博 士 （ 理 学 ） 平 岡 秀 一
学 位 論 文 題 名
Expression of Neurohypophysial Hormone Genes in Pre‑Spawning Chum Salmon
（母川回帰時のシ口ザケにおける下垂体神経葉ホルモン遺伝子の発現）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
河川で孵化したサケの稚魚は川を下り、海洋で成長した後、産卵のため生まれた川に回帰す る。このようなサケの回遊行動は、回遊にともなう生理現象が遺伝子プログラムに従い時間軸 にそって順序正しく発現することによって可能となる。一方、その生理現象は神経系および内 分泌系の調節を受けている。視床下部神経内分泌系は神経系と内分泌系の機能を統合する中枢 であり、神経葉ホルモンをはじめとする多くの生理活性物質を産生している。神経葉ホルモン は、多くの動物の浸透圧調節に関わるペプチドであり、生殖活動にも重要であることが示され ている。硬骨魚類の神経葉ホルモンであるバソトシン(VT)およぴイソトシン(IT)も同様の働き を持つ。サケ科魚類ではVTが淡水適応に関わることが示唆されており、母川回帰におけるそ の役割に興味が持たれる。したがって、母川回帰時の神経葉ホルモン遺伝子の発現を解析する ことにより、ホルモンの生理的役割のみならず回遊の遺伝子プログラムに関する手がかりが得 られる可能性がある。
これらのことから、本研究では母川回帰時の神経葉ホルモン遺伝子の発現を解析した。解析 に先立ち、魚種によるホルモン遺伝子の塩基配列の相違度を知るために、サケ属魚類であるヒ メマスのIT‑I前駆体cDNAの塩基配列を解析した。次いで母川回帰時における脳内の蛋白質合 成活動の指標となるものとして、リボソーム蛋白S2に着目し、そのcDNAの塩基配列を解析 した。これらの知見を得た上で、母川回帰時のシロザケ脳内のVTおよぴIT遺伝子の発現の変 動を解析した。最後に、浸透圧刺激が母川回帰時のシロザケのVTおよびIT遺伝子の発現に及 ぼす影響を解析した。
第1章：ヒメマスのIT‑I前駆体cDNAの配列解析
ホルモン遺伝子の発現の解析は、ホルモンの生理作用を明らかにする上で非常に有用である。
しかし魚類では、同じホルモンをコードする遺伝子の塩基配列が種によって大きく異なる可能 性があるので、それそれの種で塩基配列を明らかにする必要がある。さらに、多くの魚類では、
進化の過程で染色体の重複が起きているため、発現の解析には注意が必要である。そこでまず、
ヒメマスのIT‑I前駆体cDNAの塩基配列を解析し、これまでに明らかとなっている配列と比較 した。さらにサケ属におけるゲノム中の神経葉ホルモン遺伝子の存在について解析した。
その結果、神経葉ホルモン遺伝子は、サケ属魚類の問で非常に相同性が高く、異なる魚種か ら得られたcDNAでも特異的なプロープとして使用できることが示された。また、調べたすぺ てのサケ属魚類のゲノム中には、VT‑I，VT‑II，IT‑IおよびIT‑IIの4種類の神経葉ホルモン遺
伝子が存在している ことが明らかとなった。
第 2章 ： ヒ メ マ ス の り ポ ソ ー ム 蛋 白 S2を コ ー ド す るcDNAの 塩 基 配 列 の 解 析 母 川回 帰時 の サケ では 内分泌系が大きく変化 しているため、神経分泌細 胞の蛋白合成活動が 変化 して いる 可 能性 があ る。そこで、細胞の蛋 白合成活動の指標となるも のとしてりボソーム 蛋 白S2に 着 目 し 、cDNAの 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 そ の 結 果 、 ヒ メ マ ス のS2 cDNAは933塩 基 で あ り 、 294ア ミ ノ 酸 残 基 の 蛋 白 を コ ー ド し て い る こ と が 示 さ れ た 。
第 3章 ： 母 川 回 帰 に と も な う シ ロ ザ ケ の 神 経 葉 ホ ル モ ン 遺 伝 子 の 発 現 の 変 動 母 川回 帰時 に 石狩 川の 河口 に近 い 定置 網お よび上流の千歳で捕 獲したシロザケを用いて、神 経 葉 ホ ル モ ンmRNAの 量 を 丿 ー ザ ン ブ ロ ッ ト に よ り 解 析 し た 。 定 量 的 な 解 析 を 行 う た め 、 mRNAと 相 同 な 配 列 を 持 つ1本 鎖DNAを 調 製 し 、 こ れ を 標 準物 質 とし て用 いる 系を 開 発し た。
調 製 し た1本 鎖DNAを 用 い た 検 量 線 は 、 セ ン スRNAを 用 い た も の と 一 致 し た 。 従 っ て、 この 1本 鎖 DNAは 、RNAの 定 量 の 標 準 物 質 と し て 使 用 可 能 で あ る こ と が 確 か め ら れ た 。 1993年 お よ び1994年 の2年 間 に わ た り 解 析 し た 結 果 、IT mRNA量 の 変 動 は 、 雌 雄 と も に 海 と 川 の 間 で 有 為 な 差 は み られ な かっ た。 一方VT mRNA量の 変 動は 雌雄 で大 きく 異 なっ てお り、雄では有為な差が無か ったのに対して、雌では有 意に約40％減少していた。こ のことから、
母川 回帰 時の 神 経葉 ホル モン 遺伝 子 の発 現の 調節は雌雄で異なる ことが示唆された。また、こ の時 のS2蛋白 の 遺伝 子発 現に 雌雄 差 は無 く、 川のサケでは発現量 がやや減少するが、有意差は 無い こ とが 示さ れた 。し た がっ て、 最終 成熟 段 階の 雌で はVT遺 伝子 の発 現を 積極 的 に抑 制す る機構が働いていることが 示唆された。
第4章 ： 母 川 回 帰 時 の シ ロ ザ ケ の 神 経 葉 ホ ル モ ン 遺 伝 子 発 現 に 対 す る 浸 透 圧 刺 激 の 影 響 母川 回 帰時 の岩 手県 三陸沖のサケを、外洋、 湾ロ、湾内およぴ川で捕獲 し、神経葉ホルモン 遺 伝 子の 発 現を 調ぺ たと こ ろ、 北海 道の シロ ザ ケと 同様 の雌 雄差 が みら れ、VT‑I mRNAが 湾 内 で捕 獲 した 雌で 有意 に減少していることが明 らかとなった。さらに、湾 口で捕獲したシロザ ケ を淡 水 およ ぴ海 水中 で飼 育 し、 神経 葉ホ ル モンmRNA量の 変動 を 解析し た。その結果、淡水 群 で は 、 雌 雄 と も に1日 目 でmRNA量 が減 少し 、2日目 以 降は ほぽ 一定 であ っ た。 一方 、海 水 群 の雄 で は飼 育日 数に ともなってmRNA量が増加 して．いたのに対し、雌で は減少していること が 明ら か とな った 。以 上の結果は、最終成熟段 階で神経葉ホルモン遺伝子 が、雌雄で異なる発 現 調節 を 受け てい るこ とを 示 すも ので ある 。 特に 雌に おけ るmRNA量の減 少は、自然状態およ ぴ 実験 群 の両 者で 観察 され た こと から 、回 遊 行動 の最 終段 階でVT遺伝子 の発現をおさえると い う遺 伝 子プ ログ ラム が働 い てい る可 能性 が 示唆 され た。
以上 に 述ぺ た一 連の 研究 により、母川回帰時のシロ ザケでは、神経葉ホルモン遺 伝子の発現 が 雌雄 で 異な る調 節を 受け ていることが明らかとなっ た。この結果は系統の異なる 二群間にお い て自 然 状態 で観 察さ れ、 さらに実験群においても再 現されたことから、回遊行動 の遺伝子プ ロ グラ ム によ って 普遍 的に 弓Iき起 こ され る現 象であ ることが示唆された。また、VTおよびIT 遺 伝子 の 上流 領域 には 、い くっかのステロイド応答配 列が見いだされていることか ら、この遺 伝 子プ ロ グラ ムに 対し てス テロイドホルモンが関わっ ている可能性がある。以上の ことから、
母 川回 帰 時の 神経 葉ホ ルモ ン遺伝子の発現調節は、遺 伝的にプログラムされており 、その調節 に ステ ロ イド ホル モン か関 与する可能性が示唆された 。さらにその遺伝子プログラ ムは、雌雄 で 異な る こと が示 され た。 ま た、 回遊 行動 の 最終 段階 でVT遺伝 子 発現 に著しい雌 雄差が見ら れ るこ と から 、こ の時 期の シ ロザ ケで はVTは 浸透 圧調 節と いう よ りむ しろ性行動 に関与して い る可 能 性が 示さ れた 。
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
Expression of Neurohypophysial Hormone Genes in Pre‑Spawning Chum Salmon
（母川回帰時のシロザケにおける下垂体神経葉ホルモン遺伝子の発現）
河川で孵化したサケの稚魚は川を下り、海洋で成長した後、産卵のため生まれた川に回帰する。こ のようなサケの回遊行動は、回遊にともなう生理現象が遺伝子プログラムに従い時間軸にそって順序 正しく発現することによって可能となる。一方、神経葉ホルモンは浸透圧調節および生殖に関わるホ ルモンで、魚類の神経葉ホルモンであるバソトシン(VT)およぴイソ卜シン(IT)も同様の働きを持つ。
したがって、母川回帰時の神経葉ホルモン遺伝子の発現を解析することにより、ホルモンの生理的役 割のみならず回遊の遺伝子プログラムに関する手がかりが得られる可能性がある。これらのことから 本論文の著者は母川回帰時の神経葉ホルモン遺伝子の発現を解析し、以下のことを明らかにした。
1）母川回帰時に石狩湾およぴ千歳川で捕獲したシロザケを用いて、神経葉ホルモンmRNAの量をノ ーザンブロットにより定量的に解析した。1993年および1994年の2年間にわたり解析した結果、IT mRNA量の変動は、雌雄ともに海と川の間で有為な差はみられなかった。一方VT mRNA量の変動は雌雄 で大きく異なっており、雄では有為な差が無かったのに対して、雌では有意に約40%1少していた。
このことから、母川回帰時の神経葉ホルモン遺伝子の発現の調節は雌雄で異なることが示唆された。
また、この時のS2蛋白の遺伝子発現に雌雄差は無く、川のサケでは発現量がやや減少するが、有意差 は無いことが示された。したがって、最終成熟段階の雌ではVT遺伝子の発現を積極的に抑制する機構 が働いていることが示唆された。
2）母川回帰時の岩手県三陸沖のサケを、外洋、湾口、湾内およぴ川で捕獲し、神経葉ホルモン遺 伝子の発現を調べたところ、北海道のシロザケと同様の雌雄差がみられた。さらに、湾口で捕獲した シロザケを淡水および海水中で飼育し、神経葉ホルモンmRNA量の変動を解析したところ、雌雄で異な る変動パターンを示した。これらの結果は、最終成熟段階で神経葉ホルモン遺伝子が、雌雄で異なる 発現調節を受けていることを示すものである。特に雌におけるmRNA量の減少は、自然状態およぴ実験 群の両者で観察されたことから、回遊行動の最終段階でVT遺伝子の発現をおさえるという遺伝子プロ グラムが働いている可能性が考えられる。
著者は、以上に述べたように、母川回帰時のシロザケでは、神経葉ホルモン遺伝子の発現が雌雄で
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央 郎
一 文
行
明 達
雅 好
孝
野 池
畑 田
橋
浦
小
高
米
高
授
授
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教
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教
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査
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査
査
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主
副
副
副
副
異なる調節を受けていることを明らかにし、回遊の遺伝子プログラムに雌雄差があることを初めて示 した。しかも、それが系統の異なる二群間において自然状態で観察され、さらに実験群においても再 現されたことから、回遊行動の遺伝子プログラムによって普遍的に引き起こされる現象であることを 示唆している。これらの先端的な成果は、サケの母川回帰だけでなく、本能行動を分子レベルで理解 するために大きく貢献するものである。
よ って、著者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与さ れる資格を有するものと認める。
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