学位論文内容の要旨

博 士 （ 医 学 ）    新 垣 雅 人

学 位 論 文 題 名

Studies onacancer ― testis antlgenCSTF2aSanOVe1     biomarkerforlungCanCer

（肺癌における新たなバイオマーカーとしての癌精巣抗原CSTF2 の研究）

学位論文内容の要旨

【 背 景 と 目 的 】 肺 癌 は 多 く の 国 に お い て 癌 死 の 上 位 を 占 め る 疾 患 で あ る 。 一 般 的 に 肺 癌 の 早 期 診 断 は 困 難 で あ り 現 在 に お い て も 予 後 の 悪 い 疾 患 に 変 わ り は な い 。 ま た 、 肺 癌 治 療 に っ な が る 肺 癌 の 様 々 な 遺 伝 子 学 的 な 変 化 は 報 告 さ れ て い る が 、 肺 癌 に お け る 発 癌 の 詳 細 な 分 子 の メ カ ニ ズ ム は 解 明 さ れ て い な い 。 肺 癌 の 発 癌 メ カ ニ ズ ム に 関 与 し て い る 診 断 お よ び 治 療 標 的 分 子 を 同 定 す る た め にcDNAマ イ ク ロ ア レ イ 技 術 を 用 い ゲ ノ ム ワ イ ド の 遺 伝 子 の 発 現 プ ロ フ ん イ ル を 解 析 す る こ と は 有 効 で あ り 、 我 々 は 、 各 種 の 組 織 系 ・ 病 期 の 肺 癌 患 者 120症 例 の 腫 瘍 組 織 よ りLaser microdissection法 を 用 い て 癌 細 胞 を 選 択 的 に 回 収 し 、 27，648の 遺 伝 子 とESTを カ バ ー す るcDNAマ イ ク ロ ア レ イ 解 析 を 行 い た 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ′ レ 解 析 を 行 った 。 こ の 結 果、Cleavage Stimulation Factor，3 pre‑RNA，Subunit2， 64kDa (CSTF2)遺 伝 子 が 、 大 多 数 の 原 発 性 肺 癌 で 発 現 亢 進 し て い る こ と を 発 見 し た 。 CSTF2は 、N末 端 にRibonucleoprotein (RNP)型RNA結 合 ド メ イ ン を 有 し て い る 核 タ ン パ ク 質 で あ る 。CSTF2は 分 裂 刺 激 因 子 複 合 体 を 形 成 す る タ ン パ ク 質 の1っ で あ り 、In vitro に お け る 分 裂 刺 激 因 子 の 構 成 タ ン パ ク 質 と し て のCSTF2の 機 能 は 報 告 さ れ て い る が 、 発 癌 メ カ ニ ズ ム に お け るCSTF2活 性 化 の 重 要 性 や バ イ オ マ ー カ ー や 治 療 標 的 分 子 と し て の 可 能 性 は い ま だ 報 告 さ れ て い な い 。 本 研 究 に よ り 、CSTF2が 新 し い 診 断 マ ー カ ー 、 治 療 標 的 分 子 、 な ら び に 免 疫 治 療 の 標 的 と な り う る か 検 討 し た 。

【 材 料 と 方 法 】 肺 癌 細 胞 に お け るCSTF2の 発 現 上 昇 を 確 認 す る た め に 、 肺 癌 臨 床 検 体 、 お よ び 肺 癌 細 胞 株 を 用 い て 半 定 量 的RT‑PCR解 析 、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト 解 析 を 施 行 し た 。 ま た 、 正 常 臓 器 に お け るCSTF2の 発 現 を 検 討 す る た め にmultiple tissue northern blot 解 析 を 施 行 し た 。 肺 発 癌 に お け るCSTF2の 生 物 学 的 、 ま た 臨 床 病 理 学 的 重 要 性 を 確 認 す る た め に 、 埼 玉 が ん セ ン タ ー で 外 科 的 切 除 し た 原 発 性 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 の 組 織 よ り 組 織 マ イ ク ロ ア レ イ を 作 製 し 、 免 疫 組 織 化 学 的 解 析 を 行 な い 、CSTF2の 発 現 と 原 発 性 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 の 予 後 と の 関 連 を 検 討 し た 。CSTF2が 肺 癌 細 胞 の 増 殖 、 生 存 に ど の よ う な 影 響 を 及 ば す か 検 討 す る た め に 、 肺 癌 細 胞 株 で あ るA549細 胞 とLC319細 胞 へCSTF2に 対 す る 合 成 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドsiRNAsを 導 入 し てCSTF2発 現 阻 害 実 験 を 行 っ た 。 ま た 、CSTF2 発 現 プ ラ ス ミ ド を 作 製 し 、 細 胞 の 増 殖 、 浸 潤 に 与 え る 影 響 を 検 討 し た 。

【 結 果 】 肺 癌 臨 床 検 体 を 用 い た 半 定 量 的RT‑PCRで はCSTF2が 肺 腺 癌 、 扁 平 上 皮 癌 、 小 細 胞 肺 癌 に お い て 高 頻 度 、 高 レ ベ ル の 発 現 を 認 め 、 正 常 肺 で は 発 現 を 認 め な か っ た 。 ま た 肺 癌 細 胞 株 に お け る 半 定 量 的RT‑PCRに お い て も 同 様 に 、 肺 癌 細 胞 株 に お い て 高 頻 度 、 高 レ ベ ル の 発 現 を 認 め 、 正 常 気 道 上 皮 由 来 株 で あ るSAECで は 発 現 を 認 め な か っ た 。 肺 癌 細 胞 株 に お け る 蛋 白 質 レ ベ ル で のCSTF2の 発 現 を 確 認 す る た め にCSTF2特 異 的 抗 体 を 用 い て ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト 解 析 を 施 行 し た と こ ろ 、mRNAレ ベ ル で の 発 現 と 同 様 に 肺 癌 細 胞 株 に お い て 発 現 を 認 め 、 正 常 気 道 上 皮 株 で あ るSAECで は 発 現 を 認 め な か っ た 。 同 抗 体 を 用

―107ー

い 細 胞 免 疫 染 色 で 細 胞 内 局 在 を 確 認 し た と こ ろCSTF2の 核 局 在 を 確 認 し た 。CSTF2の 正 常 臓 器 に お け る 発 現 を 確 認 す る た め にmultiple tissue northern blotを 施 行 し た と こ ろ 精 巣 に お い て の みCSTF2遺 伝 子 と 考 え ら れ るbandを 認 め た が 、 他 臓 器 に 発 現 を 認 め な か っ た 。 ま た 、 抗CSTF2抗 体 を 用 い た 免 疫 組 織 染 色 に よ ル ヒ ト 正 常 組 織 に お け る 蛋 白 質 レ ベ ル で の 発 現 を 確 認 し た と こ ろ 、multiple tissue northern blotと 同 様 、 心 、 肺 、 肝 、 腎 の 重 要4臓 器 に 発 現 を 認 め ず 、 精 巣 、 そ し て 肺 癌 組 織 に お い て の み 発 現 を 認 め た 。 肺 癌 臨 床 検 体 に お け る 蛋 白 質 レ ベ ル で の 発 現 に つ い て 、 抗CSTF2抗 体 を も ち い た 組 織 免 疫 染 色 で 確 認 し た と こ ろ 、 癌 組 織 で 核 に 染 色 を 認 め 、 正 常 肺 に お い て 発 現 を 認 め な か っ た 。 組 織 マ イ ク ロ ア レ イ を 用 い て 肺 癌 患 者 の 予 後 と の 関 係 を 検 討 し た と こ ろ 、CSTF2強 陽 性 症 例 に お い てCSTF2陰 性 群 お よ び 弱 陽 性 群 に 比 較 し 有 意 差 を も っ て 予 後 が 不 良 で あ っ た 。 単 変 量 解 析 で はCSTF2の 強 陽 性 、 年 齢 、 性 別 、 組 織 系 、T因 子 、N因 子 に 有 意 な 予 後 不 良 と の 相 関 を 認 め 、 多 変 量 解 析 で はCSTF2の 強 発 現 、 年 齢 、T因 子 、N因 子 が 独 立 し た 予 後 不 良 因 子 で あ っ た 。 癌 細 胞 の 増 殖 ・ 生 存 へ の 関 与 を 検 討 す る 目 的 に 、CSTF2高 発 現 株 で あ る A549細 胞 、LC319細 胞 を 用 い て 発 現 阻 害 実 験(RNAi assay)を 行 っ た と こ ろ ，siCSTF2 コ ン ス ト ラ ク ト に お い てmRNAレ ベ ル で の ノ ッ ク ダ ウ ン 効 果 を 認 め ，MTT assayに お い て そ れ に 一 致 し た 細 胞 増 殖 抑 制 効 果 を 認 め た 。CSTF2ノ ッ ク ダ ウ ン 効 果 に つ い て フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を も ち い て 解 析 し た と こ ろsiCSTF2を 導 入 し たA549細 胞 に お い て コ ン ト ロ ー ル に 比 較 し 導 入 後72時 間 の 時 点 に お い てsubGl期 の 細 胞 比 率 が 増 加 し て い る こ と を 確 認 し た 。 以 上 よ りCSTF2を 発 現 阻 害 す る こ と で ア ポ ト シ ー ス を 誘 導 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 さ ら な る 細 胞 増 殖 ・ 生 存 へ の 関 与 を 検 討 す る た め に 、CSTF2発 現 ベ ク タ ー を 作 成 しCOS7細 胞 に 一 過 性 強 制 発 現 さ せ た と こ ろ 、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ツ 卜 で は64kDa付 近 に bandを 認 め た 。 同 発 現 ベ ク タ ー を 用 い てgrowth assayを 行 い 細 胞 増 殖 に 与 え る 影 響 を 検 討 し た と こ ろ 、 Mockに 比 較 し 有 意 な 細 胞 増 殖 促 進 効 果 を 認 め た 。

【 考 察 】CSTF2は 、557の ア ミ ノ 酸 か ら な る タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る 遺 伝 子 で あ り 、 そ の N末 端 にRNP型RNA結 合 ド メ イ ン を 有 し て い る 。 CSTF2は 哺 乳 類 mRNA前 駆 体 の プ ロ セ シ ン グ に お い て ポ リ ア デ ニ ル 化 や 、3 末 端 の 切 断 に 関 与 し て い るCstF複 合 体 の ー っ を 構 成 し て い る 。 本 研 究 に お い て 、 我 々 は 、CSTF2遺 伝 子 が 多 く の 肺 癌 に お い て 過 剰 発 現 し 、 ま た 、 肺 癌 細 胞 の 生 存 、 増 殖 に 重 要 な 役 割 を 果 た す こ と を 証 明 し た 。 ま た 、 組 織 マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 に よ る 肺 癌 患 者 の 臨 床 病 理 的 因 子 と の 相 関 を 検 討 し た 結 果 、CSTF2発 現 が 強 陽 性 のNSCLC患 者 が 、CSTF2弱 陽 性 も し く は 陰 性 のNSCLC患 者 と 比 較 し 、 手 術 後 の 予 後 が 不 良 で あ る こ と 示 し た 。 こ れ は 、 本 研 究 は 癌 組 織 に お け るCSTF2発 現 の 有 無 が ヒ ト 癌 の 予 後 マ ー カ ー と な り う る 可 能 性 を 証 明 し た 最 初 の 報 告 で あ る 。 以 上 よ り 、CSTF2は 肺 癌 の 生 存 、 増 殖 に 重 要 な 役 割 を 果 た し 、 手 術 後 摘 出 標 本 に よ るCSTF2強 陽 性 は 、 予 後 不 良 因 子 で あ り 、 肺 癌 患 者 へ の 術 後 補 助 化 学 療 法 の 有 用 な 指 標 と な り う る 可 能 性 を 示 唆 し た 。 さ ら に 、 本 研 究 は 、 分 子 標 的 と し て の 選 択 的 なCSTF2の 機 能 阻 害 が 、 新 規 抗 癌 剤 と し て 有 用 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

【 結 論 】 以 上 よ り 、CSTF2は 肺 癌 の 増 殖 ／ 進 行 に 重 要 な 役 割 を 果 た し 、 肺 癌 組 織 で のCSTF2 過 剰 発 現 は 、 肺 癌 患 者 の 予 後 ヘ 関 与 し て お り 術 後 補 助 化 学 療 法 に 対 す る 有 用 な 指 標 と な る 可 能 性 が あ る こ と 、 さ ら に 分 子 標 的 と し て の 選 択 的 なCSTF2の 阻 害 が 、 新 規 抗 癌 剤 と し て 有 用 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 今 後CSTF2の さ ら な る 機 能 解 析 に よ り 、 臨 床 応 用 等 ヘ 研 究 が 発 展 す る こ と が 期 待 さ れ る 。

―108−

学 位 論 文 審 査 の 要 旨

主査   准教授   演 副 査    教 授    野 副 査    教 授    武 副 査    教 授    平

田 淳 一 口 昌 幸 冨 紹 信 野    聡

学 位 論 文 題 名

Studies onacancer‑testis antigen CSTF2 asanovel     biomarker for lung cancer

（肺癌における新たなバイオマーカーとしての癌精巣抗原CSTF2 の研究）

   本研究 は、癌 精巣抗原CSTF2 の発現および機能解析を行い、肺癌の予後マーカーおよび 新規治 療標的 分子としての CSTF2 の有用性を報告したものである。副査の野口教授が体調 不良に より欠 席されたため、学位審査は3 名の審査員により非公開で行われ、申請者の発 表後、 質疑応 答が行わ れた。

   副査武 冨教授よ り本研究 のきっ かけとな ったcDNA マイクロアレイ解析の結果から数多 くの解析候補遺伝子が挙っていたが、その中からCSTF 遺伝子を選択，した理由について質問 があった 。申請 者はCSTF2 を解析候補遺伝子として選択した理由について、マイクロアレ イのデータ上、癌における発現、特異性の高さに加え、癌における既報告がなく、その新 規性を重視したことを挙げた。続いてCSTF2 以外のCleavage stimulation factor 複合体を 構成する 蛋白質 であるCSTF1 およ びCSTF3 の 癌細胞および正常臓器における発現について 質問があ った。 申請者は CSTF1 と CSTF3 は癌 細胞特異的な発現パターンを示さず、多くの 正常臓器において発現している遺伝子である旨回答した。引き続きCleavage stimulation factor 複合体 の構成蛋白群において CSTF2 のみが癌特異的に発現している意義についての 質問があ った。 申請者は CSTF2 に は variant 遺伝子CS ′ rF2T が存在し、このCSTF2T の発現 が正常臓器において高いことから、正常細胞ではCSTF2T がCleavage stimulation factor 複 合体の機能を担っている可能性を回答した。

   演田准教授より、肺癌以外の他の癌種におけるCSTF2 の発現について質問があった。申 請者はマイクロアレイ解析において、肺癌の他、膀胱癌、子宮頸癌でCSTF2 の発現が上昇

‑ 109―

して いる旨回答した。次に、CSTF2 が細胞免疫染色において核に発現しているが、核の中 での 局在に関連した機能についての質問があった。申請者はCSTF2 が核の中で不均一に分 布しており、機能を解析する上で重要な指標となりうる可能性があること、また、今後の 解析 対象とすべきである旨を回答した。また、血液中にCSTF2 が検出されるか否かにっき 質問 があった 。申請 者は抗CSTF2 抗体を用いた ELISA 等による検討を施行していなぃが、

血清 のMS 解析に て CSTF2 は同定さ れず、 血液中で はCSTF2 は検出さ れない 可能性が 高い と回答した。

   最後に副査平野教授より癌精巣抗原を治療標的とする意義について質問があった。申請 者は、正常臓器では精巣でのみ発現していること、悪性腫瘍は多くは、生殖年齢を過ぎて からの発症することが多いこと、また、希望者には精子保存等の手段も選択可能であるこ と、ならびに癌精巣抗原はワクチン作製の際に免疫誘導も得られやすく治療標的分子とし て適している旨回答した。次に、組織マイクロアレイを用いた非小細胞肺癌患者の予後解 析において、年齢が独立した予後不良因子となっている理由についての質問があった。申 請者は 本検討 で用いた 症例はり ンパ節 転移陽性 例に対する adjuvant therapy でCDDP をべ ースに1 剤追加する他は特に制約を設けていないため、追加治療の可否も年齢でみられた有 意差に影響した可能性がある旨回答した。続いて組織マイクロアレイにおいて同一患者の 腫瘍採 取部位 によって CSTF2 の発現強度や細胞の悪性度に不均一性がある可能性について 質問があった。申請者は CSTF2 の発現強度の同一患者組織内での不均一性は少なく、また、

悪性度の不均一性を考慮し、同一患者の癌組織より複数の領域を採取している旨回答した。

さらに、本研究で得られた知見を臨床の場で活かす方策および展望について意見を求めら れた。申請者はDrug delivery system の確立が問題となるが、siRNA を用いた創薬や癌ワク チンといった免疫治療への応用の可能性がある旨を回答した。

   今回 の研究 により、 CSTF2 は肺癌および精巣に特異的に発現していること、肺癌組織で のCSTF2 過剰 発現は肺 癌患者の予後に関与しており術後補助化学療法の要否を決定する指 標と なりう ること、 ならびにCSTF2 は非小細胞肺癌の分子標的として有用であることが示

   欠席された野口教授とは、後日主査演田准教授が論文および審査の内容について協議を 行った。審査員一同はこれらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位な ども併せ、申請者が博士（医学）の学位を授与されるのに充分な資格を有すると判定した。

―110―