博 士 （ 薬 学 ） 小 林 博 幸

博 士 （ 薬 学 ） 小 林 博 幸

学 位 論 文 題 名

紫 外 線 損 傷 DNA に 対 し て 強 い 結 合 活 性 を 有 す る 一 本 鎖 抗 体 の 分 子 認 識 機 構 に 関 す る 研 究

学 位 論 文 内 容 の 要 旨

  

序論

  

紫外 線の 照射 に より 形成 され る損 傷

DNA

が ， 生物 の生 存に 多く の 影響 を与えることは知 ら れている1．紫 外線により形成された光産 物は，修復タンパク質等により修復される2亅．紫外線 損 傷

DNA

と 親 和性 を持 っタ ンパ ク 質は ，こ れま で 数多 く報 告さ れて い るが

4i

， その 損傷

DNA

認識機構の詳 細は明らかにされていない．

  

生体 内に 形成 さ れた 紫外 線損 傷DNAを 検出 ・ 定量 する ため に， 数 種類 のモノク口ーナル 抗 体

(MAb)

が 樹 立さ れた

6.

． 筆者 は ，一 匹の マウ ス から 産生 され た数 種 類の

MAb

の抗 原認 識機 構 に 注 目 し た

8

． （

6

一

4

） 光 産 物 を特 異 的に 認識 する

3

種 類の

MAb

ー64M2，

64M3

お よび

64M5

− の可 変領 域の ア ミノ 酸配列は高 く保持されていた．しかしな がら，これらのmAbと（6−

4

） 光 産 物 の 相 互 作 用 の 解 析 に お い て ，

64M5

は

64M2

や

64M3

と 比 較し 強い 結合 活 性を 示す 結果 が得られた．

  

これらの（6．4）光産物特異的抗体の分子認識機構を調べるために，タンバク質工学的手法を用 い て抗 体の

VL

鎖 と

VH

鎖 をポ リベ プチ ド リン カー で接続した一 本鎖抗体（scFv）を構築し， 結 合に関与する アミノ酸残基の同定を行った ．さらにはニ本鎖DNA中に存 在する（6・4）光産物の 分子認 識機構の解析を行い，細胞内 への導入を目的としたscFvの構築を行ったので報告する ，

  (6‑4

】 光 産 物 ！ ≦ 疊 異 的 聖 二 杢 鎧 抗 佳

(64M5scFv)Q

撞 墓 と 量

Q

結 金 活 性 堕 鰹 蚯

9,10   64M5

の

Fv

領 域 の コ ン ピ ュ ー タ ー モ デ ル を 参 考 に ，

VL

鎖 とVH鎖 をべ プチ ドリ ンカ ー で連 結 した

scFv

を 構築 した ．ま た この 際に ，タ ンバク質の精製および 再生を簡便に行うために，

scFv

の

C

―末端側にヒスタグを連結 した．

  64M5scFv

の 抗原 結合活性を比較する ために，(6‑4)光産物を含む 鎖長の異なるオリゴヌクレ オ チド を 合成 した ．速度論的バラメー ターは，表面プラズモン共鳴 現象を利用したBIAcoreを 用 いて 算 出し た．

(6‑4)

光 産物 に対 す る64M5scFvの結合活性は，64M5Fabフラグメントのもの と同等 でり，scFv分子の抗原結合 領域の構造が，天然型抗体の ものと同一であることが示され た，scFvの結合ialtは，鎖長依存 的に増加した，各鎖長間で結合速度定数(kass)には差がなかっ たが， 解離速度定数(Aoiss)に著し い差が観察された．

  64M2

，

64M3

，64M5の アミ ノ 酸相 同性 は高 い にも 関わ らず ，そ の 抗原 結合 能は 大き く 異な る ，結 合 活性 に関 与す るア ミ ノ酸 を調 べる た めに ，64M3と

64M5

の キメ ラ型

scFv

，お よ び超 可変領 域のアミノ酸を置換した変 異体を構築し，その結合活性 を測定した．各キメラ抗体の結 合 速 度 測 定 の 結 果 ，

64M5

のVL鎖が

DNA

との 結 合に 大き く寄 与し て いる こと が明 らか と なっ た ．さ ら にVL‑Y30，VL‑T50特にVL―R90が，強い結合活性に寄与し ていることが明らかとなっ た．

64M5Q

表画 ！ニ 位 置士 墨リ

'Z

残 基 盤Q役 割II

64M5scFv

のコ ンピ ュー タ ーモ デル 解析 によ り ，VH鎖に 正荷 電 領域

(H62

，H64，H66，H68)

―611―

が存 在す るこ と が明らかとな った．このりジンクラスタ ーの抗原DNAとの結合に寄与 する彳叟 割を 解析 する た めに ，各 リジ ン 残基 をア ラニン残基に越 換した4種の変興体，および

4

つのり ジン残基をすべてアラニ ンに置換した変異体を構築 した．各変異体のkdissは，天然型のものと 比較して若干変化したの みであった．これに対して，kassには著しい減少が観察された．また，

イオン強度の影響を観察 したところ，kdissにはほど んど変化が観察されなかったのに対して，

高塩 濃度 条件 で のkassは低塩 濃度条件のものと比較する と約4倍低下した，すなわち ，両者が 結合する際には静電的な 相互作用が寄与しているこ とが示された．

  64M5scFvQ

三 杢 鎖

DNA

生 ！ ニ 盒 童 担 墨 （

6

〓

4)

光 産 物量

Q

恕 釦性 と量 堕 認識 捲撞 堕 盤盤

  64M5

は 一 本 鎖 お よ び ニ 本 鎖DNA中 に存 在す る(6‑4)光産 物と 結 合す る9．64M5は 損傷 を含 む 一 本 鎖

DNA

を 免 疫 す る こ と に よ り 得 ら れ た

MAb

で あ る ． そ の た め

64M5

の 二 本 鎖

DNA

中 に存 在するエピトープとの結合 様式には興味が持たれる．ま た，このscFvを細胞内で用 いるた め に は， ニ本 鎖DNAと の結 合を 明 らか にす ることが必要で ある．そこで(6‑4)光産物を 含む二 本 鎖 オリ ゴヌ クレ オチ ド を合 成し ，64M5scFvの速度論的 バラメーターを解析した．さ らに，

(6‑4)

光産 物の

3fIT

の相補鎖側 にGが位置するフラグメント ，および螢光物質である2． アミノ プ リ ン(2‑AP)が位 置す る フラ グメ ント を合 成し，それら に対する結合速度の解析を行 った，

  64M5scFv

と 二 本 鎖

DNA

の

Aass

は ， 相補 鎖側 にア デ ニン が位 置す る場 合 が最 も高 く，

2‑AP

やグ アニンの場合の約10倍であ った．この結果および融解温 度測定から得られた結果を 考察す る と ．64M5scFvはよ り不 安定 な二 本 鎖DNA中 に存 在す る(6‑4)光産 物と よ り速 く結 合す ると い う こと が示 され た， さ らに ，2ーAPが持 つ螢 光特 性 を利 用し ，scFvのニ本鎖中に含 まれる

(6‑4)

光産 物の 認 識機構を解析 した．二本鎖DNA中に存在す る(6‑4)光産物部分が局所的 に一本 鎖 と な り ，

64M5scFv

が そ の

(6‑4)

光 産物 部位 を特 異 的に 結合 して いる こ とが 示唆 され た．

  64M5scFv

堕DNA鎖 住長！ニ及！墨士影饗12

  

紫 外 線に より 引き 起こされる変異の 原因として，DNA複製過程に おけるミスマッチ塩基の取 り込 み が考 えら れて いる ． 紫外 線照 射に より 形成した(6‑4)光産物 部位におけるDNA複製を阻 害することができれ ば，このミスマッチ塩基対 の形成を阻止することが期待 できる，そこで，

DNA

複製時における

64M5scFv

の鎖伸長に及ぽす影 響を調べた，

  (6‑4)

光 産 物 を

1

箇 所 の み 含 む合 成

DNA

を 鋳 型と し， 大腸 菌Klenow fragmentとDNAポ リメ ラ ー ゼ

d

，

D

，

6

を 用 い て 鎖 伸 長 反 応 に お け る

64M5scFv

の 影響 を解 析し た ．DNA鎖に 対 して

1

等 量 の

scFv

が 存 在 す る 場 合 ，明 らか に鎖 伸 長反 応は 阻害 され た ．KF，pola，

poip

お よび

poi6

に よ る 鎖 伸 長 反 応 は ，

31

‐ ピ リ ミ ド ン の そ れ ぞ れ4，6，

8

，

8

塩 基手 前で 停止 し た．

  m vivoI

三堕彑る64M5scFvおよびランダ生変異 佳c活性

  

大 腸 菌

AB1886

は

DNA

修 復 因 子

UvrA

欠 損 株 で あ り ， 紫 外 線 感 受 性 が 高 い ． こ れ を

64M5scFv

の特定の超 可変領域にランダム変異を挿 入した遺伝子をコードする プラスミドで形質 転換すると，紫外線 に対して抵抗性を示すク口ーンが得られた．それらのプラスミドを抽出し，

scFv

のア ミ ノ酸 配列 を比 較 した とこ ろ， ある 類 似し た配 列を 持つ こ とが 明ら かと な った ．

  Riedoag, E C, WaIku, G C, & Siect, W. (1 995) LN4npainndr rucnesis., ASM ptess, Washingtone, EC  Smar,A 0 996) Ann. Rev. Biochem 65,43‑81.

 Todj,T., Krr¥ S. T., Hlorn, K, Qoshi, E, Wi, T., Monoka Fi, Kobayashi, H, ChLsLka F , Toh, H, & kenaga, M  (1 997) Ncleic AcickRes.25,764‑768.

  Bov¥rnm, K K, Sidk, K, Srnieh, C A,Taylor,J. S.,lbewh, P. W., & Fwyer.G A (1994) F,WeicAcid Res.'n, 3026‑3032.

  Kai, M ,Tcxb,T., WaA M , Ryo, H, MaSUmi, C, Kobayashi, H, Morioka, H, QitsLka, E,Hl伽 岨 F., &Sakaguhi, K (1 998)  Biodlirn Biophys.Aaa I 397, 1 80‑188.

  Mori,T., rxbkzne, M , lbuori,T., Mrsuraga, M , th ra  M , &Nk血 山， Q (1 99 1) Hlotcchern Fhotobiol. 54, 225 ‑232.

  M isLng¥ T., Htakeymra  Y., Oiu¥ M , Moii,T., & Nkaicb, Q (1993) Hlotcxhcrn Ftlotobiol. L7, 93‑1‑940.

  Muiioka  }'i, Miuu, H . Kobayzbhi, I‑i, Koizrrni,T., Rjii, K, Aszno, K, IVUtsuiatg:L T., NEkaicb, Q, Ste"m, J. D ,＆（11はk4 E (1998 )   Biodlun Biophys.ACtL I 385, 1 7‑32.

  Kobuyzstri, H, MoiioU H,TonzwL T., Kto, K, SliicndX L, Nkzucb, Q,＆Q1bLh F. (1 998)J  Bicxhct n  123,  182‑188.

   KobayAhi,H， IVhio      ,Tobis弧u K,Toiinuz¥ T., ICto, K, SliiindL L, Nkaicb, Q, Sce¥ut, J. D, & ClusLku, E (1999) Bicx:hmristry38,532‑'39.

‑ 612―

‑  

‑ i

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i …

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も

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‑   6 1 3   ‑

学位論文審査の要旨 主査

副査 副査 副査

教授 教授 助教授 助教授

大 塚 栄 子 有 賀 寛 芳 井 上 英 夫 松 本 健 一

学 位 論 文 題 名

紫 外 線 損 傷 DNA に 対 し て 強 い 結 合 活 性 を 有 す る 一本鎖抗体の分子認識機構 に関する研究

  

申 請 者 は

(6‑4)

光 産 物 を 特 異 的 に 認 識 す る

3

種 類 の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 一

64M2, 64M3

お よ び

64M5

― の 分 子 認 識 に つ い て 研 究 を 行 っ て き た が 、 一 本 鎖 抗 体 の 遺 伝 子 の 構 築 と 発 現 に よ っ て 以 下 の 結 果 を 得 た ．

（ ≦ ニ 虹 童 産 物 に 特 異 的 な ー 本 鎖 抗 体

(64M5scFv)

堕構 築 と その 結 合 活性 の 解 析

  64M5

の

Fv

領 域 の コ ン ピ ュ ー 夕 一 モ デ ル を 参 考 に ，

VL

鎖 と

VH

鎖 を ベ プ チ ド リ ン カ ー で 連 結し た

scFv

を 構築 し ，

scFv

の

C

一 末 端 側に ヒ ス タグ を 連 結し た ．

64M5scFv

の 抗 原 結 合 活 性 を 比 較 す る た め に ，

(6‑4)

光 産 物 を 含 む 鎖 長 の 異 な る オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を 合 成 し た ． 速 度 論 的 パ ラ メ ータ ー は ，表 面 プ ラズ モ ン 共 鳴 現 象 を 利 用 し た

BIAcore

を 用 い て 算 出 し た ． （

6

・

4

） 光 産 物 に 対 す る

64M5scFv

の 結 合 活 性 は ，

64M5Fab

フ ラ グ メ ン ト の も の と 同 等 で り ，

scFv

分 子 の 抗 原 結 合 領 域 の 構 造 が ， 天 然 型 抗 体 の も の と 同 一 で あ る こ と が 示 さ れ た ．

64M2

，

64M3

，

64M5

の ア ミ ノ 酸 相 同 性 は 高 い に も 関 わ ら ず ， そ の 抗 原 結 合 能 は 大 き く 異 な る ． 結 合 活 性 に 関 与 す る ア ミ ノ 酸 を 調 べ る た め に ，

64M3

と

64M5

の キ メ ラ 型

scFv

， お よ び 超 可 変 領 域 の ア ミ ノ 酸 を 置 換 し た 変 異 体 を 構 築 し ， そ の 結 合 活 性 を 測 定 し た ， 各 キ メ ラ 抗 体 の 結 合 速 度 測 定 の 結 果 ，

64M5

の

VL

鎖 が

DNA

と の 結 合 に 大 き く 寄 与 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た ，

  64M5

， 堕 表 面 に 位 置 す る り ジ ン 残 基 群 の 役 割

  64M5scFv

の コ ン ピ ュ 一 夕 ー モ デ ル 解 析 に よ り ，

VH

鎖 に 正 荷 電 領 域

(H62

，

H64

，

H66

，

H68)

が 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た ． こ の

1J

ジ ン ク ラ ス タ ー の 抗 原

DNA

と の 結 合 に 寄 与 す る 役 割 を 解 析 す る た め に ， 各 リ ジ ン 残 基 を ア ラ ニ ン 残 基 に 置 換 し た

4

種 の 変 異 体 ， お よ び

4

つ の り ジ ン 残 基 を す べ て ア ラ ニ ン に 置 換 し た 変 異 体 を 構 築 し た ． 各 変 異 体 の

kdiss

は ， 天 然 型 の も の と 比 較 し て若

干変 化し たのみであった．これに対して，kass には著しい減少が観察された．

また ，イ オン 強度 の影 響を 観察 した ところ，kdiss にはほどんど変化が観察さ れな かっ たの に対 して ，高 塩濃 度条 件で のkass は 低塩濃 度条 件の ものと比較 する と約 4 倍 低下 した ．すな わち ，抗 原との結合には静電的な相互作用が寄与 していることが示した，

  64M5scFv の ニ 本 鎖 DNA 中 に 含 ま 塾 墨 (6‑4) 童 産 物 との 親和 性とそ の認 識機 構の解析

  64M5 は 一 本 鎖 お よび 二本 鎖DNA 中に 存在 する （6 ・ 4 ） 光産 物と結 合す る．

(6‑4) 光 産物 を含 むニ 本鎖オ リゴ ヌク レオチドを合成し，64M5scFv の速度論的 バラ メー ターを解析した．さらに，(6‑4) 光産物の3 −T の相補鎖側にG が位置 する フラ グメ ント ，お よび 螢光 物質 である2 ‐アミノプ1J ン(2‑AP) が位置する フ ラ グ メ ン ト を 合 成 し ， そ れ ら に 対 す る 結 合 速 度 の 解 析 を 行 い 、    二 本 鎖 DNA 中 に 存 在 す る (6‑4) 光 産 物 部 分 が 局 所 的 に 一 本 鎖 と な り ， 64M5scFv が そ の (6‑4) 光 産物 部位 を特 異的 に結 合し てい るこ とを推 定し た，

64M5scFv 堕DNA 鎖鐘量！三聖ぼす影響

紫 外 線 に よ り 引 き 起 こ され る 変 異 の 原 因 と し て ， DNA 複 製 過 程 に お け る ミ スマッチ塩基の取り込みが考えられている，紫外線照射により形成した（6 一4 ） 光 産 物 部 位 に お け るDNA 複製 を阻 害す るこ とが でき れば ，こ のミス マッ チ塩 基 対 の 形 成 を 阻 止 す る こ と が 期 待 で き る ， そ こ で ， DNA 複 製 時 に お け る 64M5scFv の鎖伸長に及ぼす影響を調べた．

   （6 ー4 ）光産物を1 箇所のみ含む合成DNA を鋳型とし，大腸菌Klenow fragment と DNA ポ ル メ ラ ー ゼ a ， D ， 6 を 用 い て 鎖 伸 長 反 応 に おけ る 64M5scFv の 影 響 を 解 析 し た ． DNA 鎖 に 対 し て 1 等 量 の scFv が 存 在 す る場 合， 明らか に鎖 伸長 反応が阻害されることを示した．

   血wvo における64M5scFv 塑よびランダム変異体の活性

   大 腸 菌 AB1886 は DNA 修 復 因 子 UvrA 欠 損 株 で あ り ， 紫外 線 感 受 性 が 高 い ． これ を64M5scFv の 特定 の超 可変 領域 にラ ンダ ム変 異を挿 入し た遺 伝子をコー ドす るプ ラスミドで形質転換すると，紫外線に対して抵抗性を示すクローンが 得ら れた ．そ れら のプ ラス ミド を抽 出し ，scFv の アミノ 酸配 列を 比較したと ころ ，あ る類似した配列を持つことから紫外線抵抗性蛋白が発現していると推 定した。．

   以 上 の 業 績 は 、 博 士 （ 薬 学 ） を 授 与 す る に 値 す る も の と 判 断 し た 。