博 士 （ 医 学 ） 小 林 直 樹
学 位 論 文 題 名
Functional coupling of the src‑family protein tyrosine kinases, p 59f y' and p 53/56' y' with the interleukin‑ 2 receptor ; Implications for redundancy and pleiotropism in cytokine signal transduction
(src − family protein tyrosine kinases ， p59fy 及び p 53/56'Y と interleukin ― 2 受 容 体 と の 機 能 的 役 割 ； そ の サ イ ト カ イ ン シ グ ナ ル 伝 達 機 構 に お け る 関 与 の 重 複 性 及 び多 様 性 の 暗 示 ）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
目 的
interleukin−2（IL一2）は，標的細胞表面に発現するIL ‑―2受容体（IL−2R）との相互 作用を介しその生理活性を発揮する。ILー2刺激後，速やかに細胞内蛋白チロシン残基のりン 酸化が亢 進することからIL−2の細胞内シグナル伝達においてチ口シンキナーゼ（PTK）の関 与 が示 唆さ れ てい るが ，3っのIL一2Rサ ブ ュニ ットd， 届，7鎖 にはPTK活性は認められ ない。一方，T細胞，NK細胞においてはsrc，ーfamily PTK(src―PTK)に属するp56′f＾(lck) がILー2Rロ 鎖(IL−2Rロ） と物 理的 に会 合 し，IL2刺激 によ り活 性化 さ れることが先に 報告されているが，ILー2はlckの発現の認められないB細胞，単球ナょどの血液系細胞におい てもその生理活性を発揮する。
そこで ，lckの触媒部位がIL―2R口 との物理的会合に重要であり ，その一次構造が他の srcーPTKsの触媒部位と相同性が極め て高いことから他のsrc―PTKsのIL―2シグナル伝達 における役割にっいて検討した。
材料及び方法 1)細 胞 培 養
サ ル 腎臓由来COS細胞株 は10％ウシ胎児血清(FCS)加IMEMにて，マウスinterleukin
‑3(11一3） 依 存 性pro−B細 胞株BAFーB03，BAF―B03由 来ヒ トIL一2Rptransfectant 14B (IL―2，IL―3依 存 性）及 びヒトgp130transfectant BAFh130 (11―6，IL一3依存 性） は20％WEHI培 養 上 清 及び10％FCS加RPMIに て 培 養 した 。
サイ ト カ イ ン刺 激 は ， 各細 胞 を10％FCS加RPMI中で洗 浄後， 同medium中 で12時間 factor−starvationを 行っ た 後 ， 施行 し た 。
2)抗 体 及び サ イ 卜 カイ ン
以 下の抗 体を使 用した 。抗ヒ トIL宀2Rロ 抗体；Mik ‑ロ1及びTuー27， 抗lck抗体 ； 195.7， 抗fyn抗 体 ； ば‑FYNN， 抗lyn抗 体 ；Lyn‑.8，抗yes抗 体 ；3H9， 抗fgr抗体 ； FGA12，抗v―src抗 体 ；327， 抗CD45抗 体；Ml／9，抗フ エスフ ォチ口 シン抗 体（抗p― tyr抗 体 ）。
゛ サ イ ト カイ ン 刺 激 には ，IL−2；5nMrecombinanthumanIL―2，IL−3；20％WE・ HI培 養上 清 ，interleukin―6（IL−6） ；30〃g／mlrecombinanthumanIL−6とlO〃g／ mlSOlubleILー6receptorを用 い た 。
3）COS細 胞 に おけ るcDNA発 現 実験
5 xioo個 のCOS細 胞 に り ン 酸 カ ル シ ウ ム 法 に よ ル ヒ トILー2Rロ及 びPTKcDNAを transfectionし48時間後，細胞を回収しflowcytometryによりIL―2Rロの発現を確認した。
4) cDNA
マウ ス ぬ た の調 節 領 域 （ア ミ ノ 酸1―233また は144） と各PTKの 触 媒部 位 マ ウス p 59＾f＾(hck) (228ー503)，マウスp59J″くfyn) (257―534)，ヒトインスリン受容体ロ鎖 (insR) (947―1343) cDNAを そ れ ぞれligationし ， 各 キ メラPTKcDNA；lck/hck，lck/
fyn及 びlck7insRを 構 築 し む た ，IL―2RロcDNAと 同 じく 発 現 ベ ク夕 一pdKCRにsub‑
cloningした。
5)免疫沈降法及びイムノブ口ッティング
細 胞可 溶 化 物 遠心 上 清 よ りIL―2RBをMik ‑ロ1ある いはTu―27を用 いて免疫 沈降 し， 沈降 物をSDS−PAGEにて 泳動後 ，工レク ト口ブ 口ッテ ィング にてゲ ルよりPVDFフィ ルターへtransf erした。フィルターを各抗src―PTK抗体で処理した後，［125I］―protein Aあるいはalkaline―phosphatase conjugated anti―Ig antibodyにて処理しautoradiog− raphyある いは発色 法で検 討した 。一方 ，14B細胞 をIL−2またはIL―3にて1），2）の通 り37度10分間刺激後，細胞可溶化物の遠心上清を上記の通ルブ口ッテイングし，抗pーtyr抗体 によって処理し検討した。
6） in vitro kinase assay
14B細 胞 をIL一2ま た はILー3，BAFh130細 胞 をIL―6ま た はIL―3に て1） ，2） の 通 り 刺激 し た 後 ， 細胞 可 溶 化 物 遠心 上 清 を抗り 凡ま たは抗fyn抗 体にて 免疫沈 降し ，沈降 物 に 基 質 と し て エ ノ ラ ー ゼ5肛gを 加 え ， 室 温 下 で5分 間 反 応 さ せ た 。 反応 後 ，SDS一PAGEに て 泳 動 し ゲ ル をKOH処 理(55度 ，1時 間 ） し た 後 ，autoradiographyに て 検 討 し た 。
結 果
1) キメラPTK とIL ―2R ロの物理的会合
COS細 胞 に お い て キ メ ラPTKとILー2RロcDNAを 共 発 現 さ せ た 場 合 に の みMik一 ロ1免疫 沈 降 物 中 にl,ckと同 様 にZch/hck，lck/fynの 特 異 的な 共 沈 が 認 めら れ た。 これ に対 しlck/insRの 共 沈 は 認め ら れ な か った 。
2) 11―2及 びIL―3刺 激 に よ る チ 口 シ ン 残 基 リ ン 酸 化 の 亢 進
両 サ イ ト カ イ ン 刺 激 に よ り14B細 胞に お い て ， 刺激 後 早 期 に 主 とし て 分 子 量85kDa，52 kDaの 細 胞 内 蛋 白 に チ 口 シ ン 残 基 の り ン 酸 化 亢 進 が 認 め ら れ た 。 3） srcーPTKsの14B細 胞 に お け る 発 現
14B細 胞 に お ける 各src一PTKの 発現 をin vitro kinationに よる自 己リ ン酸化 の有無 に よ り検 討 し た と ころp 59J″（fyn)，p53/56´ッ （lyn)の 発現 が認め られた が，lckの発 現は 認めら れな かった 。
4）IL一2及びILー3刺 激に よるfyn及びlyn堕i舌‑化
14B細 胞 に お い て両 サ イ ト カ イン に よ る 刺 激後 ，fyn，lynの 活性 化 に よ る エノ ラ ー ゼの り ン酸 化 亢 進 が 認め ら れ た 。 一方 ，BAFh130細 胞に お い て もIL一3刺激に より同 様の 活性化 が 認めら れた が，IL−6刺 激では 認めら れな かった 。
5）fynとIL−2RBとの 物理的 会合
14B細 胞 に お い てMik ‑ロ1及 びTu−27免 疫 沈 降 物 中 にfynの 特 異的 な 共 沈 が 認め ら れ た。こ れに 対し，lynの 共沈は 認められなかっ、た。共沈するfynの割合は全発現量の0．6−1．2％ であっ た。
考 察
IL―3依 然 性BAF一B03細 胞 は ，IL―2レ セ プ タ ー 遺 伝 子 の 発 現 に よ りIL2，IL 3刺 激依 存 性 に 細 胞内 蛋 白 チ 口 シ ン残 基 リ ン酸 化及び 核酸合 成の亢 進が 認めら れる。 さらに
IL−6レセ プター遺伝子の発現にてもIL―6，ILー3刺激依存性の細胞内蛋白チ口シン残基リ ン酸化及び核酸合成の亢進が認められることが報告されている。さらに，この細胞株において src―PTK fyn，lynのIL―2刺激に共役する活性化が認められた。
一方 ，fynとIL―2Rロが共沈することより細胞内での両者の物理的会合が示唆された。
IL一3刺激 によっても同様のPTK活性化 が認められるのに対しIL―6刺激によっては認めら れず，こ の細胞株においてはILー2，IL―3の細胞内シグナルは共通あるいは類似したメカニ ズ ム に よ り 伝 達 さ れ ， そ れ に はsrc−PTKsが 密 接 に 関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。
結 語
先 に報 告 したlckのIL―2によ る活 性化 とあわせて ，今回の結果よりsrc―PTKsはIL
―2シグナル伝達において重複して関与しうること，並びにその関与は各血液系細胞に特異的に 発現されるPTK（p59f″，p 53/56′ゴ″）に応じて多様性をもっものであることか示唆された。
学位論文審査の要旨
1研究目的
血 液系 細 胞はinterleukin←2受容 体（IL2R） を介 するinterleukin亠2（IL―2） による刺激後，速やかに細胞内蛋白チ口シン残基のりン酸化が亢進することからIL―2の細胞 内シグナル伝達においてチ 口シンキナーゼ（PTK）の関 与が示唆されている。T細胞，NK細 胞においてはsrc〜family PTK (src―PTK）に属するp56´f＾（セた）がIL―2Rロ鎖 （IL
―2RB）と物理的に会合し，IL―2刺激に共役して活性化 されることが報告されているが，
IL―2はlckの発現の認めら れないB細胞，単球などの血液系細胞においてもその生理活性を 発揮する。
そこで，ぬたの触媒部 位がIL―2RBとの物理的会合 に重要であり，その一次構造 が他 のsrc−PTKsの 触媒 部 位と 相同 性が 極め て 高い こと から 他 のsrc−PTKsのIL―2シグ ナ
保 光
明
利 光
崎 出
沼
宮 上
柿
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
ル伝達における 役割にっいて検討した。
2 材料及び方法 1) 細 胞 培 養
サ ル 腎 臓 由 来COS細 胞 株tま10％ ウ シ 胎 児 血 清(FCS)加IMEMに て ， マ ウ スinterleukin
―3（IL―3） 依 存 性pro−B細 胞 株BAFーB03，BAF一B03由 来 ヒ トILー2Rロtransf ectant 14B及 び ヒ 卜gp130transfectant BAFh130は20丶WEHI培 養 上 清 及 び10％FCS加RPMIに て 培 養 し た 。
サ イ ト カ イ ン 刺 激 は ， 各 細 胞 を10％FCS加RPMI中 に て 洗 浄 後 ， 同medium中 で12時 間f actor―starvationを 行 っ た 後 ， 施 行 し た 。
2)抗 体 及 び サ イ ト カ イ ン
以 下 の 抗 体 を 使 用 し た 。 抗 ヒ トIL―2Rロ 抗 体 ；Mikー 声1及 びTu―27， 抗 比 た 抗 体 ； 195.7， 抗fyn抗 体 ；d―FYNN， 抗lyn抗 体 ；Lyn宀8， 抗.yes抗 体 ；3H9， 抗fgr抗 体 ； FGA12， 抗v←src抗 体 ；327， 抗CD45抗 体 ；Ml／9， 抗 フ オ ス フ ，fチ 口 シ ン 抗 体 （ 抗 p一tyr抗 体 ） 。
サ イ 卜 カ イ ン 刺 激 に は ，IL―2；5nM recombinant human IL―2，IL−3；20％ WEHI培 養 上 清 ，interleukin一6(11―6） ；30ug／ml recombinant human IL―6と10
〃 g/ml soluble IL―6receptorを 用 い た 。 3) COS細 胞 に お け るcDNA発 現 実 験
5X 10'i個 のCOS細 胞 に り ン 酸 カ ル シ ウ ム 法 に よ ル ヒ トIL2Rロ 及 びPTKcDNAを transfectionし48時間 後 ，細 胞を 回 収しflowcytometryに よりILー2Rロの 発現を確認しずこ。
4）cDNA
マ ウ ス 七 た の 調 節 領 域cDNAと 各PTK（ マ ウ スp59＾ ＾(hck)， マ ウ スp59j″ くfyn) ヒ ト イ ン ス リ ン 受 容 体 ロ 鎖(insR） ） の 触 媒 部 位cDNAを そ れ ぞ れligationし ， 各 キ メ ラ PTKcDNA；lck/hck，lck/fyn， 及 びlck/insRを 構 築 し た 。
5)免 疫 沈 降 法 お よ び イ ム ノ ブ 口 ッ テ ィ ン グ
細 胞 可 溶 化 物 遠 心 上 清 よ りIL―2Rロ を 免 疫 沈 降 し ， 沈 降 物 をSDS―PAGEに て 泳 動 後 ， 工 レ ク ト ロ ブ 口 ッ テ ィ ン グ に て ゲ ル よ りPVDFフ ア ル タ ー へtransferし ， 各 抗src― PTK抗 体 で 処 理 し て 検 討 し た 。 一 方 ，14B細 胞 をIL−2ま たt注IL―3に て1)，2)の 通 り37
℃10分間 刺激 後 ，細 胞可 溶化物の遠心 上清を上記の通ルブ ロッティングし， 抗p―tyr抗体によ っ
て処理して検討した。
6冫in vivo kinase assay
14B細 胞 をIL―2ま た はIL一3，BAFh130細 胞 をIL一6ま た はIL―3に て1） ，2） の 通り 刺 激 し た 後， 細 胞 可 溶 化物 の 遠 心 上 清 よりlynまた はfynを 免疫沈 降し， 基質 として エ ノ ラ ー ゼ 5肛 gを 加 え ， 室 温 下 で 5分 間 in vitro kinnationを 行 っ た 。
3 1)
結 果
COS細 胞 に お け る キ メ ラPTKとIL―2Rロ の 物 理 的 会 合
lckと 同 様 にIL−2Rロ と たk7hck，lck/fynと の 特 異 的 な 共 沈が 認 め ら れ た。 こ れ に 対 しlck/insRの 共 沈 は認め られな かった 。
2） ユL―2及 びIL一3刺 激 に よ る チ 口 シ ン 残 基 リ ン 酸 化 の 亢 進
両 サ イ ト カ イ ン 刺 激 に よ り14B細 胞 に お い て ，主 と し て 分 子量85kDa，52kDaの 細 胞 内 蛋 白 に チ ロ シ ン 残 基 の り ン 酸 化 亢 進 が 認 め ら れ た 。
3）src−PTKs竺14B細 胞にお ける発 現
14B細胞 におい てp59J （′ ッ凡） ，p53/56′ （lyn)の 発現か 認めら れたが ，fcた の 発現 は認め られな かっ た。
4）IL一2及びIL一3刺激壁 圭壘fyn壁埜lyn堕塰壁 化
14B細胞 に お い て 両サ イ ト カ イ ンに よ る 刺激後 ，fyn，lynの活 性化が 認めら れた。 一方 ， BAFh130細 胞 に お い て もIL一3刺 激 に よ り 同 様 の活 性 化 が 認 め られ た が ，IL―6刺 激 では 認 めら れなか った。
5）14B細胞に おけ墨fyn圭IL―2Rロ との物 理的会 合
IL−2RBとfynと の 特 異 的 な 共 沈 が 認 め られ た の に 対 し，lynの 共沈 は 認 め ら れな か っ た。 共沈す るfynの割合 は全 発現量 のO．6一1．2％ であっ た。
4考 案 及 び 結語
1． src―PTK，hck，fynの 触 媒 部 位 も ぬ た と同 様 に 細 胞 内に お い てIL―2RBと物 理 的 に 会 合 し う る こ とが 示 唆 さ れ た。
2． 14B細 胞 に お いて ，ILー2及 びIL一3刺 激 に 共 役し て ，Zyn，fynの活 性 化 が お きる こ と，
そ の う ちfynはIL―2RBと 物理 的 に 会 合 し うる こ と が 示 唆さ れ た 。
以 上 の 結 果 よ りsrc―PTKsはIL―2シ グ ナ ル 伝 達 に お い て 重 複 し て関 与 し う る こと ，
並びにその関与は各血液系細胞に特異的に発言されるPTKに応じて，多様性をもっものである ことが示唆された。
以 上よ り ， 本 研究 は 博 士 （医 学 ） の 学位 論 文 と して 妥 当 な もの と 判断さ れる。
