博 士 （ 医 学 ） 小 松 幹
学 位 論 文 題 名
免 疫 グ ロ ブ リ ン 様 レ ク チ ン Siglec ・ 15 を 介 し た 共刺激シグナルによる破骨細胞分化制御機構に関する研究
学位論文内容の要旨
【 背 景 と 日 的 】 破 骨 細 胞 の 分 化 ・活 性化 制御 機構 の 解明 は骨 破壊 性疾 患 の病 態と 治療 を 考え る 上で 必要 不可 欠 であ る． 破骨 細胞 は ，造 血細 胞を 起源 と する 単球 ／マ クロファージ系 の細胞であり，Macrophage colony stimulating factor (M‑CSF) 存在下で，Receptor activator of
NF‑KB ligand毋
ANKIー ） の 刺 激 に より ，酒 石酸 抵抗 性 酸フ オス ファ ター ゼ
(TRAP)陽 性の 多 核巨 細 胞（ 破骨 細胞 ） へと 分化する． RANKL は，TRAF6 ，c‑fos ，カルシウ ムシグナルなど様々 な刺 激 経路 を介 して ， 破骨 細胞分化のマスタ ー転写因子であるNuclear factor of activatedT
cells (NFATcl)を誘 導 する が， この うち カ ルシ ウム シグ ナル を 介し た刺 激経 路についてはま だ 不 明 の 点 が 多 い ． 近 年 の 研 究 に よ り ， 免 疫 グ ロ ブ リ ン 様 受 容 体 と
immunoreceptor tyrosineーbased activation motif(ITAM) を もっアダプター蛋白を介した 共刺激が，カルシウム シ グ ナ ル を 賦 活 化 す る と 考 え ら れ てい るが ，そ のり ガ ンド やメ カニ ズム の 詳細 は不 明の ま まである，
免 疫 グ ロ ブ リ ン 様 受 容 体 の 一 種 であ るSiglec ファ ミ リー は， 特定 のシ ア リル 糖鎖 と結 合 す る 内 因 性 レ ク チ ン で あ り ， 血 球 系細 胞に 広く 発現 し てい るが ，そ の機 能 の多 くは 未解 明 のま ま であ る． ，我 々 は， 過去 の研 究に お いて 破骨 細胞 前駆 細 胞に 発現 する シアリル糖鎖が そ の 分 化 に 関 与 す る こ と を 見 出 し てい たこ とか ら，
Siglecが共 刺激 経路 を 介し て破 骨細 胞 分化を制御してい るという仮説を立てた．
本 研 究 で は ， こ の 仮 説 を 検 証 す るた め， 破骨 細胞 分 化に おけ るSiglec の 発現 ，分 布の 解 析および共刺激経 路への関与を調査した．
【方法と結果】マウスの骨髄 系細胞に存在が示されているSiglec‑l ，‐3 ，‑5(F) ，‑15 ，‑H に関 し て ，破 骨細 胞分 化過 程 にお ける 遺伝 子 発現 の経 時的 変化 を
real‑time qPCRを 用いて調査し た ． 初 代 培 養 細 胞 で あ る 骨 髄 マ ク ロ フ ァ ー ジ
(BMM)お よ び マ ウ ス マ ク ロ フ ァ ー ジ 株 化 細 胞 株
RAW264.7にお いて ，
Siglec‑l，−3 ，−5 ，‑H は分化に伴って遺伝子発 現が減少もしくは不 変 であったが，唯‑ Siglec‑15 は分化に伴って発現が増加し た．
次 に 免 疫 染色 を行 った と ころ ，Siglec‑15 は前 駆細 胞 では 細胞 膜に わず か に発 現を 認め る の み で あ っ た が ， 前 破 骨 細 胞 お よ ぴ 成 熟破 骨細 胞で は 細胞 膜お よび 核周 囲 に強 く発 現し て い た ． 興 味 深 い こ と に
RANKI， 刺 激 後 ， 細 胞 融 合 過 程 に あ る 前 破骨 細胞 な ど一 部の 細胞 に は 強 い 発 現 が み ら れ た が ， 発 現 が 弱 い 単核 の細 胞も 混 在し てい た． フロ ー サイ トメ トリ ー 法 を 用 い て
Siglec‑15陽 性細 胞の 分 布変 化を 調査 した と ころ ，RANKI ー刺 激後 ，Siglec‑15 陽 性 細 胞 は
17.1％ か ら
37.5％ に 増 加 し ， 平均 蛍光 強度 の 増強 が確 認さ れた ． また ，異 なる 蛍 光 強 度 の ピ ー ク が 複 数 混 在 し て い た こ とか らも ，RANKI ，刺 激 後に はSiglec‑15 の発 現量 が 異 なるへテロジニアスな細胞群 が形成されることも裏付け られた．
Siglec‑15
遺伝子 を過剰発現させた安定化細 胞株(RAW.Siglec ー15 （り） を作成し，Siglec‑15 の 破 骨 細 胞 分 化 に 及 ば す 影 響 を 調 査 し た ．
RAW.Siglec‑15(+)を 用 い て
RANKL刺 激 後 に
TRAP染 色 行 っ た と こ ろ ， コ ン ト ロ ー ル の
RAW264.7 (RAW.Ctl)に 比 ベ 非 常 に 多 く の 核 を 内 包 す る 巨 大 な 破 骨 細 胞 の 形 成 が み ら れた ．ま たピ ッ トフ オー メー ショ ン アッ セイ を行 う
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とRAW.Siglec‑15(+)はRA．W．Ctlに 比 べ 有 意 に 大 き な 吸 収 窩 を 形 成 し た ． 破 骨 細 胞 分 化 マ ー カ ー の 遺 伝 子 発 現 量 は 全 てRANKIー 刺 激 後RAW．Siglecー15（ 十 ） に お い て 上 昇 し た ． ま た 細 胞 融 合 関 連 遺 伝 子 の う ちCD44とSIRPqの 遺 伝 子 発 現 は 不 変 で あ っ た がDC‐S1、AMPとCD9 は 上 昇 し た ，
Siglecー15遺 伝 子を ノッ ク ダウ ンし た 安定 化細 胞 株（RAW．Siglec．15（− ） ）を 作成 し ，同 様に 破 骨 細 胞 分 化 に 及 ば す 影 響 を 調 査 し た ．RAW．Siglec‐15（ ． ） で はRANKL刺 激 後 もTIuP陽 性 多 核 巨 細 胞 は ほ と ん ど み ら れ な か っ た ． ピ ッ ト フ オ ー メ ー シ ョ ン ア ッ セ イ で も 吸 収 窩 を ほ と ん ど 形 成 せ ず ， 破 骨 細 胞 分 化 マ ー カ ー の 遺 伝 子 発 現 も そ れ ぞ れ 抑 制 さ れ て い た ． 次 に 免 疫 沈 降 法 を 用 い て 破 骨 細 胞 内 でSiglec―15がI口 Mモ チ ー フ を 持 つ 細 胞 内 ア ダ プ タ ー 蛋 白DAP12と 会 合 し て い る 事 を 確 認 し た ． 更 にDAP12の 下 流 シ グ ナ ル で あ る り ン 酸 化 蛋 白PLCYl，2の り ン 酸 化 や そ の 下 流 の カ ル シ ウ ム シ グ ナ ル がRAW．Siglec−150で は 抑 制 さ れ ，RA．W．Siglec‐15（十 ）で は 賦活 化さ れ てい るこ と を， それ ぞ れウ ェス タ ンブ ロッ テ ィン グと 螢 光 イ メ ー ジ ン グ 法 を 用 い て 明 ら か に し た ， ま た 免 疫 染 色 を 行 う とNFATc1の 核 内 移 行 は m蝌Siglec‐15（ − ） で ほ と ん ど み ら れ ず ，RAW．Siglec−15（ ＋ ） で 賦 活 化 さ れ た ．
【 考 察 】 本 研 究 に よ り 我 々 は ，Siglec‑15がDAP12と 会 合 し カ ル シ ウ ム シ グ ナ ル を 介 し た 共 刺 激 経 路 を 賦 活 化 す る こ と で 破 骨 細 胞 分 化 を 制 御 し て い る こ と を 明 ら か に し た ． Siglec‑15は 骨 髄 細 胞 に 発 現 す るSiglecと し て は 唯 ー ，ITAMを も つDAP12と 会 合 し て い る こ と か ら ，Siglec‑15が 破 骨 細 胞 分 化 に 促 進 的 に 制 御 し て い る 事 が 想 定 さ れ た が ， こ の こ と は 本 研 究 に お け る 遺 伝 子 改 変 細 胞 を 用 い たPLC'yの り ン 酸 化 ， カ ル シ ウ ム シ グ ナ ル ，NFATcl の 核 内 移 行 に 関 す る 実 験 結 果 に よ っ て 証 明 さ れ た ，
RANKL刺 激 後 に 異 な るSiglec‑15発 現 量 の へ テ ロ ジ ニ ア ス な 細 胞 群 を 形 成 し た こ と は 非 常 に 興 味 深 い 結 果 で あ る 。 過 去 の 報 告 で も 骨 髄 マ ク ロ フ ァ ー ジ はRANKL刺 激 後 に ， 偽 足 を 伸 ぱ し 周 囲 の 細 胞 を 取 り 込 も う と す る 細 胞 と ， 取 り 込 ま れ て ゆ く 細 胞 と で へ テ ロ ジ ニ ア ス な 細 胞 群 を 形 成 す る と い わ れ て い る ． 本 研 究 に お い て もSiglec‑15の 高 発 現 細 胞 は 細 胞 融 合 過 程 の 細 胞 で あ っ た ， こ の こ と はSiglec‑15が 破 骨 細 胞 分 化 の う ち 細 胞 融 合 と い う 過 程 で 特 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と を 示 唆 し て い る と 考 え て い る ， 一 方 で 本 研 究 に は 疑 問 点 も 残 さ れ て い る ． 破 骨 細 胞 に は ， 今 回 我 々 が 見 出 し たSiglec‑15 の 他 に も ，TREM2やSIRP‑pぬ ど ア ダ プ タ ー 蛋 白DAP12と 会 合 す る 免 疫 グ ロ ブ リ ン 様 受 容 体(DARs)の 存 在 カ ミ 知 ら れ て い る ． こ れ ら の DAP12を 介 し た 共 刺 激 経 路 に よ り RAW.Siglec‑15(ー ） に お い て も 成 熟 破 骨 細 胞 が 少 な か ら ず 形 成 さ れ る だ ろ う と 想 定 さ れ た が ， 実 際 に はTRAP陽 性 多 核 巨 細 胞 は 殆 ど 形 成 さ れ な か っ た ， こ の 現 象 に 対 し て 考 え 得 る 理 由 と し て は ， 破 骨 細 胞 に 複 数 存 在 す るDARsは 同 時 に 賦 活 化 さ れ る こ と で そ の 機 能 が 発 揮 さ れ る の で は な い か と い う こ と で あ る ． こ の 考 え はTREM2遺 伝 子 を ノ ッ ク ア ウ ト し た 細 胞 で ， 他 のDARsが 存 在 し て い る に も か か わ ら ず ， 破 骨 細 胞 分 化 が 抑 制 さ れ た と い う 過 去 の 報 告 か ら も 裏 付 け ら れ る ． こ の 疑 問 を 解 決 す る た め に もSiglecー15の さ ら な る 分 子 機 構 の 解 明 が 必 須 で あ る と 考 え る ．
今 後 の 研 究 に お い て ， 他 のDARs同 様 未 だ 明 ら か に さ れ て い な いSiglec‑15の 内 因 性 リ ガ ン ド を 同 定 す る こ と は ，Siglecー15の さ ら な る 分 子 機 構 の 解 明 の た め に は 必 要 不 可 欠 で あ る ． ま た 実 際 の 生 体 内 で の 骨 代 謝 に お け る 役 割 を 明 ら か に す る た め に は 遺 伝 子 改 変 動 物 を 用 い たm vivo研 究 も 今 後 必 須 で あ る と 考 え て い る ．
【 結 論 】 我 々 は マ ウ ス 破 骨 細 胞 前 駆 細 胞 にSiglec‑15が 存 在 し ， 分 化 過 程 に お い て 発 現 上 昇 す る 事 を 明 ら か に し た ． ま た ，Siglec‑15はDAP12と 会 合 し ， カ ル シ ウ ム シ グ ナ ル を 介 し た 共 刺 激 経 路 に よ りNFATclの 核 内 移 行 を 誘 導 す る こ と で ， 破 骨 細 胞 の 分 化 を 制 御 し て い る 事 を 明 ら か に し た ．
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学位論文審査の要旨 主査 副査
副査 副査 副査
教授 教授 教授 教授 准教授
上出 三浪 藤田 久下 遠山
学 位 論 文 題 名
利光 明男 博美 裕司 晴一
免 疫 グ ロ ブ リ ン 様 レ ク チ ン Siglec‑15 を 介 し た 共刺激シグナルによる破骨細胞分化制御機構に関する研究
申請者は、先ず、破骨細胞の分化および
Siglecファミリ一分子の説明を行い。本研究の実施に 至 った背景 を明確 に説明し た。 本 研究にお いて、マクロファージ細胞株であるRAW 細胞を 用いて、糖結合能を有するSiglec ファミリー分子群の中で、Siglec‑15 分子に着目し、その破骨 細 胞分化に おける 役割およびその分化制御機序について明らかにした。
RAW細胞にSiglec‑15 を遺伝子導入した
RAW.Siglec‑15(+)細胞株を用いて、遺伝子導入前の細胞RAW.Ctl を対象群に して実験を進めた。RAW.Siglec‑15(+) において
RAW.Ctlと比ベ破骨細胞分化は亢進する事を明 ら かにした 。更に 、破骨細胞分化のマスター転写因子である
NFATclの発現が亢進し，カルシ ト ニンレセ プター ，カテプ シンK ，イン テグリン
B，
TRAP等の既知 の破骨 細胞分化マーカー 群の遺伝子発現も亢進している事を示した。Siglec‑15 分子による破骨細胞分化の制御機序に関 し て、申請 者は、
Siglec‑15がDAP12 と会合し，共刺激経路を介して破骨細胞分化を制御して いることを明らかにした。
発表後、主査の上出教授からは、ヒトにおいて遺伝的なSiglec の異常が原因となる疾患は存 在しているのかと質問がなされた。申請者は、現在の所，未だそのような疾患は報告されてい ないが，特に
Siglec‑15は2007 年に発見された比較的新しいSiglec であることからも今後発見 される可能性があると返答した。さらに申請者は、
Siglecのりガンドであるシアリル糖鎖が，
喘息や悪性腫瘍，ウイルス感染などさまざまな疾患に関与する分子である事からSiglec もヒト の疾患と関係が深い事が考えられる旨の説明をなした。Siglec‑15 遺伝子の過剰発現系を用いた 実験を行っており，その結果下流のシグナルが亢進しているが，これはSiglec‑15 分子のアグリ ゲーションによる結果であり、真のりガンドが作用した結果だと言えるのかと質問に対し、申 請者は、リガンドが同定されていないために本研究においてはそれを証明することは現段階で はできないとの返答をなした。加えて現在進行中の研究を引用しSiglec‑15KO マウスを用いた 系において，
Siglecー15 全長cDNA を導入することで，破骨細胞分化がレスキューされており，
さらに
Siglec‑15のりガンド結合部位にミューテーションを組み込んだSigle‑15‑R143A の導入で はレスキューされないことから，Siglec‑15 の外因性導入においてもりガンドが作用してシグナ ル を活性化 してい ると考えていると明確に回答した。最後に本研究では
RAW264.7細胞を用い
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た 実 験 で あ る こ と か ら ， マ ク ロ フ ァ ー ジ のRANKL誘 導 性 の 破 骨 細 胞 分 化 過 程 の 検 討 を 行 っ て い る が ， 骨 髄 細 胞 か ら 破 骨 細 胞 へ の 分 化 に お い て はSiglec‑15が ど の よ う な 役 割 を 果 た し て い る か と の 質 問 を 受 け た 。 申 請 者 は 、 既 にSiglec‑15KOマ ウ ス を 用 い た 実 験 で 骨 髄 細 胞 培 養 な ど は 計 画 し て い る と 回 答 し た 。
更 に 、 副 査 の 藤 田 、 久 下 、 三 浪 の 各 教 授 お よ び 遠 山 准 教 授 か ら 多 く の 質 問 が あ り 、 活 発 な 質 疑 応 答 が あ っ た 。 即 ち 、 破 骨 細 胞 に お け る Siglec‑15の 局 在 に つ い て ， 作 成 し た RAW.Siglec‑15(+)細 胞 で も 細 胞 膜 上 にSiglec‑15が 発 現 し て い た か ど う か 。NFATclの 結 合 実 験 な ど を 行 っ た か 。 他 のDAP12会 合 受 容 体 の 影 響 に つ い て は ど う か 。Siglec‑15の り ガ ン ド は ど の 細 胞 が 発 現 し て い る の か 。RANK‑RANKLシ グ ナ ル に よ っ てSiglec‑15の 発 現 が 上 昇 す る 機 序 は 明 ら か に な っ て い る の か 等 の 質 問 で あ る 。 こ れ ら の 質 問 に 対 し て 申 請 者 は 、 自 ら の 実 験 結 果 や こ れ ま で の 論 文 報 告 お よ び 自 己 の 未 発 表 の 実 験 結 果 を 引 用 し つ つ 概 ね 妥 当 な 回 答 を 成 し 得 た 。 こ の 論 文 は 、Siglec‑15を 介 し た 共 刺 激 シ グ ナ ル が 破 骨 細 胞 の 分 化 に 極 め て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 事 を 明 ら か に し た 点 で 高 く 評 価 さ れ 、 今 後 の 異 常 な 破 骨 細 胞 活 性 化 に よ る 骨 吸 収 を 示 す 骨 疾 患 の 新 た な 治 療 法 の 開 発 の 糸 口 と な る 事 が 期 待 さ れ る 。
審 査 員 一 同 は ， こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し ， 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。
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