腎臓において血圧概日リズムを制御している分子の探索

(1)

（要約）

日本大学大学院医学研究科博士課程内科系内分泌代謝内科学専攻

村田悠輔修了年

2017

年指導教員相馬正義

(2)

1

【背景】

様々な生物学的現象の観察から、生物が一日のリズム持つことが知られてきた。睡眠周期、心拍、血圧なども、概日リズムを示している。

18

世紀にフランスの天文学者である

de Marian

はオジギソウが日中は葉を開き、夜は葉を閉じる運動が恒常暗においても持続することを示し、生物現象を支配する生体内時計の存在の可能性を報告した^（¹^）。一日のリズムは概日リズム（

Circadian rhythm

）と呼ばれ、地球上の生物現象の概日リズムの周期は概ね約

24

時間である。

概日リズムを形成するうえで、主となるペースメーカーが哺乳類においては視交叉上核（

Suprachiasmatic nucleus

：

SCN

）に存在することが明らかとなり、

これを中枢時計と呼び、概日リズムの自律発振の中心となっている^（²^）。多くの末梢臓器にも生体内時計が存在し、これらの時計は中枢時計のコントロールを受けながら、それぞれの臓器に最適な時を刻んでいる。

最近、生体内時計の時を刻む分子機構が明らかとなってきた。この概日リズムを司る蛋白をコードする遺伝子群を時計遺伝子と呼ぶ。生体内時計は

Brain and muscle arnt-like 1

（

BMAL1

）、

Circadian locomotor output cycles kaput

（

CLOCK

）、

Period

（

PER

）、

Cryptochrome

（

CRY

）がコア蛋白として働くメインループから構成されている。細胞内において

CLOCK

、

BMAL1

が二量体を形成して転写因子として働きプロ―モーター内の

E-box

配列（

CACGTG

）に結合することで、多くのターゲット遺伝子の発現を促進する。ターゲット遺伝子の中には

Per

や

Cry

等の別の時計遺伝子も含まれている。転写、翻訳が増加した

PER

、

CRY

蛋白は核内へ移行し、

BMAL1

、

CLOCK

を抑制する。その後

PER

、

CRY

は多段階リン酸化を経て時間をかけて分解される。これにより

PER

、

CRY

により

BMAL1

、

CLOCK

の抑制が解かれ、再び

CLOCK

、

BMAL1

による遺伝子発現の促進が始まり、時計が一周する。このメインループのほかに、

Nuclear

(3)

2

receptor subfamily 1 group D member 1

（

NR1D1

）、

Retinoic acid receptor-related orphan receptor

（

ROR

）、

D-site of albumin promoter binding protein

（

DBP

）、

E4 promoter binding protein 4

（

E4BP4

）が関与するサブループも存在している。

NR1D1

は

RRE

（

AGGTCA

）配列に結合して、ネガティブフィードバックを経てメインループを抑制する一方で、

DBP

は

D-box

（

TTATGTAA

）配列に結合することでポジティブフィードバックを経て、メイ

ンループを促進する（図

1

）。生体内時計は様々な末梢臓器に存在しており、様々な生理現象の概日リズム形成に関わっている。

図

1.

生体内時計の分子機構^（³^）

血圧には日内変動が見られ、その異常が心血管合併症と相関することはよく知られている。血圧の日内変動と生体内時計の関連性は容易に想像できるが、

その機序は明らかになっていない。腎臓は糸球体における濾過と、尿細管にお

(4)

3

ける電解質、水の再吸収、排泄、さらにはレニン

-

アンギオテンシン系における血管収縮作用、

Na

の再吸収促進など血圧調整において極めて重要な役割を果たし、その機能が血圧の概日リズム形成に関わっていると考えられる。腎臓における血圧に対する役割と、概日リズムの関係も多数報告されている。正常の腎臓では夜間よりも日中に電解質の排泄量や尿の産生量が多く、

Na

、

K

、

Cl

排泄に概日リズムがあることが知られており^（⁴^）、そのリズムの破綻と高血圧とその心血管合併症との関連が示唆されている^（⁵^）。

【研究目的】

様々な生物現象のリズムは生体内時計に制御されていると考えられる。血圧の日内変動と生体内時計遺伝子の発現は密接に関与していると考えられるが、

その関連性は明らかにされていない。今回、高血圧自然発症ラット

（

Spontaneously Hypertensive Rat

：

SHR/Izm

）を用いて腎臓における遺伝子発現を解析し、発現が変動している遺伝子と生体内時計の関連性について検討した。

【方法、結果】

Gene Set Enrichment Analysis

（

GSEA; BROAD INSTITUTE

）データベースを用いて、転写開始点から上流または下流

2000bp

に生体内時計のメインループの中心となる時計蛋白である

BMAL1/CLOCK

の結合配列である

E-box(CACGTG)

を持つ遺伝子を検索し、

1032

個の遺伝子が抽出された。次に

DNA

マイクロアレイを用いて

5

週齢の

SHR/Izm

と

Wister Kyoto Rat

（

WKY/Izm

）の腎臓における遺伝子発現を検討した。

1032

個の

E-box

配列を持つ遺伝子のうち、

SHR/Izm

の腎皮質、髄質で発現が

2

倍以上増加または

50%

(5)

4

以下に減少している遺伝子で、さらに脳卒中易発症

SHR(Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rat

：

SHRSP/Izm)

の腎皮質、髄質でも同様の発現変化がみられたものは、

Nr1d1

、

Phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase

（

Ppat

）、

Fragile X mental retardation, autosomal homolog 1

（

Fxr1

）、

B-cell lymphoma 6

（

Bcl6

）、

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3

（

Hnrnpa3

）、

Nucleophosmin

（

Npm1

）、

Neuronal pentraxin 1

（

Nptx1

）、

Pleiomorphic adenoma gene-like 1

（

Plagl1

）、

Phospholipase B domain containing 1

（

Plbd1

）、

Transducin (beta)-like 1X-linked

（

Tbl1x

）、

Tripartite motif containing 46

（

Trim46

）、

Thyrotroph embryonic factor

（

Tef

）の

12

遺伝子であった。これらの遺伝子は腎臓において高血圧に関連し生体内時計に概日リズムが制御されている遺伝子であると考えられた。

次にマウス尿細管上皮細胞（

TCMK-1

）に対してデキサメサゾン

0.5

μ

M

を添加すると、時計遺伝子として知られている

Period1(Per1)

の遺伝子発現の概日リズムが形成された。さらに

Bmal1

、

Nr1d1

、

Cry1

においても検討したところ、

Bmal1

、

Nr1d1

ではデキサメサゾン添加

4

時間後、

28

時間後、

44

時間後に

mRNA

発現のピークを示し、

Cry1

では

4

時間後、

28

時間後、

48

時間後にピークを示す振幅であり概日リズムが形成された。これによりデキサメサゾン刺激により尿細管培養細胞である

TCMK-1

細胞においてデキサメサゾンにより生体内時計遺伝子の

mRNA

発現変動が誘導されることが示され、

TCMK-1

細胞に対するデキサメサゾン刺激は腎尿細管の生体内時計研究において有用なツールであることが明らかとなった。

TCMK-1

細胞をデキサメサゾンで刺激し、

4

時間おきに

48

時間後まで

mRNA

をリアルタイム

PCR

で定量し、

GSEA

および

DNA

マイクロアレイの結果から得られた

12

個の遺伝子のうちすでに生体内時計遺伝子として知られている

Nr1d1

を除く

11

遺伝子について、概日リズムが形成される

(6)

5

のか検討を行ったところ、

Ppat

では時計遺伝子と同様にデキサメサゾン刺激後、

28

時間でピークを形成し、その後発現減少をして、

44

時間で再び発現増加をしており、

Hnrnpa3

では

16

時間、

24

時間、

44

時間でピークを形成し、

Per1

と比較的近似した振幅を示した。

Npm1

では

Per1

と同様に、

28

時間での発現増加がみられた。

Fxr1

では

24

時間で上昇し、その後減少した後、

44

時間でピークとなり、

Per1

に近似しており、概日リズムの形成が示唆された。次にこれらの変動の統計学的有意性を検討するために周期回帰分析を行った。まず、周期関数へのフィッティングを試みたが、

Plbd1

、

Tbl1x

、

Trim46

、

Npm1

はフィッティングができなかった。残りの

7

遺伝子のなかで

Fxr1

、

Ppat

のみが

p<0.05

の有意な回帰を示し、デキサメサゾン負荷にて周期性を持った

mRNA

日内変動が誘導されていることが示された。

PPAT

、

FXR1

の尿細管細胞内での局在を明らかにするために。

TCMK-1

細胞を抗

PPAT

抗体、抗

FXR1

抗体を使用し、免疫染色を行った。

PPAT

は尿細管の核と細胞質に、

FXR1

は細胞質に染色された。次に腎での局在を明らかにするため、

5

週齢の

WKY/Izm

、

SHR/Izm

腎臓を使用し、免疫染色を行った。

PPAT

は近位尿細管、遠位尿細管の核と細胞質に局在し、

FXR1

は近位尿細管、遠位尿細管の細胞質に局在していた。

【まとめ】

生体内時計の研究は生体内時計遺伝子の概日リズムを評価するために個体から数時間間隔で

mRNA

を得なければならず、動物モデルを用いるとしてもその数が非常に多くなり、手技的、経済的に困難な研究となる。それゆえ、

in vitro

の系において生体内時計を評価する系を確立することは生体内時計研究を加速すると考えられた。すでに培養マウス線維芽細胞にデキサメサゾン負荷を行う

(7)

6

と、生体内時計遺伝子発現の振幅が再現されることが報告されている^（⁶^）。さらに、培養細胞に高濃度ウマ血清を負荷しても同様に生体内時計遺伝子の発現振幅が誘導されることも報告されている^（⁷^）。これらは末梢時計の振幅を再現するものと考えられている。本研究では、マウス尿細管上皮細胞（

TCMK-1

）にデキサメサゾン

0.5

μ

M

を負荷することで生体内時計遺伝子である

Per1

、

Cry1

、

Nr1d1 mRNA

の振幅を誘導することに成功した。これにより、この

TCMK-1

細胞に

0.5

μ

M

デキサメサゾン負荷系が

in vitro

での腎臓末梢時計研究における有用なツールとして確立された。

本研究において、

TCMK-1

−

0.5

μ

M

デキサメサゾン系を用いて

11

の候補遺伝子について振幅誘導を試みたところ、

Fxr1

、

Ppat

の

2

つの遺伝子において、その振幅の誘導に成功した。この

Ppat

、

Fxr1

は高血圧モデルラットの腎臓において発現が大きく変動しており、

E — box

を持ち、デキサメサゾン負荷により、その発現振幅が誘導された。さらに免疫染色により

PPAT

は尿細管の核と細胞質に、

FXR1

は尿細管の細胞質に発現していることも確認された。これらの結果は、

この

2

つの蛋白が腎臓末梢時計により制御され、血圧概日リズム形成に関わる可能性のある候補であることを示している。

FXR1

は脆弱

X

症候群における原因遺伝子と考えられている

Fragile X mental retardation gene 1

（

FMR1

）と同じ遺伝子ファミリーに属している。

FXR1

は

FMR1

、

FXR2

と相互作用する

RNA

結合蛋白であり、核局在化シグナルと核排出シグナルを有していることから、細胞質、核の往復が出来ると推測されている^（8, 9, 10, 11^）。

FXR1

の具体的な機能ははっきりわかってはいないが、

心筋や骨格筋に特異的なアイソフォームが存在しており、

FXR1

発現の異常が骨格筋の異常を引き起こすと報告されていることから^（¹²^）、筋組織の発達に重要な役割を果たしている可能性が示唆されるが、

FXR1

が腎臓や血圧調節に関連して

(8)

7

いるという報告はない。しかし、マウスの血管平滑筋の細胞質に発現し、他のタンパク質と相互作用して、細胞の成長や増殖を制御しているという報告があり^（¹³^）、本研究において

SHR/Izm

、

SHRSP/Izm

の腎臓にて発現低下し、さらに尿細管細胞質に発現していることから、同じ中胚葉起源の尿細管細胞質に発現し、尿細管細胞の増殖や成長に関与することも考えられる。

PPAT

にコードされる蛋白質は、プリンヌクレオチド代謝において、ホスホリボシルピロリン酸を

5-

ホスホリボシルアミンに変換するうえで作用するアロステリック酵素である。プリン代謝経路においてリボース

-5-

リン酸からホスホリジルピロリン酸を経て、中間体であるイノシン酸を合成し、イノシン酸からグアニン、アデニンを合成する経路と、尿酸に分解する経路に分かれる^（¹⁴^）。

PPAT

はプリン代謝経路における

De novo

経路を制御しており^（¹⁵^）、

PPAT

の合成が促進されると、プリン体から分解される尿酸が増加する。プリン体の生合成及び分解は全身の細胞で行われている。本研究において、

WKY/Izm

に比べ、

SHR/Izm

、

SHRSP/Izm

腎臓において発現上昇がみられ、

PPAT

は尿細管細胞の細胞質、核

に局在していた。尿酸はそれ自体が抗酸化作用をもつが、強い血管傷害性も有しており、動脈硬化の独立した危険因子となる。

本研究は生体内時計に制御され、血圧調節に関連する分子を配列解析、発現解析、培養細胞実験にて絞り込む新しい試みである。しかしながら候補分子である

FXR1

、

PPAT

が実際にどのような機序で血圧調節に関わるのか、現在は明らかではない。今後、細胞でのノックアウト、ノックイン実験、実験動物での同様の研究などで明らかにすることが必要と考えられる。これらの分子の腎臓における血圧調整の機序を解明することは、血圧概日リズム形成の機序を解明することに繋がると考えられ、さらに、これらの分子は時間生物学的な新しい治療ターゲットにもなりうると考えられる。

(9)

8

【参考文献】

(1) Marian. J. J. d. O. d. Observation botanique. Historie de I’Academie Royale des Science, 1729: 35-36.

(2) London AS. Circadian biology: a 2.5 billion year old clock. Current biology: CB. 2012; 22(14): 570-571.

(3) Zhang EE et al. Clocks not winding down: unravelling circadian networks.

Nat Rev Mol Cell Biol. 2010 Nov;11(11):764-776.

(4) Manchester RC: The diurnal rhythm in water and mineral exchange. J Clin Invest 12: 995-1008, 1933.

(5) Dyer AR, Martin GJ, Burton WN, Levin M, Stamler J: Blood pressure and diurnal variation in sodium, potassium, and water excretion. J Human Hypertens 12: 363-371, 1998.

(6) Aur é lio Balsalbe et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 2000; 289: 2344-2347.

(7) Aurélio Balsalbe et al. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 1998; 93: 929-937.

(8) Siomi MC et al. Specific sequences in the fragile X syndrome protein FMR1 and the FXR proteins mediate their binding to 60S ribosomal subunits and the interactions among them. Mol cell Biol 1996, 16:

3825-3832.

(9) Eberhart DE et al. The fragile X mental retardation protein is a ribonucleoprotein containing both nuclear localization and nuclear export signals. Hum Mol Genet 1996, 5: 1083-1091.

(10) Adams-Cioaba MA et al. Structural studies of the tandem Tudor domains of fragile X mental retardation related proteins FXR1 and FXR2.

PLos ONE 2010, 5: e13559.

(11) Mientjes EJ et al. Fxr1 knockout mice show a striated muscle phenotype: implications for Fxr1p function in vivo. Hum Mol Genet 2004, 13: 1291-1302.

(12) Davidovic L et al. Alteration of expression of muscle specific isoforms of the fragile X related protein 1 (FXR1P) in facioscapulohumeral muscular dystrophy patients. J Med Genet 2008, 45: 679-685.

(13) Yun Ma et al. Bcl-2-associated transcription factor 1 interacts with fragile X-related protein 1. Acta Biochim Biophys Sin 2014, 46: 119-127.

(14) Yamamoto T et al. The effect of completely purine-free diet of low

(10)

9

sodium content on purine intermediates and end-product. Eur J Clin Nutr 1990, 44: 659-664.

(15) Yainaoka T et al. Amidophosphoribosyltransferase limits the rate of cell growth-linked de novo purine biosynthesis in the presence of constant capacity of salvage purine biosynthesis. J Biol Chem 1997. 272: