原 著 〔東女医大誌 第63巻 第10号頁1269∼1275平成5年10月〕
小児白血病におけるCD45分子の発現様式とその臨床的意i義
東京女子医科大学 小児科学教室（主任：福山幸夫教授） スギ タ キ ヨ コ杉 田 記 代 子
（受付平成5年6月28日） Expression Pattern of CD45 Molecule on Childhood Leukemia and its Chnical Signi五cance Kiyoko SUGITA Department of Ped量atrics（Director：Prof． Yukio FUKUYAMA） Tokyo Women’s Medical College The expression pattern of CD45， a receptor type protein tyros量ne phosphatase on hematopoietic cells， in childhood leukemia was studied． This study revealed 1）Childhood leukemias（115 cases）were divided intQ two groups；aCD45＋group（CD45≧61％，69 cases）and a CD45＋みgroup（CD45≦40％，46 cases）．2）The majority of CD45＋／一cases was classified as CD10＋precursor B−acute lymphoblastic leukemia（ALL＞．3）Among CD10＋precursor B・ALLs， cases with CD45＋匹had a significantly lower age Gf onset（p＜0．01）， lower leukocyte count（p＜0．01）and lower serum LDH level（p＜0．05）as compared with CD45＋c3ses。 Although statistically not significant， CD45＋／一cases tended to have more favaroble outcomes than CD45＋cases when event−free survival rates were compared． These results indicate that the decreased expression of CD45 is characterist玉。 of CD10＋precursor B・A肌and the measurement of CD45 expression can be used as a new prognostic factor for childhood acute leukemias． 緒 言 細胞膜表面分子の発現様式による白血病細胞の 分類が，治療方針決定に役立っていることは周知 の事実である．歴史的には，CD10分子による予後 良好なcommon acute lymphoblastic leukemia（ALL）の概念の確立あるいはTリンパ球マー
カーの存在による予後不良群の同定など，マーカー解析は予後予測因子として役立ってき
た1）2）．このような従来のマーカー分類は，細胞系 統あるいは分化段階に特異性が高いマーカー発現 による分類法であり，分子が有する機能とは分離 されて論じられてきた．しかし，分子生物学的研 究の進歩が個々の分子の機能を明らかにしている 現状を考えると，分子の機能に着目した病態の解 析とそれらを考慮に入れた分類法が今後重要にな ると想定される． CD45分子は，従来， leukocyte common antigen （LCA）として白血球に普遍的に存在する分子と して知られてきた3）．診断マーカーとしては血液 腫瘍と非血液腫瘍の鑑別に主として病理診断の分 野で応用されている．しかし，最：近，CD45が受容 体型チロシン脱リン酸化酵素であることが判明し たことにより4），その機能が急速に解明されつつある、T細胞抗原受容体の情報伝達経路での
CD45分目の抑制因子としての作用，細胞内チロシ ンリン酸化酵素Lckの脱リソ酸化，造血前駆細胞 の分化に対する作用など，血液細胞の分化・増殖・ 活性化にCD45分子は重要な働きをすることが明 らかとな：っている5）∼10）． 本研究ではこのような背景を考慮に入れ，小児白一血病におけるCD45の発現を検討した．その結 果，CD45発現が多数の症例で減弱あるいは陰性化 し，マーカーによる分類と関連するとともに，臨 床的予後因子とも関連することが明らかとなっ た． 対象および方法 1．対象症例 1985年6月より1992年9月までに国立小児病院 小児医療研究センター病理研究室に集積された15 歳以下の小児白血病のうち，CD45が検索された 115例につき検討を行った．これらの症例のうち， CD10陽性例57例については，主治医の協力を得て 患者の情報を集積するとともに生存率の検討も 行った．なお，この57例のうち55例は東京小児白 血病グループのALL治療プロ、トコール11）12）に従 い治療が行われている． 2．白血病細胞の形態学的・細胞化学的検討
白血病の細胞学的診断は，骨髄塗抹標本で
May−Giemsa染色， peroxidase染色， PAS染色を 行い，French・American−British（FAB）分類13）14） に基づいて行った。 3．モノクローナル抗体による免疫染色とフ ローサイトメーター解析 骨髄穿刺液または末梢血よりFicoll−Conray比 重遠心法で分離した細胞を得，下記のモノクロー ナル抗体を用いて間接蛍光抗体法を施行した．二次抗体はFITC標識家兎抗マウス抗体（DAKO
社）を使用した．フローサイトメーターにて細胞 を描出し，腫瘍細胞が豊富に含まれる細胞分画に つき抗体陽性率を算出した．細胞表面分子の検出 に用いたモノクローナル抗体は，CD1， CD2， CD3， CD4， CD5， CD7， CD8， CD10， CDllb， CD13， CD14， CD19， CD20， CD22， CD24， CD33， CD34，CD41b，抗HLA・DR，抗immunoglobulin M
（lgM）およびCD45である． CD45はDAKO社製 抗LCA抗体（クローン2B11＋PD7／26）を用いた． CD45以外は陰性コントロールに対して20％以上 の場合を陽性とした．下記の基準に示すprecur− sor B−ALL症例におけるCD45の陽性率は，混在 する正常T，Bリンパ球を除くために｛％CD45一 （％CD3十％surface IgM）｝／｛100一（％CD3十％ surface IgM）｝×100％の計算式により修正した． なお，一部の症例ではterminal deoxynucleotldyl transferase（TdT）もメタノール固定細胞を用い て検索した． 4．細胞表面マーカーによる分類 細胞表面マーカー発現による症例の病型分類を 以下のごとくに行った．すなわち，B細胞系白血 病（CD19＋and／or CD22＋），非B細胞系白血病に大別し，後者をさらにTリンパ芽球性白血病
（T−ALL， CD3＋and CD7＋）および非リソバ性白 血病（acute non−lymphoid leukemia；ANLL， CD3一， CD19一， CD22一， CD10一， CD13＋or CD33＋） に分類した．B細胞系白血病はB−ALL（surface IgM＋， TdTつとprecursor B−ALL（sIgM一， TdT＋）に分類した． 5．統計学的解析 CD45発現様式と病態の相関は， Fisherの直接 確率計算法あるいはPearsonκ2検定で行った．ま た，無病生存率曲線はKaplan−Meier法15）により 作製し，その有意差検定は一般化Wilcoxon法に より行った． 結 果 1．症例の分類 CD45の発現を検討した小児白血病はのべ115例 であった．それらの内訳を表1に示した．すなわ ち，初発例，再発例はそれぞれ87例および28例で あった．細胞マーカーによる分類では，B細胞系 白血病が89例（初発66例，再発23例）であった．B細胞系白血病のうちB−ALLは2例のみで，87
例はprecursor B−ALLと診断された． precursor B−ALLのほとんど（85例）はCD10が陽性であっ た．なお，再発例のうち2例は初発例と重複して いる．非B細胞系白血病は26例（初発21例，再発 5例）で，その内訳は，T−ALLが13例， ANLLが 表1 症例の内訳 B細胞系白血病 非B細胞系白血病 計 新鮮例 66 21 87 再発例 23 5 28 計 89 26卓 115 象T−ALL：13例， ANLL：12例， CML・BC：1例．30 25 20 15 10 5 0
18
16
り 症 12 例 10 ち 数 6 4 2 012
A 12 10 8 6 4 症 2 例 0 B 数 6 4 2 1G 8 6 4 2 0 C む 叩等零母母＄罵零零＄串＄＄9母串＄串母♀ oo＝9轟858妄写5謬お8ζ綻お858 CD45陽性率（％） 図1 小児白血病におけるCD45発現 フローサイトメーターにて解析した小児白血病細胞に おける細胞表面CD45発現様式を示す。（A）全症例115 例，（B）B細胞系白血病89例，（C）非B細胞系白血病 26例．症例の分布がA，Bでは明らかに2峰性となっ ている．横軸：CD45陽性率，縦軸：症例数． 12例，慢性骨髄性白血病急性転化（CML−BC）が 1例であった． 2．CD45発現様式 上記115例をCD45陽性率で分類し，図1Aに示 した．図1Aから明らかなごとく，症例の分布は2 峰性とな：つた．すなわち，CD45陽性率が61％以上 となる群（CD45陽性群，69例）と陽性率が40％以 下となる群（CD45減弱群，46例）に明瞭に分離さ れていることが判明し，陽性率が41％以上，60％ 未満となる症例はなかった．特に，15例（13％） 0 ρ♀窄串串＄＄号等＄串＄串母埠串＄串琴9 む の リ ヒ ゆ ほ ゆ ヒ リ ド ロ リ ロ ロ ド リ ゼ 7FC噂∼oρつ寸曽り切oo卜卜ooo◎①8 CD45陽性率（％） 図2 小児B細胞系白血病におけるCD45発現 初発例（A）および再発例（B）におけるCD45発現様 式を示す．A， Bとも分布には差がない．横軸：CD45 陽性率，縦軸：症例数． ではCD45陽性率が10％以下であり，ほぼ完全に 陰性と判断された．各種マーカーによりB細胞系 と非B細胞系白血病に分類した後，同様にCD45 発現様式を検討した結果（図1B， C）， CD45減弱 群のほとんど（43例，93％）はB細胞系白血病で あることが判明した（図1B）．一方，非B細胞系 白血病ではCD45減弱群は3例（T・ALL 2例， ANLL 1例）のみであった． B細胞系白血病を初 発例（66例）と再発例（23例）に分類し同様にCD45 発現様式を比較したが，有意な差は見られなかっ た（図2A， B）． 3．precursor B・AUにおけるCI）45発現と病 態との関連 CD45の発現減弱はB細胞系白血病に見られる 特徴的な所見であることが判明したことより，B 細胞系白血病でのCD45発現と各種病態との関連 を検討した．B細胞系白血病の大部分はCD10陽 性のprecursor BALLであったため，これらの症 例を選択して解析した．CD10陽性のprecursor10 8 6 4 2 0 0−2 3−4 5−6 7−8 9り10 11一匪2 13−14 14・15 年 齢（歳） 表2 CD45発現と病態との関連 16 14 12 症 10 例 8 6 数 4 2 0 B ≦1 ≦2 ≦3 ≦4 醒≦5 ≦6 ≦7 ≦8 ≦9 ≦10 10く 白血球数（x10，000ノμr） CD45減弱群 CD45陽性群 年齢（歳） ＜1 0 2例 1≦，〈10 26 16 10≦ 3 10 p＜0，01 性 男 16 15 女 13 13 N．S， WBC（×1，000／μ1） 〈10 16 4 10≦，＜25 4 7 25≦ 9 17 p＜0．01 LDH（U／L） ＜1，000 20 12 1，000≦ 9 16 p〈0．05 14 12 で0 8 6 4 2 0 く500 く1，000 く2，000 く3，000 ＜41000 く51000 5，000≦ 血清LDH（U／し） 図3 CD10陽性precursor B−ALL 57例における CD45発現と病態 CD45減弱群（■）およびCD45陽性群（物の年齢 分布（A），白血球数（B）および血清LDH値（C） を示す． 100 生 存 率50 勇 0 1 “ ㌦．一一 L一_ 」㍉ 一「一，． CD45弱陽性群（N二29） ロロロコロ … しコヒコココ コロロリリロロ CD45陽性群（N＝28） 図4 線 CD45減弱群がCD45陽性群に比べ良好な生存率を ‘示す．横軸：生存率，縦軸：初発診断時からの生存 期間． 1 2 3 4 5 6 7 診断時からの生存期間（年） 白血病細胞のCD45陽性率による無病生存率曲
B・ALL初発57例のCD45発現様式は図2Aと同
様，CD45減弱群（29例）とCD45陽性群（28例） に分類された．図3にCD45発現により分類した 2群と，年齢，白血球数および血清LDH値の関係 を示した．分布の様式によりCD45減弱群は年齢 分布が低い，白血球数が少ない，あるいは血清 LDH値が低いなどの特徴が想定された．そこで 統計学的検定を行なった結＝果，CD45減弱群は有意 に発症年齢が低い（p＜0．01），白血球数が少ない （p＜0．01），血清LDH値が低い（p＜0．05）などの 特徴を持つことが判明した（表2）．一方，性別， 初発時のヘモグロビン値，血小板数，骨髄細胞数 あるいは髄外浸潤の有無とは有意な関連は見られ なかった． 上記57例につき治療成績を無病生存率（平均観 察期間は35ヵ月）で検討したところ，統計的には 有意な差ではなかったが，CD45減弱群はCD45陽 性群に比べて予後良好な傾向が見られ，3年無病 生存率はCD45減弱群で65．3％， CD45陽性群は42．4％であった（図4）． 考 察 CD45の小児白血病における発現様式を検討し た結果，40％（46例）の症例に発現の減弱を認め， 15例（13％）ではCD45が10％以下でほぼ完全に陰 性化していると判断された．CD45の発現様式によ り，患者はCD45陽性群（陽性率61％以上）とCD45 減弱群（陽性率40％以下）の2群に明瞭に分類さ れ，中間値を示す例はないのが特徴であった．ま た，CD45の減弱，陰性化を示した症例はほとんど‘
がCD10陽性のprecursor B−ALLであった．
Behmら16）も小児リンパ性白血病におけるCD45 発現を解析し，同様にprecursor B−ALLにCD45 発現低下を認めている． 以上の結果より，CD45発現の減弱，陰性化は小 児白血病で最も高い病型に特徴的であると結論さ れる．common ALLを含むprecursor B・ALLの 治療成績は近年著しく向上している17）∼19）．これ は，複数の予後因子に基づいた治療法が統一的に 行われるようになったことが大きく寄与してい る． 今回，CD10陽性precursor B−ALLのCD45発 現と臨床病態を検討した結果，CD45陽性率が臨床 的予後因子として重要視されている年齢，白血球 数20），および卑清LDH値21）と相関を示したこと は注目に値する．すなわち，CD45減弱群の患者は CD45陽性群に比べ有意に低年齢層であり，初診時 白血球数および血清LDH値が低値であるなど， 予後良好群に分類された．予後調査における無病 生存率の比較では，両刃の問に統計的な有意な差 は見られなかった．しかし，CD45減弱群の3年無 病生存率はCD45陽性群よりも高値であることよ り，症例数を積み上げてさらに解析する必要性を 示していると考えられる．Behmら16）も同様の結 果を報告していることも考慮に入れると，CD45の 発現率が治療反応性を含めた病態と密接に関連し ていることは明らかである． CD45は細胞膜貫通型の蛋白質分子であるが，そ の細胞質ドメインにリン酸化チロシン脱リン酸化 酵素（protein tyrosine phosphatase；PTPase） 活性が存在することが判明し一躍注目を浴びるよ うになった4）．蛋白質チロシン残基のリン酸化状 態が細胞の腫瘍性増殖に深く関連することは，がん遺伝子，特にチロシンキナーゼ（protein
tyrosine kinase；PTK）型のがん遺伝子の研究で 明らかにされている22）。チロシン残基のリン酸化状態はPTKとPTPaseの相互作用で調節されて
いることから6）9）23），PTPaseの役割が注目される所以である．PTPaseとしてのCD45の機能解析
が現在精力的に行われているが，その中でCD45がPTKのひとつであるLck分子の脱リン酸化
に関連するとの報告6）7）が注目される．Lck分子は 主にTリンパ球に発現するPTKであり， CD4あるいはCD8分子と細胞質内で結合しT細胞抗原
受容体を介した刺激伝達系に位置していると考え られている24）25）．CD45欠損T細胞株およびCD45 発現を回復させた株での解析から，CD45はLck 分子のPTK活性制御部位のTyr505を脱リン酸化することによりLckのPTK活性を高めている
ことが明らかにされた7）．すなわち，CD45がPTK のリン酸化状態を制御することにより情報伝達系 に関与することを示唆している． 一方，正常の血液細胞分化においては，CD45は CD34陽性の最も未分化な細胞ですでに発現して おり，血球の分化に伴い発現が増強することが知 られている26）．Bリンパ球分化過程でもそれは同 様であり，CD10陽性の骨髄B前駆細胞は全ての 細胞でCD45は発現している27）．これらの報告か ら考えると，precursor B−ALLでのCD45発現減 弱および消失は，正常血球分化からは逸脱した現 象であると考えられる． 白血病細胞においてCD45の発現量変化がどの ような機序で生じるかは不明である．しかし，細 胞表面でのCD45の量的変化が実際に病態と関連 していることから，量的変化によるPTPase活性 量の変化が蛋白質のリソ酸化状態に影響を与え， 結果として細胞の腫瘍性性格を修飾している可能 性は十分に予想される．CD45の量的変化が実際に 生じている患者細胞における蛋白質リン酸化パ ターンの変化およびPTKの活性の変化を解析す ることが，CD45の病態形成における役割を解明す るうえで重要な意義を持つと考えられる．結 語 本研究では，機i能が解明されつつあるCD45の 発現により小児白血病の分類を試み，その発現様 式が臨床的予後因子および治療反応性と関連する 結果を得た．細胞系統あるいは分化段階による従 来のマーカー分類法は白血病の治療成．績向上に．大 きく貢．恥しておりD2）28），今後も重要な診断技術で あろう．しかし，本研究で明らかになったような 機能分子の発現による新しい分類法の開発が，治 療成績をざらに向上させるために重要になると考 えられる． 稿．を終えるにあたり，御指導，御校閲いただきまし た恩師福山幸夫教授に深謝いたします． また本研究を直接御漏導くだ．さいました国．立小児 病院小児医療研究センター病理研．究室藤本純一郎部 長，小海康夫室長，ならび：に小児血液腫瘍学を御指導 下さいまし．ｽ国立小児病院血液科田口信行医長に深 謝いたします． 資料提供に御協力頂いた諸．施設の先生方に厚く御 礼申し上げます． なお，本研究の要旨は第82回．日本病理学会総会 （1993年4月，東京）において発表した． 文 献 1）Pui C・H， Williams DL， Raimo蹴di SC et al： Uロfavorble presenting clinical and laboratory features are associated with CALL・negative non−T， non−B lymphoblastic leukeπlia in chil・ dren， Leuk Res 10：1287−1292，＝1986 2）Crist WM， Furman W， Strother D et al： Acute lymphocytic leukemia in childho．od：Im・． munologic marker， cytogenetic， and Inolecular studies， South Med J 80：841−847，1987 3）Tomas．ML：The leukocyte common antigen family． Ann Rev Immuno17：339−369，1989 4）Tonks NK， Charbonneau H， Diltz CD et al： Demonstration that the leukocyte common antigen CD45 is 3 protein tyrosine phosphatase． Biochemistry 27：8696−8701，1988 5）Stamenkovic l， Sgmi D， Aruffo A et al：The Blymphocyte adhesion molecule． CD22 inter・． acts with leukocyte common antigen CD45RO on T cells andα2−6 sialyltransferase， CD75，0n Bcells． Cell 66：1133−1144，1991 6）Ostergaard HI、，．Shackelford DA， Hurley TR et a1： Expression of CD45 alters phosphoryla・ tion of the lck−encoded tyrosine protein kinas6 in murine lymphoma T・cell lines． Proc Natl Acad．Sci USA 86．：8959−8963，1989 7）Sieh M，． Bolen J8， Weiss A：CD45 speci丘Oally modulates binding of Lck to a phosphopeptide encompassing the negative regulatory tyrosine of Lck。 EMBO J 12： 315−321， 1993 8）Broxmeyer HE， Lu L， Hangoc G et al：CD45 cell surface． antigens are linked to stimulation of early．humanπ1yeloid progenitor cells by interleukin 3（IL3）， granulocyte／macrophage colony−stimulating factor（GM−CSF）， a GM・ CSF／IL3 fusion proteln， and mast cell growth factor（a．6・航1igand）． J Exp Med 174．： 447−458， 1991 9．）Koretzky GA， Picus．」， Schultz T et al： Tyrosine phosphatase CD45 required for T・cell antigen receptor and CD2一．mediated activation of a protein tyrQsine kinase and interleuki耳2 production． Proc Natl Acad Sci USA 88： 2037−2041， 1991 10）Justement H3， Campbell KS， Chien NC et al＝ Regulation of B cell antigen receptor signal transduction and phosphorylation by CD45． Science 250：1839−1842， 1991 ．11）西村昴三：Tokyo Children，s leukemia study groロp（TCLSG）第11次研究プロト．コ．一ル実施要 網．pp1−28，1984 12）西村昴三：Tokyo childrea’s cancer study group （TCCSG）L89・12 Protoco豊for ALL． ppレ30， 1989 13）Bennet JM， Catovsky．D， Da皿iel MT et． a1： Proposals for the classification of acute leu・ kemias． French−American・British （FAB）co− operative group． Br J Haem．atol 33：451−458， 1976 14）Bennet JM， Catovsky D， Dalliel MT et al’： The morphological classi且cation．of acute lymphoblastic leukemia． Br J Haematol 47： 553−561， 1981 15）．Kaplan EM， Meier P＝Nonparametric estimation from incomplete observation． J Am Stat Assoc 53：457，1958 16）B曲mFG， Raimondi SC， Schell MJ et al： Lack of CD45 antigen on blast cells in child・ hood acute lymphoblastic leukemia is associat− ed with chromosomal hyperdiploidy and other favorable prognostic features。 Blqbd 79： 1011−10．16， 1992 17）B監eyer WA：Acute lylnphoblastic leμkemia in children． Advances and prospectus． Cancer
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