博士（医学）小泉和輝 学位論文題名
In vitro expansion of CD34+7CD41+cells from human peripheral blood CD34+7CD‑ cells : Role of cytokines for in vitro proliferation and differentiation of megakaryocytic progenitors
（ヒト末梢血幹細胞 (CD34 +/CD41‑) から巨核球系前駆細胞 (CD34+/CD41 十）へのin vitro 増幅：巨核球系前駆細胞の分化、
増殖における造血因子の役割）
学位論文内容の要旨
1．緒言
米 梢 血 幹 嗣 ‖ 胞 移 植 に お い て 一 般 に 、 穎 粒 球系 細I胞 の再 構 築は 速や か に認 めら れ るが 、tl小 版の 回復 は 遅く 、血 小 板崘 血L故 存性 が 長引 くの が 現状 である。Dercksしゝらは、臣 核球糸ネ川JJ笹 の 表 両 形 質 で あ るCD llを 測 定 し 、0．34X10 /kg以 上 のCD3d十 ／CD41十 細 胞 を 移 値 さ れ た 患 者 は、 それ 以 下のCD3d十 ／CD41十 細 亅胞 を移l直さ れ た患 者と 比 較し 、有 意 にlfル小 板 数の 圃後 が 早く なる こ とを 報告 し た。 この こ とは 、CD34十／ （：D41十糾胞が 米梢血幹嗣I｜胞移植におい て！n 小 板 の 回 復 能 カ を 有 す る 巨 核 球 系 前 駆 細I胞 で あ る こ と を 示 し て い る 。 米 キ 肖 血 か ら 純 化 し た （ニD341場 性荊u胞は、その大 半がCD41陰性細uJ包（CD34十/CD41ー荊8胞）である（D）．llI暢性宰：
0，（j崛 土（〕，5％）。本4甜究は、臨床応用 を視野に入れ、米 梢血から純化したCl〕34陽′」荊‖胞 （CD34十／（：D41―細胞）を巨核球系前膳区m胞（CD34十／CD41十翁！IJl包）ハ、と分化、上曽｜I扇させる こ と を 目 的 と し 、 そ の 過 程 を フ ロ ー サ イ 卜 メ 一 夕 一 お よ び コ 口 ニ ー ア ッ セ イ 法 で 経 時n勺 に 鋭 察 し、 造血 因 子で あるLhrombopoietin（rrPO） 、inCerleukin．3（IL．3） およ びsCemccuf clor （SCF）が巨核球系前駆細胞の増幅に果たす役割について検討した。
2． 対象 と 方法
（CD:34陽 性細 胞の 純化 ）
鯉 常人 から 得 られ た末 梢血400mlか らFicoll‑Hypaqueに よる 赤 血球 除去 、ア ルブ ミシに よる 血小 板除去、ナイ 口ンファイバーシリンジに よる付着翁4胞除去を行った 後にCD:34抗体 と免 疫磁 性ビ ー ズを 使用 してCD34陽 性細 胞を 純化 した 。
（CD34陽性細胞の液体培養、培養細胞の検討）
純 化CD341場 性細胞をIL‑3+SCFおよびr工 ｀PO+‑IL‑'3+SCFの2種類の 造血因子の組L合せ下 で 液 体 培 養 し 、0日 目 、2日 目 、4日 目 、G日 目 、8日 目 、10日 目 に 鼎 川 包 を 匣l収 し 、 (Dフローサイトメ一夕一による表面形質（CD34，CDLl1）の測定
＠谷分化段階の巨核球系前駆細胞(0，2，4 6，8，10日目細胞）の各価造血凶子反応性（′1｀i．（〕
′1、PO+SCF，rrPO十IL．3，rrPO十IL．3十SCF）をフィブリンクロット半固J髟培地によるコロニー アッセイ法で検討した。
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ま たTPO+1L‑3+SCFの 組 合 せ で 液 体 培 養 し たG日 目 に 細 胞 を 回 収 し 、CD3t1+/CDz11十 荊f｜胞 恥よびCD34―／CD41十糾胞のソーティングを行い、各種造血因子反J´ふ性ルP（），u」．：3，St｜J，，
ル，・．3十SCF，′rPO十IL．3，TPO十SCF，TPO十上l」．3十SCF）をフィブリンクロッ卜き仁固形上醫地によ るコロ二一アッセイ法で検討した。
（ 統 計 処 理 ）
す べ て の 結 果 はmean土SDで 示 さ れ 、Wilcoxon‑Mann‑WhiLneyULesLを 川 い て 各 検 討 を 行 い 、Pく0．05の 場 合 有 意 差あ り と 判 定 した 。
3． 結 果
（ 純 化CD34陽 性 細 胞の 性 質 ）
純 化 細 胞 のCD34陽 性 率 は89，8％ 土3．5％ で 、CD34陽 性 細 胞 の 表 面 形 質 の 亜 分 画 は 、CD38 が98．6％ 土O，8° ／。、HLA‑DRが95．5％土3．6％、CD117(c‑kit)が8，8％土2．9％ 、CD13が42．3%
土14．8％ で 、CD41は0．6％ 土O．5％ と 低 値 で あ り 、 そ の 大 半 がCD34+/CD41― 細 胞 であ っ た 。
（ 総 細 胞 増 幅率 ）
総 細 胞 増 幅 率 はTPO+IL‑3+SCFで10日 目 で47．7土17．1倍 でIL‑3+SCFの 組 合 せ(43．2 土15．0倍 ） と 比 較 し 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 ま た 培 養 日 数 と 伴 に 細胞 形 態 は 巨 核球 系 細 胞 へ の 分 化 が 認 め ら れ た 。CD34陽 性 率 は6日 目 ま で は 変 化 な か っ た が8日 目 以 後 低 下 し た 。 CD34陽 性 細 胞 増 幅 率 は 、6日 目 で 最 高 値 を 示 し 、TPO+IL‑3+SCFで12．5土3．2倍 で IL:3+SCFの 組 合 せ （9．8土3．3倍 ） と 有 意 差は 認 め ら れ なか っ た 。
（CD34+/CD41+の 発 現 率と 細 胞 数 ）
TPO+IL‑3+SCFの 組 合 せ で は 、CD34+/CD41+陽 性 率 は2日 目 よ り 増 加 し4日 目 で 最 高 値 （19％ 土7％ ） と な り 、 以 後 減 少 し た （10日 目 で2．g%土0．6％ ） 。 こ れ は 、IL‑3+SCFの 組 合 せ で も 同 じ 傾 向 を 示 し 、 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 ま た 増 幅 さ れ たCD34+/CD41+細 胞 が 、 純 化CD34陽 性 細 胞 中 のCD34+/CD41+細 胞 か ら 由 来 し た 可 能 性 を 否 定 す る た め に 、 純 化CD34陽 性 細 胞 か らCD34+/CD41― 細 胞 を ソ ー テ イ ン グ し 、TPO+IL‑3+SCFの 組 合 せ で 液 体 培 養 を 行 っ た と こ ろ 、6日 目 に9，9％ のCD34+/CD41+陽 性 細 胞 の 出 現 を 認 め た 。CD34 陽 性 細 胞1X los個 か ら 増 幅 さ れ るCD34+/CD41+細 胞 数 はTPO+IL‑3+SC,Fの 組 合 せ の6日 目 が 最 も 多 く1．7X l05土O．6Xl05個 で 以 後 減 少 傾 向 を 示 し た 。 ま たIL‑3+SCFの 組 合 せ （ CD34+/CD41+細 胞 数0．5Xl05土0．3X10s個 ） と 比 較 し 有 意 に 高 値 を 示 し た 。
<C,D34―/CD41+の 発 現率 と 細 胞 数 ）
CD34―/CD41+陽 性 率 は 培 養 日 数 と と も に 増 加 傾 向 を 示 し た が 、TP〇+IL‑3+SCFの 組 合 せ で はIL‑ ‑3+SCFの 組 合 せ と 比 較 し 、8日 目 お よ び10日 目 で 有 意 に 高 値を 示 し 、 そ れぞ れ15％ 土7％ 対5％ 土3％ 、38％ 土18％ 対11％ 土8％ で あ っ た 。 ま たCD34陽 性 細 胞1X los個 か ら 増 幅 さ れ るCD34−/CD41+細 胞 数 もTPO+IL‑3+SCFの 組 合 せ 有 意 に 高 く8日 目 お よ び10日 目 で 、 そ れ ぞ れ5．G土3．3X 10s個 対1．4土0．4X10s個 、19．5土10．5Xl05個 対5．O土2．8Xl05個 であ っ た 。
（ 各 分 化 段 階に お け る 造 血因 子 反 応 性 ）
造 血 因 子 反 応 性 に 関 し て は 、0日 目 や2日 目 な ど 未 分 化 な 造 血 幹 細 胞 はTPO単 独 で は ほ と ん ど 巨 核 球 系 コ ロ 二 一 を 形 成 し な い が 、 培 養 日 数 （ 巨 核 球 系 前 駆 細 胞 へ と 分 化 ） と と も に次 第 に コ ロ 二 一 形 成 が 認 め ら れ る よ う に な り 、10日 目 で はTPO+IL.3+SCFの コ 口 ニ 一 形 成 率 と ほ ぼ 同 じ と な っ た 。 ま た TPOにSCFを 加 え て も 、TPO単 独 と 同 じ 反 応 性 で あ っ た 。 TPO+IL‑3にSCFを 加 え て も 、 巨 核 球 系 コ ロ ニ ー 形 成 率 の 明 ら か な 増 加 は 認 め ら れ な か っ た 。 ま た 形 成 さ れ る 巨 核 球 系 コ □ 二 一 の サ イ ズ （ 巨 核 球 系 コ 口 二 一 の 増 殖 能 力 ） は 、 液 体 培 養で の 培 養 日 数 が 長 く な る ほ ど 、 減 少 す る 傾 向 を 認 め た 。 ソ ー テ ィ ン グ し たCD34+/CD41+細 胞 はIL‑3を 合 む 造 血 因 子 の 組 合 せ で 多 く の 巨 核 球 系 コ □ 二 ー の 形 成 を 認 め 、CD34+/CD41+細 胞 の 中 に 巨 核 球 系 前 駆 細 胞 が 存 在 す る こ と が 確 認 さ れ た 。CD34一/CD41+細 胞 に 関 し て は 1個 の 巨 核 球 を 維 持 す る か 、 非 常 に 小 さ な コ 口 ニ 一 形 成 を 認 め、 成 熟 し た 巨核 球 系 細 胞 と 推測 さ れ た 。
4 結語
本論文では、ヒト末梢血CD34 陽性細胞をthrombol)oietin くrPO ，c ．Mplligan （l 冫を合む 各種造血因子を用いinvitro で液体培養を行い、CD34 陽性細胞（CD34 十／CD41 ―）から巨核 球系前駆細胞（CD34 十/CD41 十）への分化増殖における最適な培養条件およびTPO の作用機 序を検討した。その結 果、TPO 、IL ・ 3 、SCF 存在下で 6 日問培養が最も効率のよい条件で あることを確認し、またTPO は巨核球系前駆細胞（CD34 十／ CD41 十）から巨核球（ CD34 ← ／CD41 十）への分化増殖におもな作用点があることを示した。
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