbrHA-mediatedmotnity(RHAMM)arerequiredfbrsurfactantprotein A-stimulatedmacrophagechemotaxis.‘Ｈｍｉ鰯anr,287(44),374,6-37419。 ＨａｌｌＣＬ,ＷａｎｇＣ,LangeLA,andTurleyEA。（1994)。Hyaluronanandthehyaluronan receptorRHAnnIIpromotefbcaladhesionturnoverandtr乱nsienttyrosinekinaseactivityLeJ ClaZIHi城126(2),575-588。 ＨａｎＥＫＴａｈｉｒＳＫ,CherianS]ＢＣｏｌｌｍｓＮ,ａｎｄＮｇＳＣ.（2000).Modulationofpaclitaxel resistancebyannexinⅣinhumancancerceulmes､戯･薮鰯､c“８３(1),83-88。 ＩＡＲＣ,ｑＬＯＢＯＣＡＮ２００８,“Cancerincidence,mortalityandprevalencevvorldwide.” (accessedonNov22,２，３） http:"ごl0bocanoiarc・firノ ＫｉｍＡ,EnomotonSeradaS,UedarllakahashmRipleyB,MiyatakemFUjitaM,LeeＣＭ， MorimOtOK,FnjimotoM,ＫｉｍｕｒａｍａｎｄＮａｋａＴｂ(2009)EnhancedexpressionofAnnexin A4iｎｃｌｅａｒｃｅｌｌｃａｒｃｌｎｏｍａｏｆｔｈｅｏｖａｒｙａnditsassociationvvithchemoresistancetc carboplatin､迩滅鰯nuBz:125(10),2316-2322. LinLL,HuangHC,ａｎｄＪｕａｎＨＥ(2012)｡RevealingthemoleculELrmechanisｍｏｆｇ釦stri旧 cancermarkerannexinA4incancercellpronferationusingexonarrays・麺娠“ａ７(9)， doi:10.1371/iiournaLponeo0044615 MarquezlWImaggerlyKA,PattersonARLiuJ,BroaddusR,FrumovitzMAtkinsonEN， SmithDLHartmannL,FishmanD,BerchuckA,WhitakerR,BershensonDM,Hills9B, ＢａｓｔＲＣＪ]ＧａｎｄＬｕＫＨ。（2005)。Patternsofgeneexpressionindi鍵renthistotypesof epithelialovamancancercorrelatewiththoseinnormalf患lllopiantUbe,endometrium,and cO1DnoCZ2i｡Ｃｋｚ１２塵r丑霞１１(17),6116-6126.
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論文目録 Ｉ原著論文（本人を筆頭とする原著論文） ＭｏｇａｍｉｍＹｂｋｃｔａＮ,Asai-SatoMYamadaR，ＫｏｉｚｕｍｅＳ，ＳａｋｕｍａＹ;YbshiharaM， NakamuraY;TakanoY)HiraharaEMiyagiY;MiyagiE・AnnexinA4isinvolvedin prolif息ration，chemoresistanceandmigrationandinvasioninovarianclearcell adenocarcinomacells・麺ＤＢ伽＆’８(11),doi:１Ul371/journaLponeDO8D359・Novemberll， 2０１３． Ⅱ副論文（原著論文の内容と関係のある論文） なし Ⅲ参考論文（原著論文の内容以外の論文） Ｍ･gamiT,HaruyaS,YbkDtaN,SuzukiR$SukegawaA,Asai-SatoM,MiyagiE,HiraharaR Serumln｣－６fbrdiagnosisofDvarlancarcinomaassociatedwithdermatomyositis:twocase reportsandcharacteristicclinicopathclogicalfactors･晦＃ＤＺｍＤＵｂｒ２ｆＪ;1,83-87.April2012． 加藤沙絵，最上多恵，宇佐美友希，倉澤健太郎，平吹知雄，白須和裕．診断に苦慮した虫垂粘 液性嚢胞腺癌の卵巣転移の１例｡互衣塵騨祷ﾘﾉ〔禅堂会j離宮:篭言YX迩方激会)誌;第４７巻第４号,４１１ 頁～416頁．平成２２年１１月発行
