博 士 （ 獣 医学 ） 金
学 位 論 文 題 名
恩 美
Effects of Chondroitin Sulfate‑E on Japanese Encephalitis Virus Infection
（日本脳炎ウイルス感染におけるコンドロイチン硫酸E の影響）
学位 論文内容の要旨
Glycosaminoglycans (GAGs) have diverse functions in the body and are involved in viral infection. However most recent studies on the function of GAGs in viral infection have been focused on heparan sulfate, thus the interaction between chondroitin sulfate (CS) and viral infection are not widely recognized so far. Therefore this study was performed to evaluate the role that CS plays in Japanese encephalitis virus (JEV) infection, particularly related to neural infection.
In chapter I, the effect of soluble CS (sCS) on JEV infection was investigated in African green monkey kidney‑derived Vero cells and baby hamster kidney‑derived BHK cells. Unlike other sCS preparations, sCS‑E (derived from squid cartilage) exclusively inhibited JEV infection in Vero and BHK cells.
This inhibitory effect arose from interfering with viral attachment on these cells.
In chapter II, the influence of sCS on JEV infection was examined in the mouse neuroblastoma cell line Neuro‑2a. Unlike Vero and BHK cells, sCS‑E enhanced JEV infection in Neuro‑2a, despite the fact that viral attachment to Neuro‑2a cells was inhibited by sCS‑E. This enhancement effect in Neuro‑2a cells seemed to be related to increased viral RNA replication due to inhibited JEV‑induced interferon (IFN)‑p synthesis by sCS‑E. In Neuro‑2a cells, knockdown of N‑acetyl‑D‑galactosamine 4‑sulfate 6‑O‑sulfotransferase, which synthesizes E‑disaccharide units (GlcApl‑3GalNAc(4,6‑O‑disulfate)) from precursor A‑disaccharide units (GlcApl‑3GalNAc(4‑O‑sulfate)) in CS chains by catalyzing the transfer of sulfate from 3'‑phosphoadenosine 5'‑phosphosulfate, increased the level of constitutive IFN‑p expression and reduced susceptibility to JEV infection.
In chapter III, it was investigated whether these alterations in the amounts of E‑units contribute to JEV neurovirulence in brains. In high‑performance liquid
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chromatography (HPLC) analysis, the amount of E‑disaccharide units of CS was larger in the brains of 4‑day‑old rats, which are highly susceptible to JEV infection, than in those of 17‑day‑old JEV‑resistant rats. Intracerebral co‑administration of sCS‑E with JEV in 17‑day‑old rats resulted in higher brain viral loads relative to rats infected without sCS‑E administration.
Together, these results showed the paradoxical effects of sCS‑E on JEV infection in different cell types. Especially in neural cells, E‑disaccharide units enhanced JEV infection through the reduction of IFN‑p expression.
Furthermore, this study suggested that the amount of E‑disaccharide in the brain CS might influence host susceptibility to JEV infection.
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学位論 文審査の要旨 主査
副査 副査 副査 副査
教授 教授 教授 准教授 准教授
澤 大橋 菅原 苅和 木村
学 位 論 文 題 名
洋 文 和 彦
一 幸（ 先端 生 命科 学研究院）
宏 明 享 史
Effects of Chondroitin Sulfate‑E on Japanese Encephalitis Virus Infection
（ 日 本 脳 炎 ウ イ ル ス 感 染 に お け る コ ン ド ロ イ チ ン 硫 酸Eの 影 響 ）
グ リ コ サ ミ ノ グ リ カ ン （GAGs)は プ ロ テ オ グ リ カ ン の 構 成 成 分 で あ り 、 二 糖 構 造 の 繰 り 返 し か ら な る 基 本 構 造 と 硫 酸 基 の 付 加 パ タ ー ン に よ っ て 分 類 さ れ る 。GAGsは そ の 構 造 に 基 づ き 、 生 体 内 で 様 々 な 機 能 を 示 す 。 本 研 究 で は 神 経 突 起 生 成 と 神 経 細 胞 の 遊 走 に 関 与 す る コ ン ド 口 イ チ ン 硫 酸Eユ ニ ッ ト に 着 目 し 、 神 経 向 性 ウ イ ル ス で あ る 日 本 脳 炎 ウ イ ル ス （JEV)の 感 染 に お い て コ ン ド ロイチン硫酸Eユニットが果たす役割に関して検討 を行った。
イ カ 軟 骨 由 来 の 可 溶 性 コ ン ド 口 イ チ ン 硫 酸E（sCS‑E)は 非 神 経 系 株 化 細 胞 で あ るVeroとBHK‑21へ のJEVの 吸 着 を 阻 害 す る こ と に よ ル ウ イ ル ス 感 染 を 阻 害 し た 。sCS‑Eは 神 経 芽 細 胞 腫 由 来 株 化 細 胞 で あ るNeuro‑2aへ のJEVの 吸 着 を Vero及 びBHK‑21と 同 様 に 阻 害 し た が 、Neuro‑2a細 胞 のJEV感 受 性 を 増 強 し た 。 こ の 感 染 増 強 効 果 は ウ イ ル ス 感 染 に よ っ て 誘 導 さ れ る イ ン タ ー フ ェ 口 ンp
（IFN‑p)の 産 生 抑 制 に よ り 、 ウ イ ル ス ゲ ノ ム の 複 製 が 亢 進 す る こ と に 起 因 し て い た 。 コ ン ド 口 イ チ ン 硫 酸Aユ ニ ッ ト か らEユ ニ ッ ト ヘ の 生 合 成 に 関 与 す る 硫酸化酵素Nーacetyl‑D‑galactosamine4ーsulfate 6‑O‑sulfotransferaseの発現をノッ ク ダ ウ ン し たNeuro‑2a細 胞 で は 、IFN‑pの 恒 常 的 な 発 現 が 増 強 し 、JEVに対 する 感受性が低下した。
JEVに 対 し 高 感 受 性 を 示 す4日 齢 の ラ ッ ト の 脳 に はJEV感 染 に 抵 抗 性 を 示 す 17日 齢 の ラ ッ ト の 脳 に 比 ぺ て よ り 多 量 の コ ン ド 口 イ チ ン 硫 酸Eユ こ ッ ト が 含 ま れ て い た 。sCS‑EとJEVの 混 合 物 を 脳 内 接 種 し た17日 齢 の ラ ッ ト は 、JEVの み を 脳 内 接 種 し た 同 日 齢 の ラ ッ ト に 比 較 し て 、 脳 内 の ウ イ ル ス 量 が 高 値 を 示し た。
本 研 究 に よ っ て 、sCS‑EのJEV感 染 に 及 ば す 影 響 は 、 細 胞 の 種 類 に よ っ て 異 な る こ と が 明 ら か と な っ た 。 神 経 系 細 胞 な ら び に ラ ッ ト 感 染 モ デ ル に おい て、
コ ン ド ロ イ チ ン 硫 酸Eユ ニ ッ ト はIFN‑pの 産 生 を 抑 制 す る こ と に よ りJEV感 染 増 強 効 果 を 示 し た 。 脳 内 コ ン ド ロ イ チ ン 硫 酸 に 含 ま れ るEユ ニ ッ ト が 、 宿 主 の JEV感 受 性 に 影 響 を 及 ぽ す こ と が 明 ら か に な り 、 こ れ はJEVの 感 染 機 構 の 解 明
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において極めて重要な知見であると考えられる。
審査委員 一同は、上 記博士論文提出者金恩美氏の博士論文は、北海道 大学大学院獣医学研究科規定第6 条の規定による本研究科の行う博士論文の 審査等に合格と認めた。
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