Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/
Title
№２６：ヒト末梢血血液細胞由来iPS 細胞を用いた骨芽
細胞誘導
Author(s)
加藤, 宏; 奥平, 貴人; 渡邊, 豪士; 東, 俊文; 柴原,
孝彦
Journal
歯科学報, 119(3): 246-246
URL
http://hdl.handle.net/10130/4913
Right
Description
目的：これまでに疾患 iPS 細胞の樹立は数多く報告 されており，病態解明や再生医療への応用が期待さ れている。我々も現在までにいくつかの先天異常に よる症候群患者の iPS 細胞の樹立に成功してきた。 本研究では，疾患 iPS 細胞を利用した骨再生医療の 先行研究として，末梢血血液細胞から iPS 細胞を樹 立し，それらを骨芽細胞誘導してその特性を検討し た。 方法：本研究は本学倫理申請に則って行った。同意 の得られた健常人から末梢血を５mL 採血し，ヒト T 細胞を取得した。得られた細胞にセンダイウィル スベクターを用いて初期化遺伝子を導入し，iPS 細 胞の樹立を行った。樹立した iPS 細胞は過去にわれ われが報告した骨芽細胞誘導法に準じて誘導を行 い，骨芽細胞マーカーの発現を real-time PCR 法に より評価し，アリザリンレッド染色にて硬組織形成 能を評価した。誘導骨芽細胞はヌードラット頭蓋骨 欠損モデルに足場材料とともに移植し，硬組織形成 の画像的評価を行った。 結果：ウィルス感染後２８日でヒト ES 細胞様コロ ニーの出現を多数確認した。アルカリホスファター ゼ染色にて陽性反応を示し，未分化・多分化マー カーは RT-PCR 法にて検出された。また，テラトー マ形成にて組織学的に３胚葉分化が観察された。得 られた iPS 細胞は骨芽細胞誘導にて骨芽細胞マー カーの発現が認められ，骨芽細胞誘導３０日後にはア リザリンレッド染色にて陽性反応を示した。実験動 物への移植実験では，骨欠損部にμCT にて散在性 の新生骨の形成を認めることができ，骨形成能を確 認することができた。 考察：通常の線維芽細胞と同様に，ヒト末梢血血液 細胞からの iPS 細胞の樹立，さらには骨芽細胞誘導 が可能であった。これらのことより，ヒト末梢血血 液細胞由来 iPS 細胞が骨再生療法の cell source に なり得る可能性が示唆された。現在，線維性異形成 症患者の iPS 細胞の樹立に取り組んでおり，樹立後 に骨芽細胞誘導を図って機能解析を進めていく予定 である。 目的：基底細胞母斑症候群は多発性顎骨嚢胞，多発 および再発性の基底細胞癌（BCC），肋骨異常を呈 する常染色体優性遺伝疾患である。責任遺伝子は PTCH1で，Hedgehog（Hh）経路の異常活性によ り症状を呈すると考えられている。中高年以降同時 期に多発する BCC は，非症候性 BCC と同様に紫 外線（UV）曝露の関与が報告されているものの， その詳細な病態については明らかではない。そこで 基底細胞母斑候群患者由来 iPS 細胞（G-OFiPSCs） を用いた BCC 疾患モデルの確立を目指し，本研究 では，G-OFiPSCs を角化細胞 へ 誘 導 し，そ の UV に対する反応について検討を行うことを目的とす る。 方法：東京歯科大学 生 化 学 講 座 に て 樹 立 し た G-OFiPSCs を使用し，角化細胞誘導培地にレチノイ ン酸１μM，BMP４ １０ ng/mL，EGF ２０ nM，Y-２７６３２ １０μM を添加し，角化細胞へと分化誘導を 行った。角化細胞への評価は基底細胞のマーカーで ある Keratin１４（KRT１４），Integrinβ４（ITGB４） などの遺伝子発現およびタンパクを確認した。その 後分化細胞を用いて，UV 照射を行い TUNEL 染色 にアポトーシス陽性細胞率を算出した。さらに，同 条件下における DNA 修復関連の遺伝子発現を確認 した。 結果および考察：上記分化誘導にて，G-OFiPSCs はコンロール細胞と同様に KRT14，ITGB4 および Tp63の遺伝子発現の増加を認め，角化細胞分化後 では免疫染色にて KRT14 および ITGB4 を確認し た。また G-OFiPSCs 群は Hh 経路のターゲット遺 伝子である HHIP および BCL2 の増加を認め，Hh 経路が活性化していることが判明した。培養細胞 に UV ８ J/m２ ；の単回照射を行い，１６時間後に G-OFiPSCs 群とコントロール細胞群と比較したとこ ろ，G-OFiPSCs 群ではアポトーシス陽性細胞率の 有意な減少を認めた。同条件下において，DNA 修 復関連遺伝子発現を確認したところ，G-OFiPSCs 群は p53 と BRCA1 の有意な増加を認めた。以上の 結果より，G-OFiPSCs の分化細胞は，抗アポトー シス分子である BCL2 の高発現と，UV 照射時に DNA 修復関連遺伝子の発現の増加によりアポトー シス抵抗性を有していることが示唆された。これは BCC 発症の一端を担っていると考えられる。
